医学微生物学-实验指导:实验六 环境因素对微生物的影响

实验六  环境因素对微生物的影响

微生物的生长繁殖是通过与外界环境进行物质和能量交换而实现的，若周围环境的改变过于剧烈，导致细菌的主要代谢机能发生障碍，或菌体蛋白质发生变性凝固，则微生物的生长被抑制或微生物死亡。

环境因素从总体上可分为物理、化学、生物和营养四大类。实验工作中常用适宜的物理或化学方法以达到消毒灭菌的目的。

一、物理因素对细菌的影响

（一)热力消毒与灭菌

【原理】

高温对细菌有明显的致死作用，主要机理是凝固菌体蛋白质，也可能与细菌DNA单螺旋断裂、细菌膜功能受损及菌体内电解质浓缩有关。

湿热灭菌所需温度较低，时间较短(表6-1)。特别是高压蒸气灭菌，因增加压力而提高温度，灭菌效果最佳。其主要优点是：①温度较高，灭菌所需时间较短；②蒸气穿透力强；③蒸气冷凝时释放汽化热，能迅速提高物品的温度；④物品并不过分潮湿。

表6-1 热力消毒灭菌法比较

方法  温度(℃) 时间(min)  灭菌器

焚烧 ＞500瞬时

干烤  160～170 干热灭菌器

巴氏消毒法   61.1～62.8  20

煮沸消毒法  100  5

流通蒸气消毒法  100 15～30  流通蒸气灭菌器

间歇灭菌法  100  30流通蒸气灭菌器(重复3次)

高压蒸气灭菌法  121 15～30  高压蒸气灭菌器

【材料】

1．枯草杆菌、大肠杆菌肉汤12h培养物。

2．肉汤培养基、琼脂平板。

3．水浴锅、电炉、铝锅、高压蒸气灭菌器、温度计、无菌毛细吸管等。

【方法】

1．将8支肉汤管分成甲、乙、丙、丁4组，每组2支，分别标注2种菌名。

2．用无菌毛细吸管分别在肉汤管内接种相应的菌种液2滴。

3．将甲组2管置60℃水浴30min，乙组2管置100℃水浴5min，丙组2管置高压蒸气锅内121℃15～30min，丁组2管不作任何加热处理(对照)。

4．将4组肉汤管置37℃培养18～24h后，观察结果。

【结果】

记录各管细菌的生长情况(表6-2)。

表6-2 细菌生长情况

细 菌   甲组(60℃30min) 乙组(100℃5min) 丙组(121℃15min) 丁组(未加热)

枯草杆菌

大肠杆菌

附：高压蒸气灭菌法（示教)

高压蒸气灭菌方法的原理是水在大气中100℃左右沸腾，水蒸气压力增加，沸腾时温度将随之增加，因此，在密闭的高压蒸气灭菌器内，当压力表指示蒸气压力增加到15磅(1.05kg/cm)时，温度则相当于121.3℃，在这种温度下20min即可完全杀死细菌的繁殖体及芽胞。

1．构造：见下图

A．桌上型电热压力蒸气灭菌锅 B．直立型电热压力蒸气灭菌锅

2．使用法及注意点：把待灭菌之物品放入灭菌室，加足一次灭菌之用水于夹层中。用螺旋固定锅顶铁盖底部，使不漏气。加热，水沸后蒸气沿夹层上升。由洞入内筒，当蒸气初进入内筒时应把上下排气管打开，放出冷空气后，关闭排气管。由于蒸气通入密闭之空间，压力即上升，从压力表可以看出，蒸气还通过安全阀门，以保证压力维持于一定限度，使压力维持于15磅20min，然后关闭热源，使压力逐渐降低至零，方可打开锅盖，否则因压力骤降，玻璃器内之液体会冲出瓶口，发生外溢或爆炸等危险。

（二)紫外线杀菌

【原理】

波长240～280nm的紫外线，因与DNA吸收光谱一致而有明显的杀菌作用。其机制是使细菌DNA相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，从而破坏DNA构型，干扰其正常复制，导致细菌死亡。

