医学微生物学-实验指导:实验十八 病毒感染血清中抗体检测

实验十八  病毒感染血清中抗体检测

病毒侵入机体后，刺激机体产生免疫反应，并在血液中出现抗体，抗体在机体内可持续存在一定时期。因此，应用已知病毒测定抗体的存在和滴度，就可以协助诊断是否有病毒感染。如果只采取恢复期的血清，即使查到抗体也只说明过去有该病毒的感染，而不能确定最近的感染系由该病毒所引起。只有在疾病的早期和恢复期采取双份血清检测抗体，且恢复期抗体较早期血清抗体效价升高4倍或者以上时，再结合临床表现，才有诊断价值。如能检测到血清IgM抗体，则无需双份血清，可达快速诊断的目的。

一、红血球凝集及血球凝集抑制试验

某些病毒或病毒的血凝素能选择地引起个别种类的哺乳类或禽类的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可被病毒(或其血凝素)悬液中加进特异性免疫血清或病人血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验。在疾病发病早期和恢复期采取双份血清。经检测，恢复期抗体较早期血清抗体效价升高4倍或以上时，再结合临床表现，可作诊断依据。

（一)血凝试验(红细胞凝集试验)

【材料】

1．流感病毒鸡胚尿囊液：将流感病毒接种于9～11d胚龄的鸡胚尿囊腔内(若初次分离物应接种鸡胚羊膜腔内)。37℃孵育48h，随时观察胚蛋活动情况。温箱内应保持一定湿度。48h后，鸡胚若处于濒死状态时即收取尿囊液，3000r/min，离心15min，上清含血凝素。血凝素在-30℃保存，可保持其活性几个月至几年。

2．红细胞：取鸡血加入2%枸橼酸盐水，其比例为4∶1，迅速混合，存放于4℃冰箱，时间不超过一周。使用前取红细胞悬液加5～10倍体积生理盐水洗涤3次，最后一次以2000r/min的速度离心10min，洗涤后的红细胞按容积用生理盐水稀释成0.5医.学全在线www.lindalemus.com%悬液备用。

表18-1 血凝试验操作方法（单位ml)

注：各管血凝结果以++++、+++、++、+、±、- 表示，自管底观察。

一层红细胞均匀铺于管底者为++++。

基本同上，但边缘不整齐，有下垂趋向者为+++。

血球于管底形成一个环状，四周有小凝集块者为++。

血球于管底形成一个小团，但边缘不整，四周有小凝块者为+。

血球于管底形成一个小团，边缘光滑圆润者为一。

【方法】

1．排列小试管10支，编号

2．按顺次加入各种材料(表18-1)。

结果以++为终点，亦即一个凝集单位。做血凝抑制试验时，4个单位的血凝素即为++管向左移二管的稀释度。如病毒的血凝稀释度为1/640，则4个单位为1/160，将鸡胚尿囊液用160倍稀释即为4个单位。

（二)血凝抑制试验

【材料】

1．病人血清，流感病毒(4个血凝单位)，0.5%鸡红细胞

2．生理盐水

3．试管、试管架、1ml吸管等

【方法】

1．排列11支小试管，编号。

2．按顺次加入各种材料(表18-2)。

3．摇匀，置室温60～90min，按血凝结果标准判断观察结果，即在对照管均正常的条件下，不出现血凝的最高稀释管的稀释倍数即为血凝抑制抗体的效价。

表18-2 血凝抑制试验操作方法（单位ml)

二、中和试验

病毒中和试验是抗原抗体在试管中的中和反应，通过接种动物、鸡胚培养或组织培养反映出来。原来病毒可对动物、鸡胚或组织培养致一定病变，由于经特异性抗体中和而失去致病性。可用于检查病人血清中抗体的增长，也可以用来鉴定未知病毒。常用于流行病学调查，在诊断一般疾病时不常用。试验时将病人血清作一系列递增倍比稀释后与已知病毒放入试管中作用一定时间，然后接种于易感动物、鸡胚或组织中，观察一段时间。如果动物不死(或鸡胚不死，或细胞培养不出现病变)，则表示该病人血清中含有一定量的特异性中和抗体。说明病人曾受过该病毒的感染。

