医学微生物学-授课讲稿:第十七章 支原体

第十七章 支原体和脲原体

　　我们前面已学习了细菌和螺旋体，细菌和螺旋体都属于原核细胞型微生物，另外，我们今天要讲的支原体和脲原体、衣原体以及后面要讲的立克次体也属于原核细胞型微生物。先来学习支原体和脲原体。什么是支原体呢？支原体(Mycoplasma)是一类没有细胞壁，呈高度多形态性，能通过0.45um滤菌器,胞膜富含固醇，含DNA与RNA，呈二分裂繁殖的原核细胞型微生物；支原体是目前所知能在无生命培养基中繁殖的最小微生物。由于它们没有细胞壁，能形成有分枝的长丝，故称之为支原体。

自1898年Nocard首先分离出支原体以来，许多科学家对这一微生物进行了研究，支原体因其没有细胞壁故将其归属于柔膜体纲（Mollicute)的支原体目(Mycoplasmatales)。支原体目包括3个科：支原体科(Mycoplasmataceae);无胆甾原体科(生长时不需要外源性胆固醇)，螺原体科(生长至一定阶段呈螺形)。在支原体科中又可分支原体(Mycoplasma)和脲原体(Ureaplama)2个属。支原体属现知有64个种，而脲原体属仅2个种。其中对人致病的支原体主要为肺炎支原体（M.pneumoniae)、人型支原体(M.hominis)、生殖器支原体(M.genitalium)和穿透支原体(M.penetraus)；而对人致病的脲原体则主要是溶脲脲原体(U.urealyticum)。　　　　　　　

一、生物学性状
　　形态与结构　　支原体是原核细胞生物中最小的，大小一般在0.2～0.3μm。没有细胞壁，表现为形态多样，具有可塑性。支原体用普通染色不易着色，用Giemsa法染色着色很浅。革兰染色阴性。

最外层是细胞膜，由蛋白质与脂质组成的三层结构。内、外二层主要是蛋白质，中间层为脂质。在脂质中固醇约占36%。因此凡能作用于固醇的物质，如二性霉素B、皂素、毛地黄苷等能引起支原体细胞膜的破坏而死亡。有的支原体（如肺炎支原体)在细胞膜外还有一层由多聚糖构成的荚膜，有毒性，是支原体的一种致病因素。有的支原体（如肺炎支原体、生殖器支原体和穿透支原体)有一种特殊的顶端结构，能使支原体粘附在宿主上皮细胞表面。这与支原体在粘膜上的定植和致病有关。

　　支原体以二分裂繁殖为主，也见以出芽、分枝或由球体延伸成长丝，然后分节段成为许多球状或短杆状的颗粒。支原体和其他原核生物一样，基因组是一个环状双链DNA。分子量较小，只有大肠埃希菌的1/5，故其合成和代谢很有限。　　培养特性：支原体的营养要求比一般细菌高，需要3－4h才能繁殖一代。除无胆甾原体外，由于支原体的细胞膜含固醇，所以培养基中必须加入10%～20%人或动物血清。血清主要用于提供固醇和其他长链脂肪酸，以供细胞膜合成需要，且具稳定细胞膜的作用。
　　支原体一般在pH7.8～8.0间生长，低于7.0则死亡。但溶脲脲原体最适的pH为6.0～6.5，因在培养时溶脲脲原体分解尿素产氨，可使培养基pH升高。当培养基指示剂变色即需移种，否则将迅速死亡。支原体生长缓慢，在含1.4%琼脂的固体培养基上孵育2～3d（有的需要2周)后出现菌落。典型的菌落呈荷包蛋样，核心较厚，向下长入培养基，周边为一层薄薄的透明颗粒区。有的整个菌落呈颗粒状。肺炎支原体的菌落较大，直径100～150μm。

溶脲脲原体的菌落最小，仅10～40μm，故曾称“T”株(tinystrain)。支原体的菌落小，宜在低倍镜下观察。在液体培养基中支原体的生长量较少，且个体小，一般不易见到混浊,呈清亮，只有小颗粒沉于管底。支原体是污染细胞培养的一个重要因素，支原体在细胞培养中不一定都引起细胞病变，但可影响这些细胞用于病毒培养。
　　生化反应　　支原体可根据是否能利用葡萄糖、水解精氨酸和尿素来进行鉴别。（表17－1)

抗原结构　支原体细胞膜上的抗原结构由蛋白质和糖脂组成。各种支原体均有其特有的抗原结构，交叉反应较少，在鉴定支原体时有重要意义。根据支原体的的糖脂部分可做补体结合试验，根据支原体的蛋白质部分可进行ELISA试验。

