实验八 动物实验技术
实验动物常用作病原微生物的分离和鉴定，进行动物接种实验应选择易感性高、健康的动物。常用的动物有小鼠、豚鼠和家兔。根据实验要求可通过皮下、皮内、肌肉、腹腔、静脉等途径注射。感染动物死亡后，必要时进行尸体解剖并作病原体的检查。
一、实验动物接种法
（一)小白鼠接种法
【材料】
1．小白鼠。
2．无菌注射器(1ml)及针头。
3．碘酒、75%酒精、接种物。
【方法】
1．皮下注射法：一般注射于腹部。
(1) 用注射器吸取接种物。
(2) 小白鼠固定法：用右手拇指和食指捏住小鼠尾部，使它在桌上向前爬行，轻轻向后拉鼠尾(图8-1)，再用左手食指及拇指捉住其两耳及颈部皮肤，将手反转，使小白鼠腹部向上，把小白鼠尾巴和左腿夹于左手小指和手掌之间(图8-2)。
(3) 用碘酒及酒精消毒腹部皮肤，针头稍平刺入皮下，注入接种物0.2～0.3ml，如局部有隆起表示已注入，注射后局部再次消毒(图8-3)。
2．腹腔注射法：常注射于下腹部白线稍左或稍右部位，固定方法同上。注射时先将针头平刺于皮下，然后稍抬起针头刺人腹腔中，注射接种物0.5ml(图8-4)。
3、肌肉注射法：多注射于肌肉发达，无大血管经过的部位，如后腿肌肉，将针头直刺入肌肉深层，注射量不超过0.2ml。
4．脑内注射法：将标本接种幼龄鼠(体重l0g左右)脑内(从眼内眦与鼻根部之间刺入)，用左手拇指食指固定头部，注射量不超过0.1ml。
图8-1 小鼠抓持方法图8-2 小鼠徒手固定方法
图8-3 小鼠皮下注射示意图图8-4 小鼠腹腔注射示意图
（二)家兔接种法
【材料】
1．家兔。
2．无菌注射器和针头。
3．碘酒、75%酒精、接种物。
【方法】
1．皮内注射法：皮内注射多为观察皮肤反应，所以注射前应将局部毛剪去。常注射在背部。注射局部消毒后，将针头的针孔向上平刺皮层内，注射物推入后，如局部隆起，其上毛孔明显，即表示注入。注射量不超过0.1ml。
2．静脉注射法：多采用外耳缘静脉注射(图8-5)。
(1) 将家兔放入固定盒固定好，拔去注射部位的毛，局部消毒，手指轻弹兔耳使血管扩张。
(2) 针头经皮肤平刺入血管中，回一下血，缓慢注入接种物。
(3) 注射后局部消毒，并用消毒棉球轻压片刻，以免血液流出。
图8-5 兔耳缘静脉注射
二、执业兽医接种后动物管理
实验动物接种后，应仔细管理，以免引起实验室内污染或造成实验中的误差，影响实验结果。
1．隔离：动物经注射感染材料后，应与健康动物分开饲养，并在饲养笼上贴标签，注明接种材料、剂量、日期、途径和接种者姓名，以免混淆。
2．观察：注射后每日观察1～2次，注射动物有无异常。
3．测体重、体温，需要时须每日测体温。一般动物体温较人高，现将常用动物正常体温列于下供参考(肛门测定)。
家兔 38.3～40.8℃
豚鼠 38.6～39.4℃
小白鼠 32.4～38℃
4．动物死亡后，应立即进行尸体解剖。不需解剖者，则焚烧或用消毒液浸包后深埋。
三、细菌致病作用的测定
细菌的致病力包括侵袭力和毒素。前者是指依靠酶的作用或形成荚膜侵袭机体组织的能力，细菌所产生的酶有血浆凝固酶、链激酶、透明质酸酶等。后者有内、外毒素2种。
（一)血浆凝固酶试验(见实验九)
（二)透明质酸酶试验
【原理】
透明质酸是葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖聚合物，是结缔组织基质成分。乙型溶血性链球菌等产生的透明质酸酶可水解透明质酸，使结缔组织疏松，通透性增高，使细菌和毒性物质易于扩散，故此酶亦称扩散因子。
