实验十七 病毒的培养
病毒与细菌不同，它必须依赖宿主细胞才能增殖。采用组织培养分离病毒，常用的方法为鸡胚培养、单层细胞培养法及组织块法。后两者均能在显微镜下直接观察正常细胞的形态，一般分为梭形(成纤维样)及多角形(上皮样)两类。
一、鸡胚培养法
鸡胚培养法为常用的病毒培养方法之一，用于对痘类病毒、粘病毒和疱疹病毒的分离、鉴定、制备抗原、以及研究病毒性质等方面。由于鸡胚培养方法操作简便、受精鸡卵来源丰富，鸡胚本身带病毒的情况少见，特中国卫生人才网别是鸡胚感染粘病毒后，在它的羊水和尿囊液中有大量的游离病毒存在，对动物红细胞可产生血凝现象，因此为初步鉴定病毒提供了一个依据。其接种方法有鸡胚绒毛尿囊膜接种法、羊膜腔接种法及尿囊腔接种法等。在此实验中仅介绍后两种方法。
【材料】
流感病毒10－3稀释液，9-12d龄鸡胚、无菌1ml注射器及7～9号针头、钢钻、磨牙钻、弯头小镊、灭菌液体石蜡、灭菌毛细吸管等。
【方法】
1．鸡卵的孵化：选大而壳薄的鸡蛋，用酒精棉球轻拭外壳以除去污物，置于38-39℃的温箱中孵化，箱内必须保持相当的湿度，鸡卵每天翻动1-2次，受精的鸡卵4-5d后即可见到胚胎和血管。
2．鸡胚羊膜腔接种法：(图17-1)
(1) 操作前一天将卵的小端向下直立培养，使胚胎浮在气室下，便于操作。
(2) 接种前检查鸡胚生活情况，并用铅笔划出气室和胚胎的位置，然后用磨牙钻在靠近胚胎侧磨一方形小窗，每边约1cm。
(3) 用小镊挑去卵壳，撕去卵膜，再滴两滴石蜡油于卵膜上，石蜡油在卵膜上散开使膜透明，这样在照明灯照射下，整个鸡胚明显可见。
(4) 用灭菌1ml注射器抽取少许流感病毒，将针头对准鸡胚直下，穿过绒毛尿囊膜和羊膜进入羊膜腔，为了试针探头针是否确实已到羊膜腔内，可用针头轻击小鸡嘴部，小鸡立即动弹表示针头已进入羊膜腔，推动注射器，注入0.1-0.2ml。
(5) 注射完毕后用胶布封口(胶布先经碘酒处理，并通过火焰烧去余碘)，用过的注射器经煮沸消毒，接种的鸡胚置于35-36℃的温箱中孵育48-72h。
(6) 自接种后次日起逐日检查鸡胚生活情况，两日以内死亡者多与病毒接种无关，收获病毒前将鸡胚放入4℃的冰箱中使鸡胚冻死以避免收获时出血。
(7) 自冰箱内取出鸡胚，用碘酒消毒气室端，撕去胶布，并将蛋壳扩大，用小镊撕去卵膜及绒毛尿囊膜，然后用毛细吸管除去囊液，再用左手持镊，镊住羊膜腔，用毛细管插入羊膜腔吸取羊水，一般可吸出羊水1ml左右。
(8) 检查羊水有无凝集鸡红细胞的作用。
图17-1 鸡胚羊www.lindalemus.com/jianyan/膜腔接种法 图17-2 鸡胚尿囊腔接种法
3、鸡胚尿囊腔接种法：(图17-2)
(1) 检查鸡胚生活的情况，用铅笔标明天然气室，然后在绒毛尿囊膜发育区避开大血管处作一直径为1mm的小园圈定为注射入口。
(2) 用碘酒少许消毒注射人口和天然气室的顶端，再用75％的酒精洗去碘。
(3) 用钢钻经过火焰消毒，在注射入口以及气室顶端钻孔。
(4) 用灭菌的1ml注射器抽取病毒液体0.1～0.2ml刺入约0.5cm深后注入。
(5) 注射完毕后，用小镊夹一小块胶布沾95％酒精少许通过火焰燃烧以达到消毒目的后，迅速将火焰熄灭，将注射人口及气室的小孔封贴。
(6) 培养收获同羊膜腔接种法，尿液及羊囊液均可收获。尿囊接种法适于流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒以及新城鸡瘟病毒的传代。但分离培养阳性率不及羊囊接种法。
(7) 取清洁试管2只，标记“1”、“2”。试管内加入收获的尿囊液摇匀，置室温中半小时后观察有无血凝现象并记录结果。
二、原代人胚肾单层细胞制备
原代细胞为直接采自动物或人组织如人胚肾、人羊膜、猴肾等。人胚肾为实验室常用的组织。
【材料】
1．4～6个月龄新鲜的胎儿(水囊引产或早产死胎)。
2．Hanks液、0.25%胰酶、营养液〔含10%胎牛血清，0.5%水解乳蛋白、三抗(青霉素、链霉素、卡那霉素)〕。
3．5.6%碳酸氢钠溶液。
4．无菌培养小瓶、三角烧瓶、吸管、眼科小剪刀及小镊子、橡皮塞。
【方法】
