第十五章 临床前药物实验
第一节 药物半数致死量(LD50)的测定
【实验目的】
(1)掌握测定药物LD50的药理学方法，理解药物LD50测定的原理及意义。
(2)熟悉尼可刹米的毒性作用。
【实验原理】
1.LD50的概念：引起50%的实验动物死亡的药物剂量。
2.测定LD50的原理：药物的给药剂量与动物的死亡百分率间呈正态分布，以对数剂量为横坐标、死亡百分率为纵坐标作图，可得到一对称S型曲线；logLD50恰在横轴中点。据此，如果求出正态曲线横轴中点或正S型曲线中点，所对应的横轴上的值, 即为LgLD50。所以用数学方法，计算公式为：LD50= lg–1（ΣC/Σn)，其中n为各组实验动物数，C为各组的对数剂量与各组实验动物数n的乘积。
3.测定LD50的意义：LD50值常被选作反映药物毒性、评价药物安全性的指标。
4.尼可刹米产生毒性作用的原理：尼可刹米是一种中枢兴奋药，对呼吸中枢有直接的兴奋作用，其产生毒性并引起死亡的原因主要为惊厥、呼吸肌强直性痉挛和呼吸衰竭等。
【实验对象】
体重相近的健康小鼠20～30只，雌雄不限。
【实验药品与器材】
尼可刹米溶液、1ml注射器、针头、鼠笼、电子天平、苦味酸。
【实验观察指标】
实验动物死亡现象的判别和药物用量的记录。
【实验方法与步骤】
1.预实验
① 探索剂量范围：取小鼠12～16只，每组4只，选择一定浓度的尼可刹米溶液腹腔注射给药，观察动物10分钟内是否死亡，找出引起100%及0%死亡率所需药物的剂量范围Dm及Dn——如4只小鼠全部死亡则降低一半剂量，如4只小鼠全不死则增加一倍剂量,确定Dm值后按组间比1：2逐步降低剂量，直至确定出Dn。（此步骤在开课前由带教老师完成，参考值：Dm约为1750mg/kg，Dn约为600mg/kg)。
② 确定剂量组数，计算各组剂量并配制相应不同浓度的药液：实验动物以4～9个剂量组为宜，各组剂量按等比数列排列，组间的比值以0.70～0.85为宜，以Dm剂量配制最高浓度组药液，而以Dn剂量配制最低浓度组药液。注意：小鼠腹腔注射给药容量一般采用0.2ml/10g，应保证每剂量组每10g体重小鼠的用药容量相等。
2.正式实验
各组取体重相近的健康小鼠10只，称体重后分别作标记，将实验用不同浓度的尼可刹米系列药液观察实验动物按从高到低的顺序逐一用药；第一只动物用药后如死亡，下一只动物就降低一级剂量给药；相反，如果存活，下一只动物就提高一级剂量给药，依此类推，直至10只动物都做完为止。在表中记录时，动物死亡用“＋”表示，未死亡用“－”表示。若在同一剂量中连续出现“－”两次，则下一次实验结束，最后一只动物不做实验（根据上一个小鼠结果即可确定其所在的剂量组位置)，但在表格中占一个，用E表示。
表15-1尼可刹米半数致死量的测定结果
| 剂量 (D，mg/kg) | 剂量对数 （lgX) | 实验结果纪录 | 死亡数 (n1) | 存活数 (n2) | n (n1+n2) | C (n×lgX) |
| 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 | ||||||
| Σn= | ΣC= |
统计上表中的结果，带入下面公式中计算：LD50 = lg–1（ΣC/Σn)
【实验注意事项】
1.动物分组的随机性：各组动物在性别、体重等要保证均匀一致性；
2.腹腔注射的正确操作；
3.组间剂量等比设置。
4.尼克刹米溶液最好试验前新鲜配制
【思考题】
1. 用LD50评价药物的医学全.在线安全性有何缺点？
2. 评价药物的安全性的指标还有哪些
涂剑 谢志忠
第二节 不同给药途径对药物效应的影响
【实验目的】
（1)观察不同给药途径给予相同剂量的尼可刹米时，所引起药理作用量的差异。
（2)观察不同给药途径给予相同剂量的硫酸镁时，所引起药理作用质的差异。
【实验原理】
药物在机体内产生的药理作用和效应受药物和机体的多种因素影响，主要因素有药物方面、给药方法和机体这三大方面。凡能影响上述因素，都可影响药物作用。影响的结果表现为药动学差异和药效学差异，这两方面的差异均能导致药物反应的个体差异。个体差异在绝大多数情况下只是“量”的不同，即药物产生的作用大小或是作用时间长短不同；但有时药物作用出现“质”的差异，产生了不同性质的反应。
尼可刹米主要是直接兴奋延脑呼吸中枢，也可刺激颈动脉体和主动脉体化学感受器，反射性兴奋呼吸中枢，并能提高呼吸中枢对CO2的敏感性，使呼吸频率加快，呼吸深度加深，通气量增加，呼吸功能改善。但剂量过大亦可致血压升高、心动过速、肌震颤及僵直等，中毒时可出现惊厥。
