实验三 细菌的人工培养
细菌的培养检查法是很重要的微生物学实验基本技术。当标本内致病微生物含量少，或杂菌数量多，需用人工培养法加以分离、增殖，然后根据其特性加以鉴别并进行诊断。对药品等制剂的无菌检查及疫苗的制备也需进行细菌的人工培养。
细菌分离培养的基本条件包括接种用具(接种环、接种针)(图3-1)、培养箱、培养基，以及无菌室和超净台等。
图3-1 接种环和接种针示意图
一、培养基的配制
培养基是细菌的人工营养基质。适宜的培养基必须含有细菌生长和繁殖所需的营养物质，有合适的酸碱度，澄清且无菌。培养基按其物理性状分为固体、半固体和液体培养基。按其用途，可分为基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基及厌氧培养基等。
常用的培养基：
（一)肉汤培养基
肉汤培养基常用瘦牛肉制成，如无牛肉可用牛肉膏代替。
制法：
新鲜牛肉 500g
蛋白胨 10g
氯化钠5g
蒸馏水 1000ml
1．将除去脂肪及筋膜的新鲜瘦牛肉切碎绞细，称取500g加蒸馏水1000ml，混合后，置4℃冰箱过夜，除去液面上的浮油。过夜的目的是使牛肉的水溶性养料充分地渗透出来。
2．次日取出，煮沸30min。边加热边搅拌，勿使肉渣沉底。用绒布过滤，并尽量挤净肉渣中的液体。
www.lindalemus.com/hushi/3．在滤液中加1%蛋白胨、0.5%NaCL、0.1%K2HPO4，补足水分至1000ml。
4．冷至40～50℃时，用氢氧化钠校正pH至7.8，煮沸10min(因肉浸液中部分碳水化合物经加热破坏，分解产酸而影响pH，加热可使其稳定)，然后补足失去水份，重新校正pH值。用脱脂棉过滤，滤液须澄清。
5．分装于试管或三角烧瓶，塞好棉塞，高压蒸气灭菌。冷却后取出。
6．无菌试验：将肉汤置37℃温育24h，确无细菌生长方可应用。
注：如用牛肉膏制肉汤培养基，配方如下：
牛肉膏 0.5g
蛋白胨 1g
氯化钠 0.5g
蒸馏水 100ml
以上各成份混合高热溶解后，即可调节pH，以下步骤同上。
（二)普通琼脂培养基
普通琼脂培养基是常用的固体培养基。琼脂本身无营养，只是用以改变肉汤的物理性状。它是一种赋形剂，在98℃时融化，45℃左右凝固，通常肉汤中加入2％～3％琼脂，融化后能在室温下凝固形成固体，即为固体培养基。
成分：琼脂 2～3g
肉汤培养基 100ml
方法：
1．取已制备好的肉汤培养基100ml，置于三角烧瓶中，加琼脂2～3g加热融化。
2．趁热校pH至7.4～7.6。
3．未凝前分装于试管和烧瓶中，加棉塞，高压蒸气灭菌。
4．试管趁热斜置，冷凝后即为琼脂斜面培养基，待烧瓶中琼脂冷到50～60℃时倾注平板。即将瓶口或管口迅速通过火焰2～3次，微启无菌平皿盖，迅速倾注后，盖皿，并在桌上轻轻移摇，使皿底铺满肉汤琼脂，冷却后即成琼脂平板。
5．放4℃冰箱保存备用。
（三)半固体培养基
成分：
琼脂 0.5g
肉汤培养基 100ml
方法：于100ml肉汤培养基中加入0.5g琼脂，加热融化后，校正pH7.4～7.6。分装于小试管中(每管约2ml)，高压蒸气灭菌。灭菌后将试管直立，待冷凝后即成半固体培养基。4℃冰箱保存备用。
（四)血液琼脂培养基
成份：
普通琼脂培养基100ml
无菌脱纤维兔(或羊)血 10ml
方法：
1．将已灭菌的普通琼脂培养基加热融化，并冷至50℃左右。
2．以无菌操作加入脱纤维兔血或羊血于琼脂培养基内混匀(注意勿产生气泡)，然后分装于灭菌试管或平皿中，制成血液琼脂斜面或平板，放4℃冰箱保存备用。
二、细菌接种法
细菌的接种方www.lindalemus.com/rencai/法因各种培养基不同而异，常用的方法有平板、斜面、液体和半固体接种。
【材料】
1．琼脂斜面、琼脂平板、肉汤培养基。
2．葡萄球菌、大肠杆菌斜面培养物。
【方法】
（一)平板接种法
临床上各种检验标本，如粪便、痰、脓液中常混有多种细菌。如欲检查病人标本中是否有某种病原菌时，须先将各种细菌分离，获得纯菌培养物后才能进一步进行细菌的鉴定。琼脂平板培养基因面积大，接种后可达到分离的目的，常称分离培养法。平板接种法有多种，以下介绍平行划线法(又称连续划线接种)及分区划线法。
1．分区划线法：如接种物中细菌极多时(如固体菌种、粪便等)则必须采用分区划线法才能得到好结果(图3-2)。
(1) 烧灼接种环，冷却后，取1环接种菌液。