血清中抗支原体的抗体可用于支原体的鉴定和分型，包括生长抑制试验(growthinhibitiontest,GIT)和代谢抑制试验（metabolicinhibitontest,MIT), GIT试验的操作步骤与药敏试验的纸片法相似，将沾有特异性抗血清的纸片贴于接种有支原体的琼脂平板表面，若血清中的抗体与所接种的支原体相对应则纸片周围生长的菌落受到抑制。MIT试验是将支原体接种在含有抗血清与酚红的葡萄糖培养基中，若抗体与支原体相对应，则支原体的生成、代谢受到抑制，酚红不变颜色。这两种方法的特异性与敏感性均较高。应用这二种方法还可将某些支原体分成若干血清型，如溶脲脲原体可分为16型。

抵抗力　支原体因无细胞壁对理化因素的影响比细菌敏感，容易被消毒剂灭活，但对醋酸铊（脲原体除外)、结晶紫的抵抗力大于细菌。因此，在分离培养支原体时，培养基中加入一定量醋酸铊可除去杂菌生长。支原体因没有细胞壁，故对干扰细胞壁合成的抗生素如青霉素、溶菌酶等耐药，但对干扰蛋白质合成的抗生素如强力霉素、氯霉素、红霉素、螺旋霉素、链霉素等敏感。由于国内普遍应用强力霉素、环丙沙星和氧氟沙星来治疗支原体引起的泌尿生殖道感染，许多溶脲脲原体株与人型支原体株对这些药物已产生了耐药，但该耐药株对大环内酯类抗生素（如阿奇霉素、交沙霉素等)仍敏感。由于它们大多携带耐四环素基因tetM,故大多对四环素耐药。另外，由于支原体的细胞壁中含有固醇，因此对作用于固醇的药物（两性霉素B和皂素)敏感。

二、与细菌L型的区别
　　我们知道，细菌在一些影响细胞壁合成的抗生素、溶菌酶、抗体和补体的作用下可变成细胞壁缺陷的L型。细菌L型与支原体一样，也缺乏细胞壁，对同样缺乏细胞壁的支原体与细菌L型有些什么区别呢？相同点：缺乏细胞壁，形态多样，能通过滤菌器。固体培养基上菌落呈油煎蛋样或颗粒状。临床表现相似，都可引起间质性肺炎、泌尿生殖道感染、不育等。

两者的主要区别有这么几点：细菌L型在脱离诱导因素后常可回复为原来的细菌，而支原体则是一种独立的微生物，在遗传上与细菌无关。另外，支原体的细胞膜含高浓度固醇（达36％)，而细菌L型的细胞膜不含固醇，因此决定了支原体在培养时需要在培养基中加入胆固醇，而细菌L型则需要用高渗培养基以维持细胞的形态。二者固体培养基上培养长出的菌落虽然都为油煎蛋样，但支原体因生长缓慢，其菌落较小，而细菌L型的菌落稍大( 可达0.6-1.0mm)；还有，支原体在液体培养基中支原体的生长量较少，且个体小，一般不易见到混浊,呈清亮，只有小颗粒沉于管底,而细菌在液体培养基中有一定混浊度，可粘附于管壁或管底，有的呈菌膜生长，有的为沉淀生长等。

三、致病性与免疫性
　　致病性：支原体广泛存在于人、动物体，大多不致病。对人致病的主要有肺炎支原体，可引起原发性非典型肺炎。溶脲脲原体、人型支原体和在一定条件下也能引起泌尿生殖系统感染和不育症。穿透支原体、生殖器支原体和发酵支原体在艾滋病病人的发病中起着的辅助因子或促进因子的作用，因此被称之为AIDS相关支原体。

由支原体所引起的感染大多为表面感染，支原体本身不侵入血液。主要从宿主细胞胞膜获取脂质和固醇作为养料，引起细胞损伤；通过产生有毒代谢产物（神经毒素、酶类)而导致细胞毒害；另外，溶脲脲原体有尿素酶可水解尿素放出大量氨，对细胞有毒害，且可促使结石形成。还能黏附精子，影响其动力；产生神经氨酸酶样物质，干扰精子与卵子的结合；与精子膜有共同抗原，造成免疫损伤而致不育。

另外有少数支原体可引起细胞内感染，如穿透支原体、生殖器支原体和发酵支原体这些AIDS相关支原体，可粘附、入侵人类红细胞、CD4+T细胞与单核吞噬细胞，损伤红细胞及破坏细胞免疫，诱发严重感染与加重艾滋病。。