Mg2+与Ca2+ 化学性质相似，可以特异地竞争Ca2+受点，拮抗Ca2+的作用，抑制神经化学传递和骨骼肌收缩，从而使肌肉松弛。过量时，引起呼吸抑制、血压骤降以致死亡。口服硫酸镁则不易吸收，导致肠道内的高渗状态，阻止肠内水分的吸收，引起容积性导泻作用。
实验采用给药途径的不同，用于小鼠体内观察药物作用的差异。即本实验通过观察不同给药途径给予相同剂量的尼可刹米后引起小鼠药理作用出现量的变化，及不同给药途径给予相同剂量的硫酸镁后www.med126.com引起小鼠药理作用出现质的差异，了解不同给药途径对药物作用起效时间及作用强度和性质的影响，深刻理解影响药物作用的因素和合理用药的相关知识。
【实验对象】
小鼠5只，体重20 ~30 g，雌雄不拘。
【实验药品与器材】
2%尼可刹米溶液，5％硫酸镁溶液。
1ml注射器、针头、小鼠灌胃针头、鼠笼、普通天平。
【实验观察指标】
动物活动变化、呼吸频率、幅度、反射活动变化、震颤、惊厥及死亡时间等。
【实验方法与步骤】
（1)取健康小鼠3只，称体重后分别作标记，然后观察正常活动情况，再依次给予尼可刹米，并密切观察小鼠反应。
甲鼠以灌胃法给予尼可刹米（4 mg／10 g)；乙鼠皮下注射尼可刹米（4 mg／10 g)；丙鼠腹腔注射尼可刹米（4 mg／10 g)。
每次给药后立即记下当时时间，并分别置于鼠笼中，密切观察3只小鼠的反应。
动物首次出现惊厥时，也立即记下时间，从给药到首次出现惊厥的一段时间为药物作用的潜伏期，记录结果，并比较有何不同。
将实验结果填入表15-2中
表15-2 尼可刹米不同途径给药对小鼠惊厥潜伏期的影响
| 鼠号 | 体重(g) | 给药量（ml) | 给药途径 | 潜伏期 | 最后结果 |
| 甲 乙 丙 |
（2)取家兔2只，称体重后分别作标记，然后观察正常活动情况，再按下述方法分别给予硫酸镁溶液，并密切观察家兔反应。
甲兔通过灌胃给予5％硫酸镁溶液800mg／kg体重，乙兔耳缘静脉注射5％硫酸镁溶液175mg/kg体重。分别置于兔笼中，观察2只家兔表现，记录结果，并比较有何不同。
当家兔出现明显呼吸抑制时，迅速耳缘静脉注射2.5％CaCl2溶液2mg/kg体重，观察症状的变化。
将实验结果填入表15-3中
表15-3 硫酸镁不同给药途径对药物效应的影响
| 鼠号 | 体重(g) | 剂量 | 给药途径 |
肌张力 呼吸 肌张力 呼吸 | CaCl2 解救结果 |
| 甲 乙 |
【实验注意事项】
（1)给小鼠灌胃时，动作要轻柔，以免损伤口腔及食道粘膜。
（2)表“15-2”最后结果栏记录是否死亡以及从给药高死亡相隔时间。
【思考题】
不同给药途径在哪些情况下使药物的作用产生质的不同?在哪些情况下则使药物的作用只产生量的不同？为什么？
（郭紫芬 谢志忠)
第三节 磺胺类血浆药物浓度半衰期测定
【实验目的】
（1)掌握t1/2比色测定法。
（2)了解药物血浆t1/2、生物利用度和表观分布容积等概念。
（3)学会绘制药物时—量曲线。
【实验原理】
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血浆药物浓度半衰期是指血浆药物浓度下降一半所要的时间。临床上多数药物在体内按一级代谢动力学的规律而消除，也就是血浆中药物消除速率与瞬时药物浓度成正比，根据这一规律可知：药物静脉注射后，如以血浆药物浓度的对数值为纵坐标，时间为横坐标，其时量关系常呈直线。
该直线的方程式为： ①
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药物血浆浓度半衰期（t1/2)为： ②
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因此，我们只要求出药物的消除速率常数Ke，就可以得出药物的血浆半衰期。
由公式（1)可推出 ③
只要我们测出消除相任意两个时间的血浆药物浓度，又知道这两个浓度变化的时间间隔，就可以求出Ke，进一步可计算出血浆药物浓度的半衰期。
以临床上常用的抗菌药——磺胺类药物为例：磺胺类药物在酸性溶液中，可使苯环上的氨基（-NH2)离子化生成铵类化合物（-NH3+)，进而与亚硝酸钠起重氮反应，产生重氮盐（-N=N+-)。此重氮盐在碱性溶液中与酚类化合物如麝香草酚起偶联反应，生成橙红色的偶氮化合物，由此可见，偶氮染料的显色深浅与磺胺的浓度有关。故可用分光光度计测出其光密度，通过与标准品光密度的比较及运算，即可推算出磺胺的浓度。
具体反应方程式如下：
