第十章 高效液相色谱法
第一节 概述
高效液相色谱法（high performance liquidchromatography, HPLC)是以高压输出的液体为流动相的色谱技术。高效液相色谱法是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱的理论和实验方法而发展起来的一种分离分析方法。
一、高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法以经典液相色谱法为基础，但又不同于经典液相色谱法。与经典液相色谱法相比，具有如下特点：
1.高效 由于使用了极细颗粒的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱的分离效率极高，柱效可达每米105理论塔板数。
2.高速 由于采用高压泵输送流动相，使流动相流速大大加快，流速最高可达10 ml/min，完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱法快得多。
3.高灵敏度 紫外、荧光、电化学以及质谱等高灵敏度检测器的使用，使高效液相色谱的检测限可达10-9～10-11 g。
4.高自动化 智能化的色谱专家系统结合自动进样装置，使高效液相色谱从进样、分离、检测、数据采集、数据处理，一直到结果打印完全自动化。
高效液相色谱法是在气相色谱法的理论和实验技术基础上发展起来的，与气相色谱法相比较，具有如下优点：
1.应用范围广 高效液相色谱法与气相色谱法相比，具有应用范围更广的优点。它可用于高沸点、相对分子量大、热稳定性差的有机化合物以及各种离子的分离分析。只要把样品制成溶液便可进行分析，特别是一些生物大分子，如多肽、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、脂类、维生素等，都可用高效液相色谱法进行分析。
2.选择性高 气相色谱法采用的流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即流动相和组分不发生相互作用，仅起载带作用。高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，对组分有不同的亲和力，参与对组分的分配作用。流动相对分离效果影响很大，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大的方便。因此，它不仅可以利用被分离组分的极性、分子尺寸、离子交换能力以及生物分子间亲和力的差别进行分离，还可通过改变流动相的组成来改善分离效果，使得性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。
3.气相色谱一般都在较高温度下进行，且对控温要求比较高，而高效液相色谱则经常在室温条件下进行，且对控温的要求也不高。
4.高效液相色谱法的馏分易于收集，更有利于制备。
高效液相色谱的主要缺点是：仪器比较昂贵；缺乏通用的高灵敏度检测器；分析周期较长；柱和流动相的消耗成本高；有机溶剂会造成环境污染，危害操作人员的健康。
二、高效液相色谱法的分类
高效液相色谱法的分类与经典液相色谱法的分类相同。
按固定相的物理状态可分为液-液色谱法和液-固色谱法两大类。
按分离原理可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、化学键合相色谱法以及胶束色谱法（micelle chromatography，MC)等。
近年来，高效液相色谱法发展迅猛，许多新方法不断涌现，又出现了一些其它的分类方法。如根据固定相和流动相相对极性的大小，液液分配色谱法又可分为正相液液分配色谱法（normal-phase liquid-liquidpartition chromatography，NLLC)和反相液液分配色谱法（reversed-phase liquid-liquid partition chromatography，RLLC)，而后者又可进一步分为普通反相液液分配色谱法、离子对色谱法（ion pair chromatography，IPC)和离子抑制色谱法（ion suppression chromatography，ISC)。
第二节 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪主要由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统等五部分组成。高档的高效液相色谱仪还配有梯度洗脱、柱温箱及自动进样器等辅助装置。高效液相色谱仪的结构示意图如图10-1所示。
图10-1 高效液相色谱仪结构示意图
高效液相色谱仪的工作流程如下：贮液器中的流动相在高压泵作用下经由进样器进入色谱柱，然后从检测器流出。待分离试样由进样器注入，流过进样器的流动相将试样带入色谱柱中进行分离，分离后的各组分依次进入检测器，检测器将被分离组分浓度的变化转变为电信号，进而由数据处理系统将数据采集、记录下来，得到色谱图。