【材料】
1．乙型溶血性链球菌肉汤培养滤液(含透明质酸酶)、1%美蓝液(或黑墨汁)、生理盐水。www.lindalemus.com
2．小试管、lml注射器、6号针头等。
3．家兔。
【方法】
1．将家兔背部两侧毛剪除干净，75%酒精消毒注射部位。
2．将细菌培养滤液与少许1%美蓝液混合，注射0.2ml于家兔一侧皮内，为实验侧。生理盐水与少许美蓝混合，同法注入家兔另一侧皮内，为对照侧。注射时避免液体漏出，以免皮肤着色，影响结果的观察。
3．2h后，比较两侧美蓝在皮下的扩散范围。
【结果】
家兔试验侧皮下深蓝色扩散区明显大于对照侧，说明了透明质酸酶的作用。
（三)链激酶试验
【原理】
链激酶，又称溶纤维蛋白酶，能水解血浆纤维蛋白，使凝固的血块溶解，出现液化现象。乙型溶血性链球菌及某些金黄色葡萄球菌株可产生此酶，有助于细菌及毒性产物在感染病灶内扩散。
【材料】
1．乙型溶血性链球菌肉汤培养物(含链激酶)、四联球菌肉汤培养物、生理盐水、枸橼酸盐抗凝血、5%氯化钙液。
2．小试管、1ml注射器、37℃水浴箱等。
【方法】
1．取带棉塞小试管3支编号①、②、③，各加入抗凝血1ml。
2．于第①、②、③管内分别加乙型溶血性链球菌培养物、四联球菌培养物、生理盐水各0.5m1。
3．上述3支试管每管加入5%氯化钙0.2ml，摇匀，置37℃水浴10min，待血液凝固，再继续37℃水浴约30min，观察结果。
【结果】
l．观察时，可将小试管慢慢倾斜至30°，轻轻摇动。凡凝固血块又发生溶解，出现液体者，为链激酶试验阳性，否则为阴性。
2．本试验①管为阳性，②管为阴性，③管为阴性对照，无液体出现。
（四)荚膜的致病作用
【材料】
1．菌种：Ⅲ型肺炎链球菌。
2．小白鼠。
3．无菌lml注射器和针头。
4．荚膜染色液。
【方法】
1．取20g左右重的健康小白鼠1只，腹腔或皮下注射肺炎链球菌菌液0.5m1，饲养观察
2．待濒临死亡时，及时解剖，取血接种血平板，作细菌培养。
3．取其腹腔液涂片，作荚膜染色镜检。
【结果】
1．有毒力的肺炎链球菌，能使小白鼠在12～36h濒临死亡。
2．血培养可获肺炎链球菌纯培养物。
3．有毒力的肺炎链球菌，荚膜染色镜检，可见有明显的荚膜。
四、外毒素的致病作用
【材料】
1．小白鼠。
3．无菌lml注射器和针头。
【方法】
将破伤风梭菌接种庖肉培养基，37℃培养48h，吸取上清液，3000r/min离心30min，弃去沉渣。临用时作1∶100稀释。
1．试验组：取小白鼠1只，于一侧后腿肌肉注射破伤风梭菌滤液0.2～1.0ml。
2．对照组：取1只小白鼠，于一侧肌肉注射破伤风抗毒素l00u，30min后，于另一侧肌肉注射0.2～1.0ml破伤风杆菌培养滤液。
【结果】
逐日观察，实验组小白鼠的后腿及尾巴强直性痉挛，继而延及全身，动物全身痉挛，2d内死亡。此为毒力试验阳性。对照组小白鼠仍健康存活。
五、内毒素的致病作用
【材料】
1．脑膜炎奈瑟菌内毒素。
2．小白鼠。
3．无菌1ml注射器和针头。
【方法】
1．取脑膜炎奈瑟菌18～24h培养菌液，60℃加热5～10min，杀死细菌，成为粗制的内毒素。
2．取20g左右重的健康小白鼠1只，将其固定，暴露尾巴，用酒精反复擦拭，使尾部血管充血。
3．取上述处理的菌液1ml，注入小白鼠尾静脉。
4．约5h后，用颈椎脱位法杀死小白鼠，解剖观察。
【结果】
可见皮下弥散性紫瘢，肝脏淤血水肿，肾脏及肾上腺充血，肠系膜及腹壁血管明显充血。