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计算公式如下：
【实验对象】
家兔，体重2～3kg，雌雄不拘。
【实验药品与器材】
723型分光光度计、离心机、手术器械一套、注射器、2号注射针头、动脉插管、动脉夹、微量定量移液器、试管架、大号试管、吸管、洗耳球。
3％戊巴比妥钠、125单位/ml 肝素生理盐水、20％磺胺嘧啶钠（SD)、6％三氯醋酸、0．5％亚硝酸钠、0．5％麝香草酚氢氧化钠溶液。
【实验观察指标】
吸光度值。
【实验方法与步骤】
1、标准曲线的制备。
（1)SD标准液配制
a．取20％SD溶液2.56 ml置于200 ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，此浓度即256 mg／100m1。
b．取上述浓度为256mg／100 m1 SD溶液100ml倍比稀释，分别获得128 mg／100 m1、64 mg／100 m1、32 mg／100 m1、16 mg／l00 m1、8 mg／100 m1 SD溶液。
（2)取试管7支，编号。每支试管内加6％三氯醋酸7.8ml，再分别加入不同浓度的SD标准液０.2 m1(6支内)，另1支加入0.2mI蒸馏水。贴上标签、混匀。
（3)再取试管7支，编号。按表15-4依次加入各种溶液后充分摇匀。
表15-4 标准曲线的制备
| 7 空白 | 6 （8 mg/ 100 ml) | 5 (16 mg/ 100 ml) | 4 (3 2mg/ 100 ml) | 3 (64 mg/ 100 ml) | 2 (128 mg/ 100 ml) | 1 (256mg/100 m1) | |
| ②步中标准液（ml) ②步中蒸馏水（ml) 0.5%亚硝酸钠（ml) 0.5%麝香草酚（ml) | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 |
（4)用723型分光光度计比色，选择520nm波长，读出各试管光密度。
（5)以SD浓度为横坐标，光密度为纵坐标作标准曲线。
2、血标本制备
取家兔一只，称重，3％戊巴比妥钠1 ml／kg耳缘静脉注射麻醉，将麻醉后家兔固定于兔手术台上，施颈部切开术，分离颈总动脉并插管以备取血标本时用。耳缘静脉注射0.5％肝素1 m1／kg，5分钟后放血0.5 m1，同时注入20％SD溶液2 m1／kg。分别于给药后的第0、5、10、20、30、40、60分钟时放血0.5 m1。
取离心管8支，加入6％三氯醋酸7.8m1，然后从0.5m1各血样本中准确吸取0.2ml于离心管，混匀，离心(1500转，5分钟)，分别取上清液于另外8支试管中，待用。
3、 比色测定
按表15-5依次加入各种溶液后充分摇匀。用723型分光光度计进行比色，选择520nm波长，以空白管调零，读出吸光度(A)值，带入标准曲线计算出药物的相应血药浓度。将结果填入表15-6
表15-5 SD显色反应体系
| 空白管 | 待测管 | |
| 1 2 3 4 5 6 7 | ||
| 给药前上清液(m1) 给药后上清液(m1) 0.5％亚硝酸纳(m1) 0.5％麝香草酚(m1) | 3 1 2 | 3 1 2 |
表15-6 给药后不同时间兔血SD浓度
| 0′ | 5′ | 10′ | 20′ | 30′ | 40′ | 60′ | |
| 光密度(A) 浓 度(C) 浓度对数(lgC) |
4、以时间为横坐标，血药浓度的对数为纵坐标，绘制t—lgc曲线。
5、计算
|
t1/2=
|
（2)按下式计算表观分布容积：Vd =
|
【实验注意事项】
1．给SD时一定要注入静脉内，若注射至皮下将会影响t1／2测定。
2．每次取血前先将插管中残血放掉。
3．每吸取一个血样时，必须更换吸嘴。
4. 表8－4中操作程序不得颠倒，每次加试剂后必须混匀后方可加入下一种试剂。
5．采血时间不准时，应记录实际时间。
6．血液加到装三氯醋酸试管内立即摇匀，否则易出现凝血块。
【思考题】
1．试述t1／2、Vd、F的定义和意义。
2. 计算血浆药物浓度半衰期时是否是从t—lgc曲线上任意取两点?
3．某药的最低有效血浓度为2.0 mg/100 m1，t1／2为10.7小时。测得患者血药浓度4.7 mg/100 m1，试问尚能保持有效浓度几小时？（计算公式Ct＝Co×0.5t/t1 / 2)
（郭紫芬 廖端芳)
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动物反应.gif)