医学微生物学-实验指导:实验十 肠杆菌科

实验十  肠杆菌科

肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。

一、大肠埃希菌

大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。

（一)形态与培养特性

【材料与方法】

1．大肠杆菌革兰染色标本片。

2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。

【结果】

1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。

2．菌落特征(表10-1)。

表10-1  大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征

培 养 基 菌 落 特 征

普通琼脂平板  圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落

SS平板呈红色

中国蓝平板  呈蓝色

伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽

（二) 生化反应

【材料与方法】

1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。

2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。

3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。

【结果】

大肠杆菌生化反应结果(表10-2)。

表10-2  大肠杆菌及产气杆菌5种糖发酵、双糖铁、IMViC试验结果

 上 层   下 层

葡   乳   麦   甘  蔗  吲哚  甲基红  VP 枸橼酸盐

 乳  H₂S  葡  动力

大肠杆菌  ⊕  ⊕  ⊕  ⊕  d   +　 -　 ⊕   +     +  +  - -

产气杆菌  ⊕  ⊕  ⊕  ⊕  +   +   -   ⊕   +     -  -  + +

二、沙门菌属

沙门菌属(Salmonella)为一群生化反应、抗原结构相似的革兰阴性杆菌，血清型别繁多，对人致病的有伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌、希氏沙门菌、肠炎沙门菌，鼠伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌等，可引起人致伤寒、副伤寒、胃肠炎和败血症等疾病。

（一)形态与培养特性

【材料与方法】

1．伤寒沙门菌革兰染色标本片、鞭毛染色标本片。

2．伤寒沙门菌，甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌在普通琼脂平板，中国蓝平板，SS平板，伊红美蓝平板18~24h培养物。

【结果】

1．伤寒沙门菌为革兰阴性杆菌，分散排列，鞭毛呈粗大、大波浪形。

2．菌落特征：伤寒、副伤寒沙门菌菌落特征一致(表10-3)。

表10-3  伤寒、副伤寒沙门菌在普通琼脂平板、选择鉴别培养基上的菌落特征

培  养  基菌 落 特 征

普通琼脂平板   圆形，中等大小，灰白，半透明，边缘整齐光滑

SS平板  较小，淡黄色，半透明

中国蓝平板 较小，淡红色半透明

伊红美蓝平板  较小，无色，半透明

（二) 生化反应

【材料与方法】

1．取伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。

2．取伤寒沙门菌，甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。

3．吲哚试验、尿素分解试验见实验四。

【结果】

生化反应结果(表10-4)。

表10-4  伤寒、副伤寒杆菌主要生化反应结果

细菌    葡   乳   麦   甘   蔗   动力  H₂S  吲哚   尿素

伤寒杆菌  +  -   + +  - +  +  -   -

甲型副伤寒杆菌  ⊕    -   ⊕   ⊕ - +  d  -   -

肖氏沙门菌   ⊕   -   ⊕   ⊕ - +  + 执业药师 -   -

（三) 肥达(Widal)试验

【原理】

用已知的伤寒沙门菌O、H抗原和甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌、希氏沙门菌H抗原的诊断菌液与待检血清作定量凝集试验，以测定待检血清中有无相应抗体存在，作为伤寒、副伤寒诊断的参考，一般间隔5～7d重复采血检查，如抗体效价随病程进展而上升，即有诊断价值。

【材料】

1．伤寒沙门菌O、H抗原菌液，甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌H抗原菌液，生理盐水，待检血清。

2．试管、1ml吸管、试管架、37℃水浴箱等。

【方法】

1．取清洁试管32支，分成4排，每排8支，依次编号(表10-5)。

2．于试管内各加入生理盐水0.5ml。

3．在每排第1管各加1∶10的待检血清0.5ml，用1ml吸管吹吸数次，充分混匀，吸出0.5ml注入第1排第2管作对倍稀释，依次稀释至第7管，从第7管吸出0.5ml弃去，第8管为对照。同法将第2、3、4排依次作对倍稀释。

表10­-5  肥达氏反应操作程序  (单位：ml)

管  号1  2   3   4   5   6   7   8

生理盐水 0.5 0.5  0.5 0.5  0.5  0.5 0.5 0.5

1∶10待检血清  0.5 0.5  0.5 0.5  0.5  0.5 0.5  弃去0.5

诊断抗原 0.5 0.5  0.5 0.5  0.5  0.5 0.5 0.5

血清稀释度1:40   1:80 1:160  1:320   1:640  1:1280  1:2560   -

结 果

4．从第8管开始，从后向前，于第1排各管内加入伤寒沙门菌H抗原菌液0.5ml；于第2排各管内加入伤寒沙门菌O抗原菌液0.5ml；第3排各管分别加入甲型副伤寒沙门菌H抗原菌液0.5ml；第4排各管内分别加入肖氏沙门菌H抗原菌液0.5ml。