一、高压输液系统
高压输液系统一般由贮液器、脱气装置、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻尼器以及梯度洗脱装置等组成，其中高压输液泵是核心部件。
1.贮液器 贮液器用来贮存流动相，其材料对流动相是化学惰性的。常用的材料为玻璃、不锈钢或表面涂聚四氟乙烯的不锈钢等。为防止长霉，贮液器中的流动相要经常更换，并经常清洗贮液器。
2. 过滤和脱气装置 流动相和样品溶液的过滤非常重要，以免其中的细小颗粒堵塞色谱柱、毛细管以及影响高压输液泵的正常工作。流动相在使用前应根据其性质选用不同材料的滤膜过滤，一般选用市售的0.45mm的水性和油性滤膜进行过滤，水用水性滤膜过滤，甲醇等有机溶剂用油性滤膜过滤。样品溶液一般用市售的0.45mm针形滤器过滤。另外，在流动相入口、泵前、泵和色谱柱间都配置有各种各样的滤柱和滤板。
流动相进入高压泵前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如O2)，防止流动相由色谱柱进入检测器时因压力降低而产生气泡，增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。如果使用荧光检测器，溶解氧还可能造成荧光猝灭。
常用的脱气方法有：
（1)低压脱气法：低压脱气法又称真空脱气法，即通过抽真空除去溶液中的气体。减压过滤，也具有除去部分气体的作用。但由于抽真空会导致溶剂的蒸发，对二元或多元流动相的组成会有影响。
（2)吹氦脱气法：氦在大多数溶剂中的溶解度极低，因此用氦气鼓泡来除去流动相中溶解的气体。该法使用方便、脱气效果好，但氦气较贵。
（3)超声波脱气法：将贮液器置于超声波清洗槽中，以水为介质，超声脱气。此法操作简便，为大多数用户采用，但脱气效果不理想（脱气效率约30%)。
（4)在线脱气：目前，许多高档的高效液相色谱仪都配备了在线脱气装置。在线脱气装置可以连续不断地从流动相中除去溶解的气体，消除流动相的不稳定因素、降低基线漂移及噪音，从而消除了氧对电化学、荧光和紫外检测的干扰。这种脱气方法，效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。
3. 高压输液泵 高压输液泵（high pressure pump)的作用是提供足够恒定的高压，使流动相以稳定的流量快速通过固定相。一个好的高压输液泵应符合下列要求：① 密封性好，耐腐蚀；② 有足够的输出压力，使流动相能顺利通过色谱柱；③ 输出压力平稳，脉冲小；④ 输出流量恒定，可调范围宽；⑤ 泵室体积小（＜0.5 ml)，易于清洗，便于迅速更换溶剂。
高压输液泵按输液性质可分为恒压泵和恒流泵两种。按工作方式又可分为隔膜泵、气动放大泵、螺旋注射泵和往复柱塞泵。其中，隔膜泵和气动放大泵为恒压泵，螺旋注射泵和往复柱塞泵为恒流泵。恒压泵的特点是：在操作过程中保持输出压力恒定，但其流量随色谱系统阻力变化而变化。恒流泵的特点是：在一定的操作条件下，输出的流量保持恒定，不受色谱柱阻力和流动相黏度等变化的影响。目前高效液相色谱仪广泛采用的是柱塞往复泵，其结构如图10-2所示。这种泵的泵室体积小，一般只有几毫升，易于清洗和更换溶剂，适合于梯度洗脱操作。缺点是输出液流脉动大，需要外加脉动阻尼器。
图10-2 柱塞往复泵示意图
4.梯度洗脱装置 梯度洗脱（gradient elution)是利用两种或两种以上的溶剂，按照一定的时间程序连续或阶段地改变溶剂的比例，从而改变流动相的极性、离子强度或pH值等，改善分离效果的一种方法。梯度洗脱对分离组分复杂、容量因子k范围很宽的样品非常重要。高效液相色谱法中的梯度洗脱与气相色谱法中的程序升温非常类似，两者都是为了使样品的各种组分均在最佳容量因子值范围内流出色谱柱，从而达到改善峰形、缩短分析时间和提高分离效果的目的。在等温或等度洗脱（isocratic elution)情况下，或者由于保留时间过短而造成色谱峰拥挤、重叠，或者由于保留时间过长而造成色谱峰扁平、宽大，分离效果不好；而在程序升温或梯度洗脱情况下，各组分均能达到良好分离。
梯度洗脱装置一般都采用微型计算机控制，可分为如下两类。
（1)高压梯度洗脱装置：高压梯度又称内梯度。采用的是先加压后混合的方式，即用几台高压泵将不同的溶剂，按程序规定的流量比输入混合室，再使之进入色谱柱。其特点是流量精度高、洗脱曲线重复性好、输液系统中不易产生气泡。
（2)低压梯度洗脱装置：低压梯度又称外梯度或泵前混合。早期的低压梯度装置是常压下在容器中将溶剂按不同的比例混合，然后再由高压泵输入色谱柱。其优点是操作简单，比例准确，价格便宜；缺点是更换流动相比例不方便，溶剂消耗量大，自动化程度不高。目前许多仪器所用的低压梯度洗脱装置是四元梯度泵，该装置可进行二元、三元、四元梯度，电磁阀的开关频率由控制器控制，改变控制程序即可得到任意组成的流动相。该装置洗脱重现性好，精度高，仪器组合简单，一个泵即可进行梯度洗脱，但溶剂在混合前必须高度脱气。一般采用四元梯度泵的仪器都配有自动脱气系统。
