各论微生物的分离与鉴定
一病原性球菌的检查
Examination of Pathogenic Cocci
【实验目的】
1掌握病原性球菌的菌落、菌体形态特征及染色性。
2熟悉病原性球菌的分离培养与鉴定方法。
【实验原理】
引起化脓性炎症的球菌，主要有葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌和淋球菌。识
别化脓性球菌，主要根据形态、染色性、培养特征及生化反应。除链球菌、肺炎链球菌及脑
膜炎球菌必须做血清学分型外，一般无需做抗原分析和动物试验。血清学分型的主要目的是
为了追踪传染源，以便加以控制，因此，普通实验室用之不多。
【实验内容和方法】
一病原性球菌的菌落特征观察
1葡萄球菌(Staphylococcus)：在血琼脂平板上培养18～24小时，形成圆形凸起，表面光
滑；湿润，表面整齐，不透明的菌落。金黄色葡萄球菌金黄色，可产生透明溶血环；表皮葡
萄球菌白色，无溶血环；腐生葡萄球菌白色或柠檬色，无溶血环。
2链球菌(Streptococcus)：在血琼脂平板上培养18～24小时，形成圆形凸起，半透明或不
透明，灰白色的菌落。甲型链球菌不完全溶血，在菌落周围形成草绿色溶血环；乙型链球菌
完全溶血，形成透明溶血环；丙型链球菌不发生溶血，无溶血环。
3肺炎链球菌(Diplococcus Pneumoniae)：在血琼脂平板上培养18～24小时，形成细小、
扁平、半透明、灰白色的菌落，菌落周围有草绿色溶血环，与甲型链球菌相似，培养2～3天
后，因菌体发生自溶，菌体中央下陷呈“脐状”。
4脑膜炎球菌(N.Meningitidis)：在巧克力琼脂平板上加5%CO237℃培养24小时，形成圆
形、光滑、凸起透明似露球的菌落。在血琼脂平板上不发生溶血。
5淋球菌(N.gonococcus)：菌落特征与脑膜炎球菌相同。
二病原性球菌的菌体形态及染色性观察
细菌种类〖〗菌体形态
〖〗染色性
葡萄球菌〖〗排列不规则，常呈葡萄串状，有时呈链状或散在〖〗G+
链球菌〖〗长短不一的链状排列〖〗G+
肺炎链球菌〖〗矛尖状双球菌〖〗G+
脑膜炎球菌〖〗肾形或豆形成双排列〖〗G-
淋球菌〖〗咖啡豆形成双排列〖〗G-
三标本采集
病原性球菌常引起化脓性疾病，分离用标本多采用脓液、痰液，也可从分泌物、血液及穿刺
中取材。(1)脓汁：用无菌棉拭挑取患部深处脓液或分泌物，放入无菌试管内；(2)痰液：用
消毒过的容器收集病人痰液，以无菌棉拭挑取浓稠痰块，放入无菌试管内；(3)咽部分泌物
：嘱病人张开口，用压舌板压舌根部，用无菌棉拭从鼻咽部擦拭取材，放入无菌试管内；(4
)脑脊液：对疑患流脑的患者作腰椎穿刺取脑脊液，放入无菌试管内，立即送检；(5)尿道、
阴道分泌物：对淋病可疑患者，男性可从尿道内1—2厘米处取材，女性可从宫颈口取分泌物
，立即送检。
四病原性球菌的分离与鉴定
待检标本可直接作涂片染色检查鉴定，必要时可作分离培养及生化反应鉴定。常见病原性球
菌的检查程序如下：
脓汁、痰、咽部分泌物直接涂片、革兰氏染色、镜检
血琼脂平板培养观察菌落性状、溶血性、色素