免疫性：机体感染支原体后，诱导机体产生的IgG1和IgG2抗体有调理作用，可加强巨噬细胞对支原体的杀伤作用。粘膜局部所产生的SIgA也具有保护作用。另外，肺炎支原体可作为超抗原，吸引炎症细胞浸润，同时释放IL-1，IL-6和TNF-α等细胞因子。

第二节　　肺炎支原体

从正常人和动物呼吸道粘膜上可分离出多种支原体，而目前确定的能引起人类呼吸道感染疾病的只有肺炎支原体一种。肺炎支原体除了具有刚才讲的支原体的共同特征外，还具有一些自己的一些特性：在细胞膜外还有一层由多聚糖构成的荚膜，具有抗吞噬作用，且有毒性，是支原体的一种致病因素。肺炎支原体有一种特殊的顶端结构，该结构上的黏附因子P1蛋白，能吸附于宿主呼吸道黏膜细胞受体神经氨酸酶上，起定植作用，使其在局部增值，获取宿主细胞膜固醇等物质，导致宿主细胞受损。支原体肺炎主要经飞沫感染。大多发生于夏末秋初，但一年中任何时间都可发生。发病率以5~15岁的青少年最多。支原体肺炎的病理变化以间质性肺炎为主，又称原发性非典型肺炎(primaryatypicalpneumonia)。肺炎支原体感染后症状较轻，仅有发热、咳嗽等呼吸道症状。近年来一些研究表明，有些喘息性哮喘、支气管炎与Mp的感染有关。有时见有呼吸道以外的并发症，如心血管症状、神经症状和皮疹。这可能与免疫复合物的形成和自身抗体的出现有关。

免疫性：机体感染肺炎支原体后，肺炎支原体为细胞外寄生，以体液免疫为主，细胞免疫为辅。在感染早期，肺炎支原体可刺激单核巨噬细胞产生IL-1，IL-6和TNF-α等炎症性细胞因子。诱导机体产生的IgG1和IgG2抗体有调理作用，促进单核细胞的吞噬及激活补体；粘膜局部所产生的SIgA有阻止肺炎支原体的吸附，也具有保护作用。另外，肺炎支原体与人类心、肺、脑和肾等组织有共同抗原，可引起II型超敏反应（溶血性贫血、心肌炎和肾炎等)；当抗原和抗体形成的免疫复合物则可引起III型超敏反应；另外，肺炎支原体还可作为超抗原：激活CD4+T细胞IL-2,TNF-β，IFN-γ等细胞因子，以活化巨噬细胞，加速清除肺炎支原体。

肺炎支原体的诊断方法靠分离培养和血清学检查。肺炎支原体生长缓慢，早期诊断有赖于寻找抗原。

1、分离培养　　取可疑患者的痰或咽拭接种在含有血清和酵母浸膏的培养基中，在培养基中加入青霉素、醋酸铊等以便抑制杂菌生长。初次分离时生长缓慢，因此，需要观察较长时间，且长出的菌落没有明显周边界线。但经过多次传代后生长加快，菌落可成典型荷包蛋样。这时，可以挑取可疑的菌落经生化反应进行鉴定。分离培养的缺点主要是：与血清学相比，培养阳性率差，仅为64%。

2.血清学检查：包括冷凝集试验、生长抑制试验和代谢抑制试验以及ELISA等。临床上常用冷凝集试验进行鉴定，即用病人血清与人O型RBC或自身RBC混合，4℃过夜，观察红细胞自身凝集现象，在37℃时其凝集又分散开。但仅50%左右患者出现阳性。必须注意：此反应为非特异性，呼吸道合胞病毒感染、腮腺炎、流感等也可出现冷凝集素效价的升高，故只能作为辅助诊断。

生长抑制试验：应用肺炎支原体的特异性抗体浸湿的滤纸片贴在接种可疑菌落的固体培养基上，观察是否有抑菌环，如果有，则说明湿肺炎支原体。

代谢抑制试验：将可疑菌落接种在含有特异性抗体的支原体液体培养基中，如抗体与支原体相对应，则与支原体医.学全在线结合，抑制其生长代谢，不会产生代谢产物，也不会使培养基颜色发生改变。

ELISA:包括检测抗体和检测抗原。应用肺炎支原体蛋白抗原检测其相应的抗体，较敏感，适于早期诊断。但真正的临床诊断目前倾向于早期检测抗原，应用单克隆抗体通过ELISA试验（双抗体夹心法)从患者痰、鼻洗液或支气管洗液中检测肺炎支原体分子量42kDa多肽或190kDa的P1蛋白（即黏附素)。