二、进样系统
进样系统是将样品溶液导入色谱柱的装置。在高效液相色谱法中，对进样装置的要求是具有良好的密封性和重复性，死体积小。常用的进样方式有注射器进样和六通阀进样两种。前者与气相色谱法类似，进样时用微量注射器刺穿进样器的弹性隔膜将样品注入色谱柱。其优点是装置简单、价廉、死体积小。缺点是隔膜的穿刺部分在高压情况下容易漏液，而且进样量有限，重现性差，有时需停泵进样。目前普遍采用是六通阀进样，如图10-3所示。
图10-3 六通阀进样示意图
在“装样”位置，用注射器将试样注入到六通阀的样品定量管中，此时流动相不通过样品管。然后转动六通阀手柄至“进样”位置，试样即随流动相进入色谱柱中。此法的优点是进样时可保持系统的高压，进样方式简便、易操作，而且由于进样量可由定量管的体积严格控制，进样准确，重现性好，自动化程度高，适于作定量分析。
目前，许多高效液相色谱仪配有自动进样装置。自动进样装置是由计算机自动控制进样阀，取样、进样、复位、清洗和样品盘的转动全部按预定的程序自动进行。自动进样重现性好，适合大量样品分析，节省人力，可实现自动化操作。目前比较典型的自动进样装置有圆盘式和链式两种。
三、分离系统
分离系统包括色谱柱、柱温箱及连接管等。
色谱柱是高效液相色谱仪的心脏部件，高性能的色谱柱是建立稳定、重现分析方法的根本。高性能的色谱柱与固定相本身的性能、柱结构、装填和使用技术等有关。色谱柱由柱管和固定相组成。色谱柱分为分析型和制备型两类。分析型色谱柱长10～25 cm，内径4～5 mm，制备型色谱柱长10～30 cm，内径20～40 mm。
操作技术对柱效以及柱的寿命影响非常大，使用时必须注意：样品最好用针形滤器过滤，或尽可能通过萃取或吸附等手段除去杂质；流动相的pH值应控制在色谱柱所允许的范围内，一般为3～8之间；更换流动相时，应根据流动相的性质选择合适的溶剂冲洗仪器及色谱柱，防止流动相相互不溶，使盐析出，堵塞柱子；实验完毕，应选用适当的溶剂冲洗柱子，尤其是流动相含有盐时，应先用水冲洗，再用有机溶剂（甲醇或乙腈)冲洗。
为了保持色谱柱的性能，通常在分析柱前要使用一个短的保护柱（又称预柱)。一般保护柱内的填料与分析柱中的固定相一致，这样不仅可以将样品和流动相中的有害污染物保留，以延长柱子的寿命，而且在液-液色谱中，还可以使洗脱液在经过保护柱时就被固定相饱和，使分析柱内不产生固定液流失。
高效液相色谱分析通常在室温下进行，但由于柱温对组分的保留值有一定影响，所以高档的仪器一般都配有柱温箱，以保证分析时温度恒定。
四、检测系统
检测系统的关键部件是检测器。检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转变为可供检测的信号。高效液相色谱仪的检测器种类很多，按其应用范围可分为通用型和专用型（选择性)两大类。
通用型检测器，又称总体性质检测器（bulk property detector)，其响应值取决于流出物（包括试样和流动相)总的物理或物理化学性质的变化。属于这类检测器的有示差折光检测器、电导检测器。这类检测器测量的是任何液体都共有的物理量，所以应用范围广。但是由于它对流动相本身有响应，因此容易受温度变化、流量波动以及流动相组成等因素的影响，造成较大的噪声和漂移，灵敏度较低，不适于痕量分析，并且不能用于梯度洗脱。
专用型检测器，又称溶质性质检测器（solute property detector)，其响应值取决于流动相中被分离组分的物理或物理化学性质。属于这类检测器的有紫外、荧光、化学发光、电化学检测器等。因为这类检测器仅对某些被测物质响应灵敏，而对流动相本身没有响应或响应很小，所以灵敏度高，受外界影响小，并且可用于梯度洗脱。
（一)紫外-可见检测器
紫外执业兽医-可见检测器（ultraviolet-visibledetector，UVD或UV)是高效液相色谱仪应用最广泛的检测器，是一种选择性检测器，其特点是灵敏度高，噪声低，线性范围宽，基线稳定，重现性好，对流量和温度变化不敏感，适用于梯度洗脱，不破坏样品，能与其它检测器串联。
紫外-可见检测器的工作原理和结构与一般的紫外-可见分光光度计一样，所不同是将样品池改为体积很小（5～12 µl)的流通池，以对色谱流出样品进行连续检测。
紫外-可见检测器可分为固定波长型和可调波长型两类。固定波长型检测器因使用受到限制，已基本被淘汰；可调波长型紫外-可见检测器是以钨灯和氘灯作为光源，检测波长从190～800 nm连续可调，样品可以选择在最大吸收波长处进行检测。因此，该类检测器应用广泛。需要注意的是检测器的工作波长不能小于所使用流动相溶剂的截止波长。