挑取可疑菌落涂片染色镜检纯培养生化反应动物实验
药敏实验
血液、穿刺液—→肉汤增菌培养—→培养液涂片染色境检
二肠道致病菌的检查
Examination of Enteric Pathogens
【实验目的】
了解肠道杆菌的生物学特征、分离与鉴定方法。
【实验内容和方法】
一肠道杆菌形态学观察
肠道杆菌是人和动物肠道中的细菌，多数为非致病菌或条件致病菌，少数为致病菌。肠道病
原菌主要是指沙门氏菌属、痢疾杆菌属、霍乱弧菌三大重要致病菌。此外，某些致病性大
肠杆菌也可引起肠道感染。肠道杆菌都是革兰氏阴性菌，形态、排列相似，但生化反应、抗
原结构有差异，因此常用生化反应和血清学试验进行鉴定。
二肠道杆菌的分离培养与鉴定
肠道病原菌与常居正常菌群形态相似，大多为革兰氏阴性杆菌。因此，对肠道致病菌的检验
，首先必须与常居菌区分开。肠道非致病菌大多数能分解乳糖产生酸，使指示剂变色，菌
落呈变色反应，而致病菌一般不分解乳糖，不产酸，菌落不变色。
1、首先可将标本接种于肠道菌鉴别培养基——SS琼脂培养基上培养，37℃24小时后观察菌
落特征。致病菌菌落为无色，非致病菌为粉红色，从而把大部分非致病菌与致病菌分开。
2、挑取可疑致病菌单个菌落，以穿刺划线法接种于半固体双糖铁培养基上，37℃培养2
4小时观察结果，即通过生化反应初步辨别出菌属或菌种。
3、最后通过特异性的血清学试验来鉴定菌种、菌型或亚型。必要时进行系统生化鉴定。
鉴定程序为：
粪便—→SS琼脂培养—→挑取可疑菌落
血骨髓
—→增菌培养双糖铁培养基血清学鉴定染色镜检
生化反应
附：SS琼脂培养基：
①用途：用于分离培养沙门氏菌及志贺氏菌。
②成分：
蛋白胨5g枸橼酸铁1g
乳糖10g牛肉膏25g
胆盐10g0.1%煌绿溶液0.33ml
枸橼酸钠10g1%中性红溶液2.5ml
硫代硫酸钠10g琼脂20g
蒸馏水1000ml调pH7.0
③原理：中性红在培养基中起指示剂作用，大肠杆菌能分解乳糖产酸，使培养基pH下降，故
菌落呈红色；一般肠道致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨产生碱性物质，所以菌落呈淡黄色
。胆盐、枸橼酸钠对一般革兰氏阳性菌及大多数大肠杆菌有抑制作用，而对肠道病原性杆菌
无抑制作用或作用较弱，并且胆盐有促进沙门氏菌、痢疾杆菌生长的作用。
双糖铁培养基：
①用途：初步鉴别肠道革兰氏阴性杆菌对糖类的发酵作用，观察细菌有无硫化氢产生，观察
细菌有无动力。
②成分：含酚红指示剂［pH8.7(红色)～pH6.8(黄色)］的pH7.6的蛋白胨水。
硫酸亚铁氨0.02%琼脂0.35%
乳糖1%
琼脂1.3%
③原理：上层中的乳糖用以鉴别肠道杆菌，致病菌不发酵乳糖，而大肠杆菌则能发酵乳糖，
产酸而使上层斜面变成黄色。硫酸亚铁氨用以检查细菌分解蛋白质后是否产生硫化氢，如
有硫化氢产生则与培养基中的硫酸亚铁起化合作用而成黑色的硫化铁。硫代硫酸钠能起还原
作用，以防止硫化氢被氧化而影响结果。下层为半固体，可观察肠道杆菌的动力；观察细菌
对葡萄糖分解产酸、产气情况。