分子生物学检测方法：针对肺炎支原体特异性的基因用引物设计软件设计特异性引物，通过PCR技术从患者痰中检测肺炎支原体DNA，该方法快速、敏感且具有很强的特异性，并可验证治疗效果。有报道经红霉素、氯霉素或螺旋霉素治疗2~3周后，患者PCR结果全部转阴。

肺炎支原体的防治原则：肺炎支原体死疫苗或减毒活疫苗用于免疫预防效果尚不理想。对大环内酯类抗生素和氯霉素敏感。

第二节、泌尿生殖道感染支原体

引起泌尿生殖道感染的支原体主要有溶脲脲原体、人型支原体和生殖器支原体。这些支原体在分娩时由母体产道感染新生儿，以后迅速减少；但在成长后从性生活开始又渐增多。故现已被列为性传播性疾病的病原体。

我国于1986年首次分离出溶脲脲原体，90年代开始受到广泛重视。在非淋菌性尿道炎（NGU)中，除衣原体外，溶脲脲原体是一种很重要的病原体。1998年有报道3年中2197例性病专科初诊为淋病或非淋菌性尿道炎，培养结果淋球菌占21.4%、衣原体35.9%、溶脲脲原体31.4%。另有报道，201例性病患者中，溶脲脲原体占24.9%,人型支原体占2.0%，溶脲脲原体和衣原体混合感染65.2%。淋病患者中溶脲脲原体检出率比非淋菌性尿道炎的溶脲脲原体高2倍多，这主要可能是由于淋病奈瑟菌的感染损伤了泌尿生殖道粘膜，因而有利于溶脲脲原体的粘附，也是淋病治愈后有些人仍有症状遗留的原因。生殖器支原体与非淋菌性尿道炎有关。

值得注意的是在正常人的泌尿生殖道中可能有支原体存在，但与NGU患者相比，具有显著的差异。另外，生殖道的支原体感染对自然流产、出生缺陷、死胎和不孕（育)均有关系。

溶脲脲原体可引起不孕，国内资料证明原因可能是多方面的：吸附于精子表面，阻碍精子的运动;产生神经氨酸样物质干扰精子和卵子的结合;与精子有共同抗原成分，对精子可造成免疫损伤。国内报道2181例不育（孕)男女溶脲脲原体检出率明显高于正常生育对照组;经强力霉素为主的治疗后，83.7%转阴，其中恢复妊娠者占38.7%。

泌尿生殖道支原体的诊断：溶脲脲原体的分离可用加尿素和酚红的含血清支原体肉汤。肉汤内可加青霉素抑制杂菌生长。溶脲脲原体具有尿素酶，可分解尿素产氨，使酚红变红，但培养液澄清，表示阳性。在固体培养基上用低倍镜观察，可见有微小的荷包蛋样或颗粒样菌落生长。

免疫斑点试验（IDT)是将待检材料滴加于硝酸纤维滤膜上，干燥后加免疫血清。若两者特异性相应就不能被洗去，可用酶标SPA显色，表示阳性反应。此法可用于检测溶脲脲原体抗原或鉴定培养物。
　　此外尚可应用PCR技术，通过对特异性引物扩增尿素酶基因等来检测溶脲脲原体。

第三节、穿透支原体

穿透支原体是1990年首次从1例HIV阳性艾滋病患者尿中分离出的一种新支原体，形态为杆状或长烧瓶状。一端为尖形结构和肺炎支原体相似，具有粘附、穿入细胞的作用。

穿透支原体生长较慢，培养基中需加血清，菌落呈荷包蛋样，生化反应有别于其他支原体（表17-1)。抗原和其他支原体不同。对红霉素、四环素、林可霉素敏感。
　　穿透支原体的致病性与其尖形结构有关，具粘附和穿入作用，引起细胞损伤。感染穿透支原体2h后，即能粘附、穿入人或动物的红细胞、淋巴细胞和单核吞噬细胞。12h后支原体在细胞质中大量复制，导致宿主细胞受损和死亡。有人研究表明穿透支原体对HIV感染者T细胞的作用，可能促进HIV的复制和病程的发展。它对诱导TNF-?的表达可能也是造成细胞损伤的主要因素。有人通过ELISA和免疫印迹进行检测发现，HIV阳性艾滋病患者234例，穿透支原体阳性的检出率为4www.lindalemus.com/wsj/1.5%,而HIV阳性无艾滋病症状者118例，该支原体检出率仅20.3%;其他性传播性疾病患者336人此支原体阳性率仅0.8%,而健康HIV阴性者384人阳性率仅0.3%。因而提出穿透支原体感染是艾滋病的辅助致病因素。