紫外线杀菌力虽较强，但穿透力弱，故仅用于实验室、病房、手术室的空气和物体表面的消毒灭菌。

【材料】

1．大肠杆菌、枯草杆菌肉汤12h培养物。

2．琼脂平板。

3．镊子、无菌棉签、紫外线灯等。

【方法】

1．用无菌棉签分别蘸取大肠杆菌和枯草杆菌菌液于2个琼脂平板上密密涂布。

2．半启皿盖(用皿盖盖住两菌涂面的1/2)，置于紫外光灯下20～30cm，照射30min。

3．将皿盖盖好，37℃孵育18～24h，观察结果。

【结果】

皿盖盖住的琼脂表面2种细菌均形成菌苔，直接暴露的琼脂表面大肠杆菌无菌生长；枯草杆菌仅有少量细菌生长。

（三)滤过除菌

【原理】

滤过除菌是一种机械除菌法，主要用于一些不耐高温液体的除菌，例如：血清、毒素、抗毒素、药物等。但此法不能除去病毒、支原体和L型细菌等。

【材料】

1．待滤过的血清肉汤。

2．滤器(已灭菌)和过滤装置等。

【方法】

1．无菌取1环待滤血清肉汤接种于肉汤管。

2．将烧瓶中的血清肉汤倒入滤斗，启动抽气机，减压抽滤。滤毕，关闭抽气机。用吸管吸取瓶中滤液，移置于无菌试管内。

3．无菌取1环滤液接种于另管肉汤。

4．将2管肉汤置37℃培养18～72h，观察结果。

【结果】

接种待滤血清肉汤的管呈浑浊，接种已滤血清www.med126.com肉汤的管澄清。

二、化学因素对细菌的影响

有些化学药品浓度高时能杀灭病原微生物，称为化学消毒剂；浓度低时能抑制细菌生长，称为防腐剂。化学消毒剂对人体细胞有毒性作用，故只能外用。化学治疗剂能选择性地影响微生物代谢，致使其死亡或抑制其生长，对人体的毒性甚微或全无，故可内服或注射。

络合碘对细菌的作用

【材料与方法】

1．取琼脂平板1个，将底面分成两等份，注明①②。

2．用无菌棉签蘸生理盐水，在左手食指头上涂擦。用该指头在平板①处琼脂表面涂抹，作为消毒前的对照。

3．用棉签蘸络合碘消毒左手食指。待络合碘干后，依上法在平板②处琼脂表面涂抹。

4．置平板于37℃培养18～24h。

【结果】

平板①处琼脂表面有细菌生长；②处不长细菌或出现极少的菌落。说明一定浓度的络合碘能杀灭细菌。

三、生物因素对细菌的影响

微生物与微生物之间，微生物与动、植物之间，不同程度地存在着拮抗现象。生物之间的这种拮抗作用，可以表现出对细菌的抑制或杀灭作用，即生物因素对细菌的影响。

抗生素(antibiotics)是指某些微生物(大多数是放线菌和真菌，极少数是细菌)在生长繁殖过程中，产生的能抑制或杀灭某些生物细胞(如微生物和肿瘤细胞)的合成代谢产物。一种抗生素只对一定种类的生物细胞有拮抗作用，这种作用范围称抗菌谱。

抗生素的抗菌机制，主要表现在影响细胞壁的合成，损伤或破坏细胞膜的结构，干扰细胞碳水化合物的代谢，抑制核酸或蛋白质的合成，这些作用都有一定的选择性。

（一)抗生素的抗菌试验

1．试管稀释法

【材料】

(1) 金黄色葡萄球菌肉浸液培养物(1∶1000)

(2) 100u/ml青霉素

【方法】

(1) 排列小管10支(表6-3)于第1管中加肉浸液1.8ml，其他各管各加1ml。

表6-3：抗生素抗菌试验试管稀释法(单位：ml)