【注意事项】
●肠道传染病患者的诊断检验，常是采取粪便标本进行分离培养。但沙门氏菌感染，特别是
肠热症患者，应根据不同病期采取血、尿或骨髓进行细菌培养。血清做肥达氏试验(见综合
性实验一·七)，以提高检验的阳性率。
●肠道病原菌的抵抗力比常居菌弱，若粪便标本不及时送检而放置过久，则由于大肠杆菌等
旺盛增殖，易使病原菌消失或死亡，其中尤以痢疾杆菌最为敏感。为提高痢疾杆菌的培养阳
性率，最好在患者床边取新鲜粪便标本，及时接种于合适的www.lindalemus.com培养基上。如不能立即培养，
应将粪便标本置于30%甘油缓冲液中保存。
大肠杆菌、伤寒杆菌和痢疾杆菌的生物学特征
菌种〖〗形态、排列及染色性〖〗在SS平板上的菌落特征〖〗含铁双糖培养基乳糖〖〗葡萄
糖〖〗硫化氢〖〗动力
大肠杆菌〖〗杆状，散在排列〖〗菌落较大，不透明呈红色〖〗+〖〗+〖〗-〖〗+
伤寒杆菌〖〗同上〖〗菌落较小，半透明无色或淡黄色〖〗-〖〗+〖〗+/-〖〗+
副乙伤寒杆菌〖〗同上〖〗菌落较小，半透明无色或淡黄色〖〗-〖〗+〖〗+/-〖〗+
痢疾杆菌〖〗同上〖〗菌落小，半透明无色或淡黄色〖〗-〖〗+〖〗-〖〗-
三霍乱弧菌的检查
Examination of V.cholerae
【实验目的】
了解霍乱弧菌的检验方法。
【实验原理】
对霍乱病人的诊断检验，主要靠分离鉴定病原体。霍乱弧菌的主要特点是菌体弯曲呈弧状或
逗点状，培养特点是嗜碱怕酸，往往能出现霍乱红反应(即亚硝酸靛基质反应)，抗原构造
特异。其诊断检验方法与一般肠道病原菌不同，主要步骤及特点见下表：
待检标本
(粪便或呕吐物)
→镜检→涂片革兰氏染色→阴性弧菌
→悬滴(暗视野)→动力(+)，制动(+)
→培养→碱性蛋白胨水37℃——68h→镜检(弧菌，能运动)→碱性琼脂平板分离培养→霍乱红反应(+)
→碱性琼脂平板37℃——1024h→镜检(弧菌)
→玻片凝集试验(+)
【实验内容与方法】
1镜检：注意其形态和染色特性。
2观察培养物：该菌在碱性蛋白胨水培养基中呈均匀混浊，有时
在液体表面生成薄菌膜。
3动力检查和制动试验：霍乱弧菌一端有一根鞭毛，在液体中可
活泼运动，若在上述呈活
泼运动的细菌悬滴中加一滴抗该菌的免疫血清，由于鞭毛与抗体特异结合，可使细菌停止运
动，此为制动试验阳性。
①动力检查：用接种环沾取霍乱弧菌液体培养物一滴，加于玻片中央，置高倍显微镜下观察
，注意是否有穿梭状活泼运动。
②制动试验：以接种环沾取霍乱菌液一滴，放于璃片中央，同时加一接种环抗霍乱弧菌多价
免疫血清，混匀后，在高倍镜下观察，细菌运动是否被抑制。
四白 喉 杆 菌 的 检 查
Examination of C.diphtheriae
【实验目的】
掌握白喉杆菌的一般特征，了解白喉杆菌的毒性。
【实验原理】
白喉杆菌属于棒状杆菌属，为革兰氏阳性的细长杆菌，常会出现多形态，排列不规则，有时
呈栅栏状，没有鞭毛、芽胞和荚膜。染色时菌体着色不均匀，菌体一端或两端染色与菌体不
同，称为异染颗粒。
对白喉杆菌的检查，主要是根据细菌形态，特别是极体的异染特点，此外还可根据生化反应