1．取胚肾：胎儿取俯卧位，用3％碘酒消毒背部及臀皮肤，剪开脊柱两侧皮肤及皮下组织。自肋缘下剪开骶嵴肌，钝性分离拉开切口，用止血钳或镊子夹取肾脏，分离肾周组织，取出肾脏放入无菌平皿中。
2．剪取皮质：将肾包膜剥去，用眼科剪刀从肾表面剪取皮质，除去髓质。将皮质置营养小瓶内，剪成1～3mm3小块，用Hanks液洗数次，直至液体清晰为止。
3．消化：将组织小块移入三角烧瓶内，加0.25%胰酶10ml，同时加入0.1ml三抗溶液，将pH调至8.0左右置4℃冰箱消化18h左右。取出后用Hanks液轻轻洗3次，以除去剩余的胰酶溶液。
4．分散细胞：加入营养液10ml，用刻度吸管吹打，直至组织块细小至不可见，全部成为分散细胞为止。
5．细胞计数：吸0.1ml细胞悬液，加入0.9ml Hanks液，混匀后吸出少量悬液滴入血球计数板，用低倍镜计算，并按下列公式计算每ml细胞数。(4大格细胞数/4×10,000×10=每ml细胞数)。
6．细胞分装及培养：将已计数的细胞悬液，用营养液稀释至每毫升含40万～50万个细胞，将此细胞悬液分装入培养小瓶，每瓶lml，用橡皮塞塞好，充分摇匀置37℃温箱静置培养，以后每日观察细胞生长情况。一般于次日即可见细胞粘于管壁，3～7d长成单层后可使用。
三、HeLa细胞培养法
肿瘤组织经过多次传代可建立传代细胞系，这种细胞能无限传代。HeLa细胞来自子宫颈癌组织，对多种肠道病毒及腺病毒均敏感，故可用于这些病毒的分离。
【材料】
1．传代HeLa细胞系培养瓶。
3．0.25%胰蛋白酶、三抗、营养液。
4．5.6%碳酸氢钠。
5．无菌培养瓶，吸管等。
【方法】
1．弃去传代HeLa细胞培养瓶中的营养液。
2．加入5m1 0.25%胰蛋白酶溶液，37℃孵育1～2min。
3．放置细胞瓶使细胞在上，胰酶溶液在下，继续孵育5～10min。
4．除去胰蛋白酶，加入原量的生长液，用10ml吸管吹打分散细胞。
5．用营养液按原量作3倍稀释。然后用1ml吸管分装培养小瓶，使每小瓶含1ml细胞悬液，置37℃培养。
6．单层细胞的生长：培养24h后，HeLa细胞贴于培养瓶壁，表现为单个或2～3个细胞聚集成的小岛，随后细胞开始分裂繁殖，一般3～7d长成单层。HeLa细胞的形态为多形的上皮样细胞。
四、病毒对细胞致病作用的观察
【材料】
1．HeLa细胞培养小瓶。
2．脊髓灰质炎病毒毒种，腺病毒毒种。
3．细胞维持液(含5%小牛血清，5%水解乳蛋白的Hanks液，其中含有青霉素100u/ml、链霉素与卡那霉素各100μg/ml，pH调至7.4～7.6)。
4．1ml吸管等。
【方法】
（一)接种病毒
1．选择生长良好的人胚肾细胞培养小瓶，分试验组(接种病毒)和正常细胞对照组(不接种病毒)。
2．试验组：倾去营养液，每瓶加入维持液0.9ml，然后接种已稀释的脊髓灰质炎病毒液或腺病毒液0.1ml。
3．正常细胞对照组：倾去营养液后，每瓶加维持液lml。
4．置37℃培养，接种24h后，逐日观察结果。
5．接种病毒时注意事项：
(1) 接种病毒时需要两个人配合，严格无菌操作。
(2) 接种病毒时应将吸有毒种的吸管伸入到培养小瓶内，然后轻轻地吹出毒种，切不可将毒种污染环境。
(3) 吸毒种的吸管应及时放入消毒缸内。
（二)病毒感染细胞的指标
1．pH变化
正常细胞代谢时能分解糖类产酸，使维持液中酚红指示剂由红色变黄色。但某些病毒增殖后影响正常细胞代谢，降低了细胞分解代谢产酸的作用，因此维持液pH仍保持原状甚至变碱性。这是反映病毒在细胞中增殖的一个指标。
2．细胞病变
细胞受病毒感染后，由于病毒的增殖，使细胞形态上产生病理改变，不同病毒引起细胞病变的特征有所不同，依次可识别病毒，举例如下：
(1) 脊髓灰质炎病毒：细胞变圆、缩小，细胞之间可有拉丝，折光性强，病变细胞分散较均匀，不成堆聚集，视野较干净。
(2) 腺病毒：细胞肿大变圆，常见的3、7、11型可有折光性很强的粗大颗粒，细胞聚集成葡萄状，细胞层间可见明显撕裂现象。
(3) 疱疹病毒：细胞肿大变圆，边缘较薄，有时有拉丝现象，并可有比一般病变细胞大数倍的大圆形细胞及多核巨细胞。病变细胞的细胞膜、细胞浆、细胞核层次较清楚，可见分成三层的靶形病变细胞。