试管号 1  2  3  4  5  6   7   8  9  10

肉浸液pH 7.0  1.8 1  1  1  1  1   1   1 1  1

青霉素100 u/ m药品数据l   0.2 1  1  1  1  1   1   1 1  弃去1ml

青霉素浓度u /ml   10 5  2.5   1.25  0.625  0.3125 0.156  0.078  0.03   对照

菌液(1:1000)   0.1   0.1 0.1   0.1 0.1   0.1  0.1 0.1 0.1 0.1

结  果

注：以上各管均应严格按无菌操作进行

(2) 以100u/ml青霉素0.2ml加入第1管，用吸管反复吹匀后，吸1.0ml至第2管，再将第2管反复吹匀后，吸1.0ml至第3管。如此依次稀释，至第9管时弃去1.0ml。第10管不加青霉素，作为对照。

(3) 每管各加葡萄球菌肉浸液培养物(1∶1000)0.1ml。

(4) 37℃孵育12～18h，观察结果。

【结果判断】：抗生素最高稀释度仍能抑制细菌生长者，该管含药浓度即为试验菌株的敏感度(表6-4)。

表6-4：试管稀释法细菌敏感度

青霉素敏感度敏感状况

0.6～2.0uml  敏 感

＞2.0u /ml 耐  药

2．纸片扩散法

纸片法检验程序(图6-1)。

【材料】对青霉素敏感与耐药的金黄色葡萄球菌液体培养物，对氯霉素敏感与耐药的痢疾杆菌液体培养物，抗菌素滤纸片(青霉素、氯霉素、链霉素、四环素、红霉素、庆大霉素等)，普通琼脂平板，无菌镊子，无菌棉签。

【方法】

(1) 用无菌棉签沾取培养6～8h的金黄色葡萄球菌及痢疾杆菌培养物，分别浓密地涂布于平板表面(注意棉签不可过湿，涂布要均匀，致密)，待稍干。

(2) 将含有各种药品的滤纸片按一定间隔贴在平板的不同区域。

(3) 37℃培养18～24h，观察结果。量取各种抗菌素滤纸片周围抑菌环大小，确定其对药物的敏感情况(表6-5)。对比：(1)两种细菌对各抗菌素敏感性差异；(2)同种不同株的细菌对同一种抗菌素敏感性的差异。

【结果】

观察纸片周围有无抑菌圈(图6-2)，并量出抑菌圈直径(包括纸片)大小，从表6-5得出金黄色葡萄球菌对所试抗生素的敏感性。

表6-5：几种抗生素的抑菌圈与敏感标准

抑菌圈直径(mm)

抗生素     低度敏感 中度敏感高度敏感

青霉素<10 10～15 >15

链霉素<10 10～15 >15

四环素<10 13～14 >14

庆大霉素 <12 13～14  >14

卡那霉素 <12

图6-1 纸片琼脂扩散法试验程序

(a)挑取菌落 (b)转种肉汤  (c)比浊  (d)涂布平板上 (e)放置药敏纸片  (f)量取抑菌圈大小

图6-2 药物敏感试验(纸片法)示意图  图6-3 噬菌体的噬菌斑示意图

（二)噬菌体的噬菌作用

噬菌体(bacteriophage)具有严格寄生性，对相应的易感细胞，具有高度的种特异性和型特异性。感染细胞后，可裂解宿主细胞，或处于溶原状态。噬菌体可用于细菌的鉴定、分型、检查未知细菌和防治某些疾病等。

【材料与方法】

1．噬菌体的溶菌现象

(1) 取4支肉汤管，2支接种金黄色葡萄球菌，2支接种大肠杆菌。

(2) 将上述种菌肉汤管各取1支，分别加入金黄色葡萄球菌噬菌体肉汤液0.2m1。

(3) 将上述4支肉汤管，置37℃培养6～12h观察结果。

2．噬菌体的溶菌斑

(1) 取琼脂平板1个，分为4等分，注明①、②、③、④。

(2) 分别用无菌棉签在①、②处涂布接种痢疾杆菌，在③处涂布接种大肠杆菌，在④处涂布接种白色葡萄球菌。

(3)在②、③、④处中央各加1小滴痢疾杆菌噬菌体肉汤液(注意不要交叉污染)，在①处中央加1滴肉汤。

(4) 置37℃培养18～24h观察结果。

【结果】

1．溶菌现象 加有噬菌体的金黄色葡萄球菌肉汤管清亮，其余均浑浊。

2．噬斑(图6-3)，在②处的中央有一无菌生长的空斑，即噬斑，其余部位无此现象。