及毒力试验等进行鉴定。
分离培养白喉杆菌时，常用吕氏凝固血清斜面及亚碲酸钾血平板。在这两种培养基上，白喉
杆菌生长较其它菌快，形态典型。亚碲酸钾被吸入菌体内使菌落呈黑色。
【实验内容与方法】
一形态观察
观察白喉杆菌革兰氏染色和异染颗粒染色标本。
二白喉杆菌培养特征观察
观察白喉杆菌在吕氏血清斜面和亚碲酸钾血平板上的菌落特点。
三家兔皮内试验法
家兔上皮细胞受白喉杆菌毒素作用后，蛋白质合成受阻，从而表现红肿、坏死，其毒性作用
可被相应抗毒素中和而不出现毒性作用。
【材料】
白喉杆菌白毛家兔白喉抗毒素注射器
【方法】
1用5毫升盐水洗下白喉杆菌吕氏血清斜面24小时培养物，制成菌悬液。
2将家兔背部两侧的毛剪去，局部皮肤消毒后，在背的一侧皮内注射上述菌悬液0.1毫升。
3经4～6小时后，从家兔耳静脉注入白喉抗毒素1000单位，再将留下的菌悬液在背部另侧
皮内注射0.1毫升作为对照。
【结果分析】
注射后24、48、72小时观察结果。如试验一侧的注射部位发生红肿及坏死现象而对照的一侧
无此现象者，即为阳性(有毒力)。
四平板毒力试验法
毒素与抗毒素在琼脂内扩散相遇，当其比例适合时便形成肉眼可见的特异性沉淀线，本实验
代替动物皮内实验，其优点是简便，不需要动物。且多认为与动物试验结果相一致。
【材料】
蛋白胨琼脂培养基无菌马(或兔)血清白喉抗毒素待检菌培养物无菌平皿
【方法】
1制备平板：取胰蛋白胨琼脂培养基10毫升(其中含麦芽糖及乳糖)，加热溶解，冷却至50
℃左右，加入灭活的无菌马(或兔)血清2毫升，混匀(勿出气泡)，立即倾注平皿内制成血清
琼脂平板培养基。
2加抗毒素：当平皿内琼脂尚未完全凝固前，取浸有白喉毒素(500单位/毫升)的无菌纸条(
60×15mm)放于平板中央。待琼脂凝固后，平板放于37℃孵箱内烘1-2小时(为防止污染，平
板向下)，使培养基表面干燥。
3接种细菌：将待检的白喉杆菌在与滤纸片呈垂直方向划线接种于平板面上，接种量宜多
些，同时
另用能产生毒素和不能产生毒素的白喉杆菌按上法划线接种于其两侧(呈平行线)，作为阳性
及阴性对照。
4培养：将接种物放于37℃培养24-72小时后观察结果。
【结果分析】
在抗毒素纸条与被检细菌划线的交角处有白色沉淀线者，即是该菌产生的毒素与抗毒素在琼
脂中弥散相遇呈最适比例而出现沉淀线，证明此菌是为产毒株。若不出现沉淀线，则为不产
毒株。阳性对照应出现沉淀线，阴性对照不应有沉淀线。
附：
一吕氏血清斜面培养基
1.成分：1%葡萄糖肉汤(pH7.4)1份，动物血清3份。
2.制法：将上述成份混合，并分装于无菌试管中，每管5毫升；然后斜置于血清凝固器中
，间歇灭菌，第一天75℃经1小时，第二天80℃经半个小时，第三天85℃经半小时；将培养
基于37℃孵育24小时，若无杂菌生长，可供使用。
二亚碲酸钾血平板
1.成份：肉浸液琼脂(pH7.4～7.6)100毫升，1%亚碲酸钾水溶液2毫升，0.5%胱氨酸水溶液
2.制法：加热溶化已灭菌的肉浸液琼脂，待冷至50℃左右，加入灭菌的亚碲酸钾溶液、胱
氨酸溶液及无菌脱纤维血，混匀，倾注平皿。凝固，冷藏备用。