二极管阵列检测器（diode array detector，DAD)是最有发展前途的高效液相色谱检测器，属于多波长快速扫描紫外-可见检测器。它采用光电二极管阵列作为检测元件，构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接收器上的全部波长的光信号，然后对二极管阵列快速扫描采集数据，经计算机处理，获得定性定量色谱-光谱信息，主要特点为：在一次进样后，可同时采集不同波长下的色谱图，因此可以计算不同波长的相对吸收比；可提供每一色谱峰的UV-Vis光谱，因而有利于选择最佳检测波长，用于最终建立高效液相色谱分析方法；检查色谱峰各个位置的光谱，可以评价色谱峰纯度。如果色谱峰为单一成分，色谱峰各点的光谱应重叠；在色谱运行期间可以逐点进行光谱扫描，得到以时间-波长-吸光度为坐标的色谱-光谱三维图（图10-4)，由于每个组分都有全波段的吸收光谱图，因此，可利用色谱保留值规律及吸收光谱综合进行定性分析。
（二)荧光检测器
图10-4 色谱-光谱三维图
荧光检测器（fluorescence detector，FD)的检测原理及仪器结构与荧光分光光度计相同，可对具有荧光特性的样品进行定量检测。荧光检测器的特点是：灵敏度更高，比紫外-可见检测器高1～3个数量级，检测限可达10-12～10-13 g/ml，是痕量分析的理想检测器；对温度和流动相流速的变化不敏感；可以进行梯度洗脱。
荧光检测器不如紫外-可见检测器应用广泛，主要原因是能产生荧光的化合物不多。但是，生物领域中的许多物质，如氨基酸、胺类、维生素、甾类化合物、某些药物、代谢物等具有荧光，可用荧光检测。尽管有些化合物本身没有荧光，但可通过衍生化反应生成荧光衍生物进行测定。
荧光检测器同可调波长紫外-可见检测器一样，也有多通道检测器，具有程序控制多波长检测、自动扫描功能。光导摄像管和光电二极管阵列检测器也应用于荧光检测器，通过计算机处理，可获得荧光强度-发射波长-时间的三维色谱-荧光光谱图。
新型的激光诱导荧光检测器（laser induced fluorescencedetector，LIF)已用于超痕量生物活性物质和环境有机污染物的检测，灵敏度可达10-9～10-12 mol/L。
（三)示差折光检测器
示差折光检测器（differential refractive indexdetector，DRID)是一种通用型检测器，它是利用纯流动相和含有被测组分的流动相之间折光率的差别进行检测的。几乎所有物质对光都有各自不同的折射率，因此，这种检测器可检测一定浓度的所有化合物。但是，由于DRID需严格控制温度，流动相中溶解的气体对信号有影响，灵敏度不高，不能用于梯度洗脱等原因，限制了它的使用。
（四)电化学检测器
电化学检测器（electrochemical detector，ECD)种类较多，有电导、库仑、伏安、安培等检测器。最常用的是安培检测器和电导检测器。安培检测器是在一定外加电压下，利用被测物质在电极上发生氧化还原反应引起电流变化进行检测，它是一种选择性检测器。而电导检测器是基于物质在介质中电离后所产生的电导变化进行检测。
ECD具有与荧光检测器同样的优点：高灵敏度和高选择性。缺点是：要求高纯度溶剂，流动相具有导电性，对流速、温度、离子强度、pH值等敏感，电极表面可能发生吸附、催化等，影响电极的性能和寿命。
近年来，多通道EC阵列检测器已面世，色谱流出峰的电位-电流数据可在很短的时间窗中产生。与DAD提供的化合物的光谱相似，EC阵列检测器可提供化合物的电化学曲线，用于化合物鉴别和纯度测定。
（五)化学发光检测器
化学发光检测器（chemiluminescence detector，CLD)是一种高选择性和高灵敏度的检测器。其原理是基于某些物质在常温下进行化学反应，生成处于激发态的反应中间体或反应产物，当它们从激发态回到基态时，能量以光的形式释放。由于物质激发所需的能量来自化学反应，所以叫做化学发光。当被测组分从色谱柱流出后，立即与化学发光试剂混合，发生化学反应，产生激发态中间体或产物，进而产生辐射，其辐射强度与被测组分的浓度成正比。这种检测器不需要光源，也不需要复杂的光学系统，只要一个恒流泵将化学发光试剂以一定的流速泵入混合器中，使之与柱流出物迅速而均匀地混合发生化学发光，再通过光电转换装置将光信号变成电信号，即可进行检测。
化学发光检测器和荧光检测器均是发光检测器，不同的是前者是由化学反应产生激发中间体或产物，不需要激发光源。化学发光检测器的灵敏度较荧光检测器的灵敏度更高，主要用于痕量分析。缺点是系统的复杂性及耐用性不佳，流动相和反应介质的要求常有矛盾，使色谱方法的建立复杂化。
（六)蒸发光散射检测器
蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector，ELSD)是一种通用型检测器，对任何组分响应无歧视。其工作原理是经色谱柱分离的组分随流动相进入雾化室，被高速气流（氦、氮或空气)雾化，然后进入蒸发室，在蒸发室中流动相被蒸发除去，不挥发的待测组分在蒸发室内形成气溶胶，然后进入检测室。用一定强度的入射光（白炽灯、卤钨灯或激光光源)照射气溶胶而产生光散射，测定散射光，其强度与待测成分的浓度有关。
理论上，蒸发光散射检测器可用于测定挥发性低于流动相的任何样品组分，但由于它对有紫外吸收的样品组分检测灵敏度较低，且不能用含缓冲盐的流动相，因而主要用于测定糖、高分子化合物、高级脂肪酸、糖苷等几十类化合物。
五、数据处理系统