【材料】

1．Ⅰ型脊髓灰质炎病毒，病人血清。

2．HeLa细胞培养瓶。

3．细胞维持液（含5%小牛血清，5%水解乳蛋白Hanks液)等。

【方法】

（一)病毒液制备

1．接种：将已知I型脊髓灰质炎病毒分别接种HeLa细胞3～5瓶，病毒液1ml加维持液9ml/瓶。

2．培养：置5% CO₂培养箱中，37℃条件下培养。

3．收获：一般培养1～3d，细胞病变达++++时收获细胞培养液。

4．离心：将收获的病毒液经2000r/min 15min离心沉淀，去除细胞碎屑，混匀。

5．分装：将混匀病毒分装成1ml管，同时作无菌试验，证实无菌后冰冻保存。作病毒滴定用。

（二)病毒滴定

1．稀释病毒：将I型脊髓灰质炎病毒液用维持液连续作10倍稀释，由10^-1到10^-10。

2．接种：一般选用10^-4至10^-10的稀释度接种，每一稀释度接种4只培养瓶，每瓶0.1ml病毒加0.9ml维持液。同时设正常细胞对照管。

3．观察与计算：接种后每天或隔天观察结果，根据第7d结果按Karber公式计算TCID₅₀(指半数的细胞培养瓶出现病变)，即LogTCID₅₀=L-d(S-0.5)

L：指病变最低稀释度的对数。

d：各对数稀释度之间的差数。

S：病变细胞瓶比例之总和。

假定每稀释度接种4瓶，如出现：

第4瓶病变4/4=1　第2瓶病变2/4=0.5

第3瓶病变3/4=0.75第l瓶病变1/4=0.25

病毒稀释液 病变细胞瓶比例

10^-1   　　　　　 4/4=1

10^-2   　　　　　 4/4=1

10^-3  　　　　　　4/4=1

10^-4  　　　　　　2/4=0.5

10^-5  　　　　　　1/4=0.25

10^-6  0/4=0

10^-7  LogTCID₅₀=L-d(S-0.5) =-l-1(3.75-0.5)= -4.25

则该病毒LogTCID₅₀的滴度=10^-4.25/0.1ml

（三)中和试验步骤

1．固定病毒：在中和反应中，通常用病毒滴度为100 TCID₅₀。Karber公试计算结果是指一个TCID₅₀，如10^4.5即一个TCID50，如10^2.5为100个TCID₅₀。例如，病毒滴度为100 TCID₅₀，具体稀释度为l∶316(查反对数表)

2．稀释血清：先将血清56℃ 30min灭活，然后用Hanks液将血清作不同的稀释度稀释1∶10，l∶40，1∶160，1∶640，1∶2560。

3．加病毒：将含100 TCID₅₀的病毒与各稀释度的血清等量混匀，置37℃，然后分别吸取每个稀释度的血清与病毒的混合物0.2ml接种于加有0.8ml维持液的细胞培养管中，每个稀释度种2瓶，同时做下列对照：

病毒对照0.1ml病毒+0.9ml维持液

血清对照0.1ml(1∶10)血清+0.9ml维持液

细胞对照加1ml维持液

4．结果判定：接种后每天或隔天观察细胞病变，第7d判定最后结果。

一般病毒对照于第2d出现+～++病变，3～5d达++++病变，细胞对照及血清对照为阴性(极少数1：5血清对细胞有毒性，但能与特异性病变相区别)。待测血清最高稀释度能抑制50%细胞病变出现(2瓶中有1瓶未出现病变者)即为该血清中和抗体的效价(表18-3)。

表18-3 中和试验结果判断

血清释稀倍数  试验瓶  病毒对照  细胞对照  血清对照

1:10 －  － +  +  － －  － －

1:40  － －

1:160+  －

1:640+  +

1:2560  +  +

注：－ 无细胞病变 ＋ 有细胞病变（＋＋以上)

试验血清中和抗体效价为1∶160。