(2) 打开平板盖，左手斜持平板(约45°角)，并靠近火焰，以免空气中杂菌落入平板内，右手握持已沾菌液的接种环在琼脂平板一端连续平行划线(约占平板面积的1/3)，为第1组线。划线时，接种环与平板成30～40°，轻轻接触平板，以腕力平行滑移接种环，注意避免将环嵌人琼脂将其划破。
(3) 转动平板约70°，接种环烧灼灭菌冷却后，从原接种处通过2～3条线，划于另一个1/4的面积为第2组线。划毕，接种环又烧灼灭菌，冷却后同法划出第3、4组线。
(4) 接种完毕，盖上皿盖，于皿底做好标记，将平板倒置(平板底面朝上)，置37℃培养18～24h，观察结果。
2．平行划线法：一般当接种物中细菌不太多时(如脓汁标本、液体培养物等)可以选用平行划线法(图3-3)。
图3-2 分区划线法（左)及菌落分布示意图（右)
图3-3 平板连续划线法（左)及菌落分布示意图（右)
【结果】
琼脂平板表面散在分布两种菌落，为圆形、光滑、湿润、边缘整齐，其中有金黄色色素的为金黄色葡萄球菌的菌落；另一种为大肠杆菌菌落。
（二)琼脂斜面接种法
多用于纯种细菌的增菌和保存菌种。
1．用灭菌接种针取细菌培养物少许。
2．拔出培养管棉塞，管口经火焰灭菌，将沾有细菌的接种针从培养基中央刺入，沿原穿刺线拔出。
3．再将接种针自下而上在琼脂上平行划线(图3-4)。
4．接种后，管口在火焰上灭菌，塞回棉塞，接种环灭菌。
5．在试管壁近管口处做好标记，置37℃培养18～24h，观察结果。
（三)肉汤接种法
用于增菌。
1．灭菌接种环取细菌培养物少许。
2．以无菌操作将沾有细菌的接种环伸入肉汤管中，将环上细菌轻轻研磨于接近液面的管壁上，然后将试管稍倾斜，使肉汤碰及细菌，将细菌带入培养基中(图3-5)。
3．接种后管口灭菌，塞回棉塞，接种环灭菌，并做好标记，置37℃培养18～24h，观察结果。
（四)半固体接种法(穿刺接种法)
用于观察细菌有无动力。
半固体接种是用接种针，无菌操作方法同前。将取有细菌的接种针从培养基的中央刺入，沿原穿刺线拔出，注意在刺入与拔出时不可晃动接种针(图3-6)。
图3-4 斜面接种法 图3-5 液体培养基接种法 图3-6 穿刺培养法
接种后做好标记，置37℃培养18～24h，观察结果。
（五)倾注平板法
用于饮水、牛乳、尿液、药物等标本的细菌计数。
方法是将经灭菌生理盐水适量稀释(通常作10-1～10-5稀释)的标本lml，置于灭菌平皿内。注入10～15ml已融化并冷至50℃左右的适宜培养基(图3-7)，凝固后，将平板倒置于37℃培养18～24h，计算菌落数。
图3-7 倾注平板法
（六)厌氧培养法
1．生物学法：如肉渣培养基(庖肉培养基)，因肉渣中含有不饱和脂肪酸及谷胱甘肽，能吸收培养基中的氧，使氧化还原电位下降，故适于厌氧菌培养。同时用石蜡凡士林封闭液面，可隔绝空气中的游离氧继续进入培养基，形成更为良好的厌氧条件，并可借石蜡凡士林层是否上移指示该菌是否产气。
另外可利用需氧菌与厌氧菌共生的原理，将需氧菌和厌氧菌分别接种在同一琼脂平板上，然后将琼脂平皿用融化石蜡密封，放温箱内培养，需氧菌生长时消耗环境中的氧气而有利于厌氧菌生长。
2．化学法：焦性没食子酸的碱性溶液能迅速吸收氧气，生成棕褐色的焦性没食子橙，造成厌氧环境。此法适用于单个琼脂平皿的培养。方法是将厌氧菌划线接种于血琼脂平皿，取无菌方形玻璃板一块或培养皿盖，铺上一薄层灭菌脱脂棉或纱布，将1g焦性没食子酸放在其上，滴加10%NaOH溶液约2ml于焦性没食子酸上，迅速将培养平皿倒置于玻璃板或培养皿盖上，周围以融化的石蜡或胶泥密封，将其置37℃培养24～48h后取出观察。
3．物理方法：如用厌氧缸或厌氧工作站，将接种的平皿和试管放入特制的厌氧缸或厌氧工作站内，用抽气机抽去空气再充入氢、氮或二氧化碳，于37℃培养。此法适用于大量厌氧菌培养。又如高层琼脂法，是在试验中加入占其高度约3/5的无菌琼脂培养基，水浴融化后接种细菌，混匀后，直立待其凝固，于37℃培养。
三、细菌培养性状观察
（一)琼脂平板上菌落观察
菌落是经分离培养后由单个细菌生长繁殖形成的集团。不同细菌的菌落各有特点，观察时应选择比较分散的菌落，并注意以下几个方面：大小、形状、边缘、表面、透明度、颜色、溶血性等。
（二)肉汤培养基中细菌生长现象的观察
肉汤在未接种细菌前是澄清的，接种细菌后如有生长，有三种形式：
1．混浊生长：液体变混浊。
2．膜状生长：液体澄清，表面有一薄层菌膜。
3．沉淀生长：液体澄清，管底有沉淀物。
（三)半固体中细菌生长观察
半固体可观察细菌有无动力，无动力菌沿穿刺线生长，培养基澄清。有动力菌，穿刺线模糊不清，培养基混浊。