3.说明：
(1)白喉杆菌能使亚碲酸钾还原为碲，故菌落呈黑色。亚碲酸钾可抑制标本中革兰氏阴性球
菌生长，有利于白喉杆菌的检出。
(2)胱氨酸和血液都是促进白喉杆菌生长的营养物。
(3)胱氨酸及亚碲酸钾均不耐高温，应用间歇灭菌或滤菌器过滤除菌。
Examination of Cl.tetani and Cl.perfringens
【实验目的】
1熟悉破伤风杆菌及产气荚膜杆菌的形态及培养特征。
2熟悉破伤风杆菌及产气荚膜杆菌使动物发病时的症状。
【实验原理】
厌氧芽胞杆菌属又称梭状芽胞杆菌属，为革兰氏阳性杆菌。能形成芽胞，多数有鞭毛，营养
要求不高，但需要严格厌氧环境。常见的致病菌有破伤风杆菌、产气荚膜杆菌和肉毒杆菌等
。
鉴定这类细菌，主要是根据细菌形态、培养特征及生化反应，必要时还需做动物实验检查菌
株的产毒能力。
破伤风杆菌是破伤风的病原体，常由于外伤后创口被泥土或粪便污染而受传染。本菌芽胞为
圆形，位于菌体顶端，呈鼓槌状，周身有鞭毛，在血平板上能溶血，菌落边缘不整齐，易
向外扩散呈羽毛状。不发酵牛乳。
气性坏疽可由多种病原菌引起，尤以产气荚膜杆菌最为常见。产气荚膜杆菌无鞭毛，不能运
动；在一定环境中形成荚膜，芽胞位于菌体中央或偏端：血平板上形成圆形湿润菌落， 明
显溶血，能分解糖类，产酸产气，在牛乳培养基中产生“汹涌发酵”现象。
【实验内容和方法】
一形态及染色镜检
注意菌体形态、染色特性，对比两菌的芽胞形态、大小及在菌体中的位置。
二培养及生化特性的检验
观察下列培养物的特征：
1肉渣汤培养物：观察肉渣汤是否浑浊，肉渣色泽是否变化，是否产生气体。
2血琼脂平板培养物：观察菌落特点，有无溶血环。
3牛乳培养物：是否发酵牛乳及使酪蛋白凝固，有无产生气体出现“汹涌发酵”现象。
4高层葡萄糖琼脂培养物：有无产生气体使琼脂断裂。
三破伤风毒素实验(见综合性实验一第九部分)
四产气荚膜杆菌动物体内产气实验
1用灭菌注射器抽取产气荚膜杆菌肉渣培养物0.2～1.0毫升，注入小白鼠腹腔内。
25分钟后杀死动物，送入37℃温箱中放置5～8小时。
3观察动物腹部，如有膨胀气肿现象，解剖检查见有厌氧芽胞杆菌者，即大致为产气荚膜
杆菌。
六结核杆菌的检查
Examination of M.tuberculosis
【实验目的】
1熟悉结核杆菌的菌体形态。
2掌握抗酸染色法的原理及操作过程。
【实验原理】
结核杆菌为细长的杆菌，有分枝生长趋势。结核杆菌菌体有一层很厚的腊质包膜，不易被一
般染料着色，经加温或延长时间才能着色，一旦着色，能抵抗盐酸酒精的脱色作用，故又称
抗酸杆菌。分枝杆菌属细菌为抗酸菌。
抗酸染色法的原理：石炭酸复红在脂类中的溶解度高于盐酸酒精，结核杆菌含有较多量的分
枝菌酸及其衍生物，易与石炭酸复红牢固结合，所以不被盐酸酒精脱色，而其它细菌含脂类
较少，缺乏抗酸性。此外，与结核杆菌细胞壁的完整性有关。抗酸染色法是鉴别结核杆菌的
重要方法之一，常用的是妻尼(Ziehlneelsen)氏法。
如果痰标本中含的结核杆菌少(含量在105个/ml以下)，直接涂片法常不易检出，可用浓缩