早期，高效液相色谱是通过记录仪绘制谱图，人工计算峰高或峰面积获得分析结果的，十分麻烦。后来，有了积分仪，可以自动打印峰高、峰面积、保留时间以及进行一些简单的计算，但不能进行数据和图谱的贮存及再处理。现在广泛使用色谱工作站记录和处理色谱分析数据。工作站的功能非常强大，主要包括如下内容：
1. 自诊断功能 工作站程序可以自动智能诊断硬件。
2. 智能控制功能 流动相流量、梯度洗脱程序、检测波长、流动相剩余体积等操作参数的设定，泵和检测器等的开、关都可以通过工作站实现。
3. 数据实时采集和图谱处理功能 所有的色谱工作站都有这种功能。分在线和离线两种方式。在线方式包括数据的实时采集、色谱图的绘制、数据处理及分析结果输出等；离线方式主要是数据和图谱的再处理。利用数据实时采集功能可以获得色谱图、各个色谱峰的参数以及根据色谱峰的参数计算出的柱效、分离度、Kovats保留指数、拖尾因子等；利用图谱处理功能对图谱进行放大、缩小、峰形处理、多谱图比较等。还可以按归一化、内标法和外标法等进行定量分析。数据可与Microsoft Excel、Word等软件共享，谱图可与Photoshop、CorelDraw等图像软件共享。
4. 进行计量认证的功能 工作站贮存有对色谱仪性能进行计量认证的专用程序，可对流动相流量精度、检测波长校正等进行监测，并可判定是否符合计量认证标准。
5. 多台仪器控制功能 有些工作站可控制多套高效液相色谱系统，从方法的设定、运行到结果输出全部由工作站完成，并可连接局域网或互连网进行数据传输及仪器远程诊断。
色谱数据工作站的出现不仅大大提高了色谱分析工作的速度，同时也为色谱分析的理论研究、新分析方法的建立创造了有利条件。
第三节 影响色谱峰展宽的因素及分离条件的选择
一、影响色谱峰展宽的因素
在高效液相色谱中影响色谱峰展宽的因素，可归纳为柱内因素和柱外因素两类，下面分别予以介绍。
（一)影响柱内展宽的因素
高效液相色谱法是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱法的理论和实验方法而发展起来的一种分离分析方法。因此，色谱分析法概论和气相色谱法中介绍的基本概念和基本理论，如保留值、分配系数、分离度、塔板理论、速率理论以及定性定量方法等同样适用于高效液相色谱法。但是由于气相色谱与高效液相色谱两种方法的流动相不同，因而在研究分离过程中各动力学因素对色谱峰展宽（或柱效)的影响时，必须考虑气体和液体之间在黏度、扩散系数等方面的差异。Giddings和Snyder等人在Van Deemeter方程的基础上，根据液体和气体的性质差异，提出了液相色谱速率方程，即Giddings方程式
（10-1)
式中，He为涡流扩散项，同Van Deemeter方程中的A项；Hd为纵向扩散项，同Van Deemeter方程中的B/
1. 涡流扩散项 该项含义与气相色谱相同。由于高效液相色谱采用了比气相色谱粒度更小、更均匀的球形固定相，故涡流扩散项很小。
2. 纵向扩散项 纵向扩散项是由于组分分子在柱内存在浓度梯度而引起的。
（10-2)
式中，Dm为被分离组分分子在流动相中的扩散系数。Dm 与流动相的粘度（h)成反比，与温度成正比。由于流动相为液体，其黏度比气体大得多，柱温又比气相色谱低得多（HPLC多采用室温)，因此，组分分子在液相中的Dm比其在气相中的Dm小4～5个数量级，而高效液相色谱中流动相的流速u又比较高，所以纵向扩散项在高效液相色谱中很小，它对柱效的影响可以忽略不计。
3. 传质阻力项 传质阻力（mass transfer resistance)是由于组分在两相间的传质过程不能瞬间达到平衡而引起的。与气相色谱不同，在高效液相色谱中传质阻力包括固定相传质阻力（Hs)、动态流动相传质阻力（Hm)和静态流动相传质阻力（Hsmu)三项。
（1)固定相传质阻力：主要发生在分配色谱中，与气液色谱中液相传质阻力相同。由于进入固定液中的分子相对于未进入固定液的分子在流动相中滞后所致。Hs取决于固定液液膜的厚度df和组分分子在固定液中的扩散系数Ds，即
（10-3)
式中，Cs为与容量因子k 有关的常数。
在填充气相色谱柱中，固定液的传质阻力起决定作用。而在高效液相色谱中，只有在使用厚涂层、并具有深孔的固定相时，Hs才是主要的。由于在高效液相色谱中通常采用化学键合固定相，“固定液”只是键合在载体表面的单分子层。因此，固定液的传质阻力可以忽略。
（2)动态流动相传质阻力：当流动相携带试样分子流经色谱柱时，靠近固定相表面的流动相流速缓慢，而流路中心的流动相流速较快，使得处于流路边缘的分子迁移速度比处于流路中心的分子慢，从而引起色谱峰www.lindalemus.com/rencai/展宽，见图10-5（a)。这种影响引起板高的变化与流动相的平均线速度u、固定相粒度dp的平方成正比，与组分分子在流动相中的扩散系数Dm成反比。
（10-4)
式中，Cm为一常数。
图10-5 流动相的传质阻力示意图
（a)动态流动相的传质阻力 （b)静态流动相的传质阻力