5．加完菌液，振荡试管架，混匀，置37℃水浴箱孵育16～18h后观察结果。

【结果】

凝集程度，以“+”多少表示。

+ + + +   最强，上液澄清，细菌全部凝集于管底。

+ + +  强，上液轻度混浊，细菌大部分凝集于管底。

+ +   中强，上清半混浊，细菌部分凝集。

+  弱，上液混浊，细菌少部分凝集。

-  不凝集，液体呈乳状与对照管相同。

效价判定：对照管均不发生凝集时，依次观察试验管。以使凝集呈“+ +”反应的血清最高稀释度为其凝集效价。

三、志贺菌属

志贺菌属(Shigella)是细菌性痢疾的病原菌，俗称痢疾杆菌。细菌由消化道侵人肠道，靠侵袭力和毒素致病，毒素入血可引起毒血症。

本菌属的形态特点为革兰阴性杆菌，无鞭毛，但菌体周围有菌毛。除宋内志贺菌个别菌株迟缓发酵乳糖外，均不分解乳糖。根据生化反应及抗原不同可分为四群：A群(痢疾志贺菌)，B群(福氏志贺菌)，C群(鲍氏志贺菌)，D群(宋内志贺菌)。目前，我国以福氏志贺菌最多见，宋内志贺菌逐年增多，其他较少见。

（一)形态与培养特性

【材料与方法】

1．痢疾杆菌革兰染色片。

2．痢疾杆菌普通琼脂平板，中国蓝平板，SS平板，EMB平板培养物。

【结果】

1．为革兰阴性杆菌，分散排列。

2．菌落特征，同伤寒沙门菌。

注：宋内志贺菌个别菌株可迟缓发酵乳糖，培养2～10d，菌落特点可接近大肠杆菌菌落特点。

（二)生化反应特性

【材料与方法】

1．葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵试验。

2．双糖铁培养试验。

3．吲哚试验。

【结果】

生化反应结果(表10-6)。

表10-6   痢疾杆菌糖发酵、双糖铁、吲哚试验结果

　　 细　菌   葡 乳 麦 甘 蔗   动力 H₂S  吲哚

痢疾志贺菌  　+  -  +  -  d  -   - 　d

福氏志贺菌  　+  -  +  +  d  - 　- 　d

宋内志贺菌  　+  ﹡ +  +   　+  -   -   　 -

注:  ﹡： 迟缓发酵；＋：产酸；－：不发酵；d：某些菌株阳性

四、粪便标本中致病性肠道杆菌的分离与鉴定

正常情况下肠道中有多种细菌寄生，包括大量的厌氧菌和大肠杆菌、变形杆菌、粪产碱杆菌等。本实验的目的主要是分离沙门菌属及志贺菌属中的某些致病菌。

【标本采集】

粪便中细菌极多，为此，粪便的微生物学检查常根据检验目的菌的不同而选择不同培养基或用适当方法处理，尽可能地抑制杂菌，以利于病原菌的检出。但并不是粪便标本的采集无须注意杂菌污染。若便器或标本盛器不洁而污染了变形杆菌，就可能影响病原菌的分离检出，甚至把污染菌误报造成误诊。

1．自然排便采集  自然排便后，挑取其脓血或粘液部分2～3g，液状粪便取絮状物2～3ml,置于灭菌容器内送检。

2．直肠拭子采集  如不易获得粪便时，或排泄困难患者及婴儿，可用直肠拭子采取。即用灭菌棉拭经生理盐水或甘油缓冲盐水湿润后，插入肛门内4～5cm(幼儿2～3cm)处，轻轻转动一圈拿出，插入灭菌试管内送检。

3．标本如不能立即送检，可将其保存于30％甘油缓冲盐水或专门运送培养基内。

【分离培养程序】

自粪便中分离培养细菌需连续4d进行试验(图10-1)。

粪便或直肠拭子  分离培养(SS、MAC)

 37℃、18～24h

  可疑菌落

  初步鉴定 (双糖铁/尿素培养基)

 系列生化反应

  最终鉴定——

 血清学鉴定

图10-1 粪便标本细菌学检查程序

第1日：

取粪便标本用SS平板作分区划线接种，37℃培养18～24h，观察菌落特征。

肠道致病菌不分解乳糖，所以在SS平板上生长的菌落为无色透明的小菌落。如能产生H₂S，则菌落中心呈黑色。大肠杆菌在SS平板上一般不生长，但如粪便标本接种得多，大肠杆菌量多所以仍有少数生长。大肠杆菌能发酵乳糖产酸，菌落呈红色，或菌落中心显红色，很容易和致病菌区分。

第2日：

观察SS平板上菌落，用接种针挑取可疑菌落分别接种于双糖铁—半固体培养基中、尿素培养基，37℃培养18～24h观察结果。

第3日：

观察半固体-双糖铁培养基结果。如果双糖铁培养基中乳糖不发酵，可能为肠道致病菌。根据葡萄糖发酵结果、运动力的有无等可初步判定为哪一类细菌。最后鉴定该菌尚需自双糖铁培养基上取材做以下试验。