集菌
法，即将痰液用4%NaOH或3%HCl处理，溶解标本中的粘绸性有机物，使痰液中包裹的细菌释
放出来。然后用离心法或用汽油、二甲苯等作漂浮法集菌，使细菌浓缩集中，再涂片作抗酸
染色，易找到细菌。
【实验内容和方法】
一抗酸染色法
【材料】
结核杆菌(卡介苗)与变形杆菌混合菌液石炭酸复红3%盐酸酒精碱性美兰
【方法】
1在载玻片上作结核杆菌、变形杆菌混合菌液涂片，自然干燥后，火焰固定。
2将石炭酸复红染液加满于涂膜部位，经15分钟后用水冲洗。
3滴加3%盐酸酒精脱色，轻轻晃动玻片，直至无红色流下为止，用水冲洗。
4用碱性美兰复染1分钟后水洗，干燥镜检。
【结果】结核杆菌呈红色，变形杆菌呈蓝色。
七嗜酸乳杆菌的分离与鉴定
Isolation and Identification of L.acidophilus
【实验目的】
1熟悉嗜酸乳杆菌分离与鉴定方法。
2了解生物治疗剂(微生态制剂)拮抗病原菌的作用机理。
【实验原理】
乳酸菌是一群可发酵碳水化合物以获取能量并能生成大量乳酸的一类细菌的总称，嗜酸乳杆
菌是其中的一种，主要存在于人和动物肠道、口腔和阴道中。现已证实，嗜酸乳杆菌能产生
细菌素(蛋白质和多肽)，如乳杆菌素A(lactocin A)、乳杆菌素B(lactocin B)、乳杆菌素F(
lactocin F)、aciclocin A、aciclcin B等，具有杀死或抑制其它微生物的生长。因此，
筛选出强烈拮抗某种病原菌的嗜酸乳杆菌菌株，研制成口服活菌制剂，可用于细菌感染性疾
病的防治。
采用选择性的LC培养基及微需氧培养方法，从新鲜粪便标本中分离嗜酸乳杆菌。利
用API20A鉴定系统对分离株进行鉴定，并结合细菌DNA的G+Cmol%的结果，鉴定出嗜酸乳杆菌
。
【实验内容和方法】
一培养基配制
【方法】
1称取适量的LC培养基(胰蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母浸粉5克、葡萄糖10克、醋酸钠1
5克、磷酸氢二钾6克、柠檬酸铵2克、MgSO4·7H2O0.57克、MnSO4·H2O 0.12克、FeSO4
0.03克、Tween80 1克)，加入蒸馏水至1000ml，煮沸溶解。
2加入冰醋酸，调pH为5.5～6。
3100℃(8磅)高压蒸汽灭菌15～20分钟。
二嗜酸乳杆菌的分离与鉴定
【方法】
1取新鲜粪便标本约黄豆粒大小，加入生理盐水2ml，混匀，制成悬液。取悬液约0.2ml，
加入装有2ml的小试管中稀释，混匀。
2吸取0.1ml稀释液滴在LC平板中央，用L棒涂开。
3将平板置于厌氧罐内，充入混合气体(80%N2，10%H2，10%CO2)，于37℃下培养3天
。
4挑取可疑单个菌落转种至斜面(需纯化三次)。
5通过革兰氏染色(+)、葡萄糖发酵实验(同型)、厌氧和需氧试验进行初筛，再经API鉴定
卡鉴定，最后测定G+Cmo%。
附实验结果分析
嗜酸乳杆菌具有以下特征：
①在选择性LC培养基上的菌落形态：菌落细小(直径为0.5～2mm)，表面粗糙，园形凸起，
边缘不整齐。