（3)静态流动相传质阻力：由于固定相的多孔性，会使部分流动相滞留在微孔内静止不动。由于孔有一定的深度，且深度各不相同，当组分分子进入孔中的静态流动相时，组分分子扩散到孔中的深浅各不相同，因此回到动态流动相的先后也不相同，从而引起色谱峰展宽，见图10-5（b)。固定相的微孔越小越深，传质阻力就越大，对峰展宽的影响也就越大。这种影响在整个传质过程中起主要作用。
（10-5)
式中，Csm为一常数。
气相色谱主要考虑固定相的传质阻力，而高效液相色谱则主要考虑流动相的传质阻力，尤其是静态流动相的传质阻力在整个传质过程中起主要作用。因此，改进固定相的结构，减小静态流动相的传质阻力是提高高效液相色谱柱效的关键。
综上所述，对于高效液相色谱，由于Hd可以忽略不计，则式10-1为
（10-6)
或简化为：
（10-7)
测定不同流速下的板高，以板高H对流速u作图，可得H-u曲线。比较GC和HPLC的H-u曲线（见图10-6)，可见两者有明显的不同。尽管高效液相色谱的H-u曲线也有最佳流速，但因为其太低，在实际的操作条件下很难达到，因此，高效液相色谱塔板高度和流动相流速的关系就成为式10-7所表示的线性关系，即流速增大，板高增加，柱效降低。
图10-6 GC和HPLC的H－u曲
（二)影响柱外展宽的因素
柱外展宽的原因很多，主要是由低劣的进样技术和组分在进样系统、连接管道、接头和检测池等柱外死体积内的扩散造成的。由于样品分子在液体流动相中的扩散系数很小，致使进样器、连接管道、接头和检测池等柱外死体积对色谱峰展宽的影响很大。为了降低柱外效应对峰展宽的影响，必须尽量减小柱外死体积。如采用进样阀进样或将试样直接注射到柱头的中心部位；各部位连接时使用“零死体积接头”；整个色谱系统的连接管路尽可能短；尽可能提高检测器和放大器的响应速度。
二、分离条件的选择
从高效液相色谱的Giddings方程式可以看出，为了减小柱内展宽，提高柱效，必须选择合适的分离操作条件，以实现最佳分离。
（一)固定相的选择
1. 要求固定相粒度（dp)小、筛分范围窄、填充均匀，以减小涡流扩散和动态流动相传质阻力。
2. 选用浅孔道的表面多孔型载体或粒度小的全多孔型载体，以减少静态流动相传质阻力和固定相的传质阻力。
（二)流动相的选择
从式10-4和10-5可知，降低Cm和Csm，提高柱效，可从减小dp，增加Dm着手。大多数情况下使用的都是商品柱，对使用者来说主要考虑的是Dm的影响。因为Dm与温度成正比，与黏度成反比，所以采用低黏度的流动相或增加柱温都可增大Dm，提高柱效。但在用有机溶剂为流动相的色谱中，增加柱温会产生气泡。因此，大多数实验在室温下进行。改善分离效能主要通过采用低黏度的流动相实现。例如，在高效液相色谱法中广泛使用甲醇作流动相，而不用乙醇，就是因为甲醇的黏度只有乙醇的一半的缘故。
（三)流速的选择
从图10-6高效液相色谱的H-u曲线可知，流动相的流速将直接影响柱效。降低流速，可提高柱效，但流速太小会延长分析时间。所以在实际应用中，要在满足分离效率的前提下，适当提高流速。
（四)柱温的选择
温度对组分的保留值影响较大，对色谱柱的选择性也有一定影响。因此温度是一个有用的实验参数，而且操作比较方便。高效液相色谱大多在室温下进行，对温度不加控制，主要是因为早期的仪器没有柱温箱。实验中，色谱柱甚至进样器及检测器恒温有许多优点。如方法建立时优化温度，在常规分析中保证保留时间的重现性，特别是分离分析有机弱酸或弱碱等可解离的样品时，恒温常常可得到较好的结果。此外，适当提高色谱柱温度，可降低流动相的黏度，降低传质阻力，提高柱效。
第四节 高效液相色谱固定相与流动相
一、固定相
色谱柱中的固定相（填料)是高效液相色谱法的重要组成部分，它直接关系到柱效与分离度。现将主要的固定相类型介绍如下。
（一)液-固吸附色谱固定相
液-固色谱固定相多数是有吸附活性的吸附剂。常用的有硅胶、氧化铝、高分子多孔微球、分子筛、聚酰胺等。按其结构可分为表面多孔型和全多孔微粒型两类，如图10-7。
图10-7 表面多孔型和全多孔微粒型固定相示意图
1．表面多孔型 表面多孔型，又称薄壳型，是在实心玻璃微球表面涂一层很薄（约1～2 mm)的多孔色谱材料（如硅胶、氧化铝等)烧结制成的。由于固定相是球体、填充均匀、渗透性好、多孔层很薄、表面孔隙浅，因此传质速度快，柱效高。其主要缺点是比表面积小，柱容量低、允许进样量小，要求检测器的灵敏度高。
2. 全多孔微粒型 全多孔微粒型有无定型或球型两种，颗粒直径3～10 mm。具有粒度小、比表面积大、孔隙浅、柱效高、容量大等优点，特别适合复杂混合物分离及痕量分析。目前高效液相色谱法大多采用直径3～5 mm的球型填料。
（二)液-液分配色谱固定相
液-液分配色谱的固定相是在载体上涂渍适当的固定液构成，载体可以是玻璃微球，也可以是吸附剂。早期是将固定液机械涂渍在载体上，这样涂渍的固定液不仅易被流动相逐渐溶解而流失，而且会导致色谱柱上保留行为的改变以及引起分离样品的污染。为了解决固定液的流失问题，改善固定相的功能，产生了化学键合固定相，简称化学键合相。
化学键合相（chemical bonded phase)是利用化学反应通过共价键将有机基团结合到载体（硅胶)表面制成的。