1．革兰染色。

2．接种葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖单糖发酵管，蛋白胨水及其他培养基37℃培养18～24h。

3．选用已知抗血清作玻片凝集试验。

第4日：

表10-7  粪便中常见肠杆菌主要生化反应简明鉴定表

双  糖  铁   葡  乳  麦  甘  蔗  吲  甲  V  枸   尿

橼

上  下  硫  动  萄   芽  露基   酸

  化 

层  层  氢  力  糖  糖  糖  醇  糖  哚  红  P   盐   素

大 肠 杆 菌  ＋  ⊕ －  ＋  ⊕ ⊕  ⊕  ⊕ d   ＋  ＋  －  －   －

产 气 杆 菌  ＋  ⊕ －  ＋  ⊕ ⊕  ⊕  ⊕ ＋  －  －  ＋  ＋   －

普通变形杆菌 －  ⊕ ＋  ＋  ⊕ －  ＋  －  ＋  ＋  ＋  －  －   ＋

伤 寒 沙门菌 －  ＋  ＋  ＋  ＋  －  ＋  ＋  －  －  ＋  －  －   －

甲型副伤寒沙门菌   －  ⊕ d   ＋  ⊕ － ⊕  ⊕  －  －  ＋  －  －   －

肖 氏 沙门菌 －  ⊕ ＋  ＋  ⊕ － ⊕  ⊕  －  －  ＋  －  d －

希 氏 沙门菌 －  ＋  ＋  ＋  ＋  －  ＋  ＋  －  －  ＋  －  ＋   －

痢 疾 志贺菌 －  ＋  －  －  ＋  －  ＋  －  d   d   ＋  －  －   －

福 氏 志贺菌 －  ＋  －  －  ＋  －  ＋  ＋  d   d   ＋  －  －   －

鲍 氏 志贺菌 －  ＋  －  －  ＋  －  ＋  ＋  －  d   ＋  －  －   －

宋 内 志贺菌 ﹡  ＋  －  －  ＋  ﹡  ＋  ＋  ＋  －  ＋  －  －   －

注：﹡：迟缓发酵；＋：产酸；⊕：产酸产气；－：不发酵；d：某些菌株阳性

1．观察单糖发酵及其他培养基试验结果。

2．根据以上各试验结果，判定被检粪便中分离的肠道致病菌是哪一种细菌(表10-7)。

附录

1．SS琼脂平板

沙门志贺菌属琼脂(salmonella Shigella agar，简称SS agar)是一种用于沙门菌和志贺菌分离培养的选择鉴别培养基。由于有胆盐，能部分地抑制大肠杆菌生长，但能促进沙门菌、志贺菌生长的作用，有利于致病菌的分离。

成分：

蛋白胨5g

牛肉膏5g   基础培养部分

琼脂 18g

乳糖 10g   鉴别乳糖是否发酵

0.5%中性红水溶液   4.5ml

胆  盐  10g

枸橼酸钠  10～14g   抑制革兰阳性菌、大肠杆菌

0.1%煌绿水溶液 0.33ml

硫代硫酸钠   8.5～10g

枸橼酸铁　   0.5g 鉴别H₂S的产生

蒸馏水  1000ml

作用：

由于此培养基能抑制部分大肠杆菌生长，而对沙门菌和痢疾杆菌无影响，所以作分离培养时，标本的接种量可以大一些，有利于致病菌的分离。在此培养基上沙门菌、痢疾杆菌不发酵乳糖，为无色的小菌落，而大肠杆菌能发酵乳糖呈红色的菌落。

2．双糖铁—半固体培养基

双糖铁—半固体培养基是一种复合性的检查生化反应的培养基，可检查4种反应即葡萄糖、乳糖的发酵反应，是否产生H₂S，有无动力等(表10-8)。

成分：

下层： pH 7.6蛋白胨水  500ml

 葡萄糖1g

 琼 脂1.75g

 酚 红  0.012g

斜面： pH 7.6蛋白胨水  500ml

 硫代硫酸钠0.1g

 硫酸亚铁铵0.1g

 乳 糖5g

 琼 脂 6.5g

 酚 红  0.012g

表10-8  几种肠道杆菌在双糖铁一半固体培养基中的反应

作用：

一般认为沙门菌属和志贺菌属是主要的肠道致病菌。这两属细菌都能发酵葡萄糖，但一般不能发酵乳糖。与此相反，肠道条件致病菌中的大肠菌属和克雷伯菌属则能发酵乳糖，由此可见乳糖是否被利用是区别肠道致病菌和条件致病菌的关健。可利用双糖铁—半固体培养基初步鉴别肠道致病菌与非致病菌。