②菌体形态：菌体直或微弯，形态细长，两端圆，成双或短链，无芽胞。
③革兰氏染色阳性。
④20种单糖生化反应(略)。
⑤G+C mol%为34～37%。
八狂犬病毒包涵体观察
【实验目的】
了解狂犬病毒包涵体的特征及病变细胞的特点。
【实验原理】
病毒一般需用电子显微镜才能看见。电镜下多数病毒呈球型，少数呈丝状或砖块状，细菌病
毒多数呈蝌蚪状。某些病毒在组织细胞中能形成包涵体(病毒颗粒的集聚体)。将病变材料做
切片或涂片，用麦氏或姬姆染色法染色，普通光学显微镜即可看到。包涵体呈圆形或卵圆形
，大小不等。根据病毒种类不同，包涵体存在部位(胞浆或胞核内)及染色性状(嗜酸性或嗜
碱性)也不同，借此可帮助诊断。
狂犬病毒主要侵犯中枢神经系统，在神经细胞中大量繁殖，取病犬脑组织海马回部切片标本
经染色后，置油镜下观察，可见狂犬病毒包涵体位于胞浆中，染成鲜红色，呈圆形或椭圆形
。神经细胞呈三角形，细胞核为蓝色，间质为淡红色。
九乙型肝炎病毒HBsAg和HBeAg的检测
【实验目的】
熟悉ELESA法检测乙型肝炎病毒“二对半”抗原抗体试验原理、方法及结果分析。
【实验原理】
酶联免疫吸附试验(ELISA)是用酶标记的抗体或抗抗体来检测标本中的病毒抗原或血清抗体
。酶标抗体或抗抗体若被待检的抗原或抗体固定在微孔反应板上，当加入的酶作用底物后则
出现底物被酶解后的显色反应。该法敏感性高，特异性强，试剂安全、易保存、操作简便。
乙型肝炎病毒目前检测的方法主要采用(1)血清学方法检测血清中
的乙肝“二对半”抗原和抗体；(2)PCR检测血清中乙肝DNA。
【实验方法】
1取已知包被抗体(抗HBs或抗HBe的单克隆抗体)，用包被液按1∶100稀释，然后用100
ul的移液器以每孔0.1ml加于微量反应板(聚苯乙烯板)内。
2将反应板置搪瓷方盘中，放4℃过夜，次日取出甩尽孔内液体，用洗涤液洗3次，每次3分
钟。
3洗涤后，每孔加入待检0.1ml血清标本和HBsAg/HBeAg阳性、阴性对照血清，将反应板置
湿瓷盘中放37℃作用2小时，取出按上法洗涤。
4加入辣根过氧化物酶标记的抗HBs(或抗HBe)抗体0.1ml于各孔中，置37℃作用2小时
，取出洗涤。
5加新鲜配制的邻苯二胺(OPD)底物0.1ml，放37℃作用30分钟后加终止液每孔0.1ml。通过
颜色反应来判断结果。
十衣原体、立克次体、支原体、螺旋体形态观察
【实验目的】
1观察衣原体、立克次体、支原体、螺旋体的形态特征。
2了解暗视野显微镜的使用方法。
【实验原理】
衣原体包括一类形态相似，能通过滤菌器，严格细胞内寄生，其发育繁殖有独特的生活周期
的微生物，引起沙眼的衣原体可在细胞内形成包涵体。立克次体是一类生物学性状介于细菌
和病毒之间的、天然寄生于一些节肢动物体内的专性活细胞内寄生的微生物，绝大多数在光
学显微镜下可见。支原体是一群介于细菌与病毒之间，能营独立生活的最小微生物，由于它
们体积微小，且缺乏细胞壁，普通染色后光学显微镜下不易见到单个支原体，电镜可见具有
典型的多形性。在无生命的人工培养基中能生长繁殖，形www.lindalemus.com/sanji/成细小菌落，用低倍镜观察可见“