化学键合固定相的优点是：① 传质速度比一般液体固定相快，因此柱效高；② 固定液不流失，耐溶剂冲洗，色谱柱的稳定性好、寿命长；③ 可以键合不同性质的有机基团，改善固定相的性能，进一步改变分离选择性；④ 适于作梯度洗脱。
化学键合相是高效液相色谱较为理想的固定相，在高效液相色谱分析中占有极重要的地位。化学键合相按基团与载体（硅胶)相结合的化学键类型，分为酯化型（Si—O—C)和硅烷化型（Si—O—Si—C)等。酯化型键合相具有良好的传质特性，但易水解、醇解，热稳定性差，已被淘汰。
硅烷化型是利用氯硅烷与硅醇基进行硅烷化反应，生成具有Si—O—Si—C键的固定相。反应如下：
这类键合相具有热稳定性好，不易吸水，耐有机溶剂等优点。能在70℃以下、pH3～8的范围内正常工作，应用范围广泛。
化学键合相按键合基团的性质，可分为极性、中等极性和非极性三类。
1. 极性键合相 常用氨基、氰基键合相。分别将氨丙硅烷基[—Si(CH2)3NH2]和氰乙硅烷基[—SiCH2CH2CN]键合在硅胶表面制成。它们可用作正相色谱的固定相。氨基键合相是分析糖类最常用的固定相。
2. 中等极性键合相 常见的有醚基键合相。这种键合相既可作正相又可作反相色谱的固定相，视流动相的性质而定。
3. 非极性键合相 硅胶表面键合烃基硅烷，所得到的就是非极性键合相。非极性键合相通常用于反相色谱，亦称为反相键合相。其烃基配基可以是不同链长的正构烷烃，如十八烷基硅烷（octadecylsilane，ODS或用C18表示)、辛烷基硅烷（用C8表示)，又可以是带有苯基的碳链，如—(CH2)3C6H5，其中以含十八个碳原子的烷基硅烷键合相应用最广泛。
应该说明的是，这里介绍的键合相是指用于正相和反相色谱的狭义化学键合相。广义的键合相还应包括键合型离子交换剂、手性固定相以及亲合色谱等。
（三)离子交换色谱固定相
早期的离子交换色谱法是以离子交换树脂作固定相，这种固定相遇溶剂易膨胀，不耐压，传质速度慢，不适合高效液相色谱法，目前已被离子交换键合相代替。
离子交换键合相也是以薄壳型或全多孔微粒硅胶为载体，表面经化学反应键合上各种离子交换基团。和离子交换树脂一样，离子交换键合相也可分为阳离子交换键合相和阴离子交换键合相。阳离子交换键合相又可分为强酸和弱酸型阳离子交换键合相，阴离子交换键合相又可分为强碱和弱碱型阴离子交换键合相。其中强酸型和强碱型离子交换键合相较稳定，在高效液相色谱中应用较多。
（四)尺寸排阻色谱固定相
尺寸排阻高效液相色谱法常用的固定相为具有一定孔径范围的多孔性凝胶。根据耐压程度可分为软质、半硬质和硬质三类。
软质凝胶如葡聚糖凝胶等，具有较大的溶胀性，只适用于常压下的尺寸排阻色谱法。半硬质凝胶如苯乙烯和二乙烯苯的共聚物凝胶，能耐较高的压力，适用于以有机溶剂为流动相的色谱法。这种凝胶的特点是有一定可压缩性，可填得紧密，柱效高。缺点是凝胶在有机溶剂中稍有溶胀，柱的填充状态会随流动相改变。硬质凝胶有多孔硅胶及多孔玻珠等，属于无机凝胶。其优点是在溶剂中不变形，孔径尺寸固定，化学惰性，稳定性好。缺点是装柱时易碎，不易装紧，柱效较低；吸附性较强，有时易造成拖尾。
新型凝胶色谱填料也是以薄壳型或全多孔微粒硅胶为载体，表面经化学反应键合上各种类型软质凝胶制成。新型凝胶克服了软质凝胶的一些弱点，粒度细，机械强度高，分离速度快，分离效果好。特别是在无机载体表面键合亲水性单糖或多糖型凝胶在生物大分子的分离方面有广泛的应用前景。
（五)亲和色谱固定相
亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法。亲和色谱固定相通常是在载体表面先键合一种具有一般反应性能的所谓间隔臂（如环氧、联氨等)，然后再连接上生物专一性的配基（如酶、抗原或激素等)。这种配基只能保留与其具有亲和力特性的生物大分子。当含有亲和物的复杂混合试样随流动相流经固定相时，亲和物与配基结合被保留，而与其它组分分离，见图10-8。其它组分流出色谱柱后，再改变条件，降低亲和物和配基的结合力，将保留在柱上的大分子以纯品形式洗脱下来。
图10-8亲和色谱法分离示意图
亲和色谱法也可以认为是一种选择性过滤，它选择性强，纯化效率高，往往可以一步获得纯品，广泛应用于生物化学中各种酶、辅酶、激素、糖类、核酸和免疫球蛋白等的分离和纯化。
（六)手性固定相
对映异构体，除了光学性质有所不同外，具有完全相同的理化性质，使用通常的高效液相色谱技术很难分离。对映体的拆分曾被认为是非常困难和繁杂的实验技术，手性高效液相色谱法的发展，为解决这一难题找到了出路。手性高效液相色谱法分离对映体的方法有三种：手性固定相法、手性流动相添加剂法和手性衍生化试剂法，其中手性固定相法由于具有直接、快速、高效、简便以及适用性广等优点而成为分离对映体的首选方法。
手性固定相法是利用键合在固定相上的手性识别剂与对映体反应形成非对映复合物，然后进行分离测定。
二、流动相
高效液相色谱流动相有两个作用，一是携带样品通过色谱柱；二是给被分离组分提供一个分配相，进而调节选择性，使混合物实现分离。可用作高效液相色谱流动相的溶剂很多，而且还可组成不同配比的多元溶剂系统，选择余地很大。在固定相一定时，流动相的种类、配比能严重影响分离效果。因此，在高效液相色谱法中，流动相的选择至关重要。
（一)对流动相的基本要求
1.对被分离的样品有适宜的溶解度。最好使k值在1～10之间。k值太小，不利于分离；k值太大，可能使样品在流动相中沉淀。
2.与样品及固定相不发生化学反应。
3.黏度小，有利于提高传质速度，提高柱效，降低柱压。
4.与检测器匹配，如使用紫外检测器时，流动相在检测波长下不应有吸收。
5.纯度高。
（二)流动相对分离度的影响
流动相对分离度的影响，可用公式（10-8)说明。
（10-8)
在气相色谱中，r21与k分别受固定相性质和柱温的影响，一般通过改变柱温与选择固定相来改善分离效果。而在高效液相色谱中，r21主要受流动相性质的影响，k主要受流动相配比的影响。流动相种类不同，分子间的相互作用力不同，有可能使被分离组分的分配系数不等。流动相种类确定后，改变流动相的配比，可改变流动相的极性和洗脱能力。由此可见，流动相的选择是以能获得较大的r21值和适宜的k值，即各组分彼此分离并且有适宜的保留时间tR为目的。
（三)流动相的选择
流动相的选择虽有一般的指导原则，但更多的是靠实际经验。显然，溶剂的极性（常用Snyder溶剂强度参数e0来衡量)是重要依据。对于正相分配色谱，一般先选用中等极性溶剂作为流动相，若组分的保留时间太短，说明流动相极性太大，需改用极性较弱的溶剂；若组分保留时间太长，说明流动相极性太小，需改用极性较强的溶剂。经过多次实验后，才能确定最适宜的流动相溶剂。在反相色谱中，一般采用水为流动相的主体，再加入不同配比的有机溶剂作调节剂。
实际工作中，除上述根据溶剂的强度参数选择流动相外，还往往通过加入流动相添加剂来改善分离效果，如前述的在流动相中添加手性识别剂以分离手性化合物。在高效液相色谱中，比较典型的例子是离子对色谱法和离子抑制色谱法。
离子对色谱法可分为正相离子对色谱法和反相离子对色谱法。实际应用中主要是反相离子对色谱法，它是把离子对试剂加到流动相中，使被分离组分（离子)在流动相中与离子对试剂生成中性离子对，提高固定相对被分离组分的保留作用，改善分离效果。离子对色谱法是一种特殊的反相色谱分离技术，它兼有反相色谱和离子交换色谱共同的特点，分析速度快，分离效果好。主要适用于分离强电解质和弱电解质的混合物，或电解质和非离解物质的混合物。离子对色谱法的缺点是离子对试剂价格较贵。
离子抑制色谱法是通过向流动相中加入少量弱酸、弱碱或缓冲盐，调节流动相的pH值，抑制组分的解离，提高固定相对组分的保留作用，改善峰型，以达到分离有机弱酸和弱碱的目的。离子抑制色谱法通常用于反相色谱法中，影响组分的保留值的因素，除与反相液相色谱法相同外，还受流动相pH值的影响。对于弱酸，如果流动相的pH值小于它的pKa，其主要存在型体为弱酸分子，则k值增大；反之，如果流动相的pH值大于它的pKa，其主要存在型体为酸根离子，则k值变小。对于弱碱，情况相反。离子抑制色谱法适用于分离pKa为3～7的弱酸、pKb为7～8的弱碱及两性化合物。
第五节 高效液相色谱法的应用
高效液相色谱法由于不受所分析样品挥发性及热稳定性的限制，其应用范围比气相色谱广泛得多，可广泛应用于生命科学研究、食品分析、环境污染分析、生物化学、药物化学、临床医学等众多领域。
一、在生命科学研究中的应用
生命科学是二十一世纪自然科学研究中极为重要的前沿课题，高效液相色谱法是生命科学研究的重要手段之一。HPLC不仅可以对氨基酸、蛋白质、核糖核酸、维生素、酶等生物分子进行分离、纯化和测定，而且可以通过测定结果揭示生命过程。高效液相色谱法在生命科学领域的应用主要有两方面：① 分离和检测：主要针对一些小的分子，如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、嘌呤以及维生素等；② 分离、提纯和测定：主要针对一些生物大分子，如多肽、蛋白质、核糖核酸以及酶等。此外，在临床诊断和重大疾病预警方面，高效液相色谱也有广泛的应用前景。
二、在食品分析中的应用
食品质量与安全是世界各国都极为关注的问题，食品分析是保障食品质量安全的基础。高效液相色谱法是食品分析的重要方法之一，能有效地检测食品中有毒物质和是否掺假。利用高效液相色谱法可测定食品中糖类、人工甜味剂、色素、防腐剂、有机酸、维生素、氨基酸、抗氧化剂等。如食品中维生素的测定，用高效液相色谱法进行测定，不仅方法的灵敏度高、精密度好，而且能一次测定多种维生素，不论是脂溶性还是水溶性维生素都可得到满意结果。
三、在环境分析中的应用
人群健康与环境质量密切相关，环境污染对健康的危害程度日益严重，已成为二十一世纪社会发展所面临的十分重要的问题之一。应用高效液相色谱法测定的环境污染物主要有多环芳烃、农药、酚类、异腈酸酯类等化合物。
四、在药物分析中的应用
高效液相色谱法目前可认为是在药物分析领域中最活跃的一种分析方法，无论是原料药、制剂、制药原料及中间体、中药及中成药，还是药物的代谢产物，高效液相色谱法都是分离、鉴定和含量测定的首选方法。
（毋福海)