油煎蛋状”菌落。螺旋体是一类细长、柔软、弯曲呈螺旋状的单细胞微生物，
在暗视野显微镜下容易观察到形态。
【实验内容和方法】
1沙眼包涵体观察
沙眼病人眼结膜刮片，经姬姆萨氏(Giemsa)染色，沙眼包涵体系嗜酸性胞浆内包涵体，染成
蓝色，位于上皮细胞内。
2立克次体形态及染色性
将斑疹伤寒立克次体给小白鼠腹腔注射，发病后取腹水涂片，姬姆萨氏染色，镜
检。镜下可见完整或破碎细胞，细胞核呈紫红色或紫色，细胞浆呈浅蓝色。在大单核细胞浆
内见有大量紫红色球杆状立克次体，多位于细胞浆内，呈蓝色或紫红色。
3肺炎支原体菌落观察
肺炎支原体在营养丰富的固体培养基上增殖多代后在低倍镜下观察，其菌落呈“油煎荷包蛋
”状，菌落中心部分长入培养基中，且较致密，周围环绕扁平、透明的边缘区。
4钩端螺旋体暗视野检查法
暗视野显微镜是将普通光学显微镜换装上特制的暗视野聚光器或者在普通光镜聚光器上加一
块中央遮光板改装而成。由于光线不能通过聚光器的中心部位透入物镜，而只能从周边斜射
经标本反射进入物镜，因此视野背景是暗的，标本成为亮点。使用暗视野显微镜可检查不经
染色，在普通显微镜下不易看清的活体微生物，如活的细菌、螺旋体等，它的缺点是不能观
察生物体的内部结构。
将钩端螺旋体培养液置清洁载玻片上，加盖玻片后，用暗视野显微镜观察，可在黑色的视野
中看到发亮、运动的钩端螺旋体。
十一病原性真菌的检查
【实验目的】
1了解病原性真菌的形态结构特点和浅部真菌的检查原则。
【实验原理】
真菌是一类不含叶绿素，无根、茎、叶分化，由单细胞或多细胞组成，行有性或无性繁殖的
真核细胞型微生物。真菌的种类繁多，大多数对人类有利，仅少数对人和动物致病，称之为
病原性真菌，包括浅部真菌和深部真菌两大类。真菌的微生物学检查，通常采用直接镜检和
培养检查，根据真菌特殊的菌丝、孢子形态和菌落特征来确定真菌的种类。
真菌的菌丝从结构上可分为有隔菌丝、无隔菌丝；从生长上分为营养菌丝、气中菌丝；从形
态上可分为梳状菌丝、球拍状菌丝、鹿角状菌丝、结节状菌丝、假菌丝等。真菌的无性孢子
可分为分生孢子(大分生、小分生孢子)和叶状孢子(芽生孢子、关节孢子和厚膜孢子)。真菌
的菌落形态有酵母菌落、类酵母菌落和丝状菌落。
【实验内容和方法】
一浅部真菌病临床标本(皮屑)检查
1标本的采取：标本采取前，应忌用药。发癣患者，可用拔毛镊子拔取脆而无光泽、易折
断或带有白色菌鞘的病损部毛发；手、足、体、股癣宜用钝刀轻轻刮取损害部位边缘皮屑；
甲癣可用小刀刮取病损指(趾)甲深层碎屑。
2标本制作：取少许皮屑或毛发标本于载玻片上，滴加10%氢氧化钠(钾)溶液1滴，加盖玻
片，置火焰上微微加热(以角质细胞溶解，标本透明为宜)，约5分钟。用镊子轻轻加压盖玻
片，使皮屑铺开变薄，驱除气泡，用滤纸吸取周围溢液。
3镜检：将制好的标本片置镜下，先用低倍镜下观察，如疑为菌丝孢子，将视野转向高倍
镜下观察。
【思考题】
1、为什么菌丝、孢子丝常作为真菌病诊断的主要依据?
2、怎样诊断癣?防治原则有哪些?
(龙北国张文炳赵卫)
