病原生物学出版教材-文字教材:高级医学微生物学(主编)第5章 细菌耐药性

图5-4  人类致病菌耐药性的出现

一、医院获得的耐药菌

（一)金黄色葡萄球菌

20世纪50年代最早出现耐青霉素金黄色葡萄球菌（以下简称金葡菌)，目前该菌青霉素敏感株已很少。70年代耐酶青霉素和头孢菌素的广泛应用，导致耐甲氧西林（或苯唑西林)金葡菌（MRSA)感染暴发流行，80年代波及全球。据美国疾病控制中心报道,1975年在美国MRSA检出率为2.4%,1991年高达29%，目前MRSA检出率占全部金葡菌的20%～50%。MRSA对各种抗生素的耐药率明显高于甲氧西林敏感金葡菌。

1993年北京地区金葡菌临床分离株中MRSA占12.2%，1998年上升为29.4%，增长速度居于中等水平，但重症监护病房（ICU)MRSA分离率高达90%。1999年广州地区MRSA检出率为53%。所检出的MRSA均呈多重耐药，以耐四环素、氯霉素、红霉素、克林霉素、氨基糖苷类为多，2000年，从全国51家医院分离的2191株金黄色葡萄球菌中，MRSA占29.8%。

1984年，喹诺酮类抗菌药物进入临床，北京地区几乎所有金葡菌分离株对喹诺酮类敏感，到1994年该菌对喹诺酮类的耐药率为9.5%，1995年竟高达49%，其中MRSA对喹诺酮类的耐药率可达91%（158/174)。1999年广州地区MRSA对环丙沙星耐药率高达84%。

有些MRSA菌株对几乎所有常用β-内酰胺类抗生素耐药，仅万古霉素有效。1997年，在日本和美国等相继发现万古霉素敏感性降低的金黄色葡萄球菌（VISA，MIC为8μg/ml)。VISA感染者患有严重基础性疾病，免疫力低下，因感染MRSA而服用万古霉素已达半年之久；在病房物品和与患者接触的医务人员中未检出VISA，表明VISA产生于抗菌治疗过程中。VISA的出现给临床医生敲响了警钟。目前，我国尚未检出万古霉素耐药金黄色葡萄球菌。

甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS)检出率更高。在美国，60%～79%表皮葡萄球菌耐甲氧西林。1999年广州地区凝固酶阴性葡萄球菌对甲氧西林的耐药率高达86%，并呈多重耐药性。2000年对我国51家医院共3 619株凝固酶阴性葡萄球菌耐药性检测发现，MRCNS检出率高达71.7%。静脉导管插管的大量使用大大增加了患者感染凝固酶阴性葡萄球菌的机会。

（二)革兰阴性杆菌

主要是肠杆菌科和假单胞菌属，包括大肠埃希菌、肺炎克氏菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽黄单胞菌和脆弱类杆菌等，其中最为重要的是产生超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBL)、AmpC β-内酰胺酶和多重耐药性的革兰阴性杆菌。在ICU，革兰阴性杆菌耐药性问题尤为突出，给临床抗感染治疗带来很大困难。

产ESBL菌株  随着第三代头孢菌素的问世和在临床上日益广泛的应用，细菌β-内酰胺酶编码基因发生突变，产生超广谱β-内酰胺酶。1982年首先在德国发现臭鼻克氏菌产生ESBL，它能灭活超广谱头孢菌素，包括第一、二代和第三代头孢菌素（头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松)，以及单环β-内酰胺类（氨曲南)，但对头霉素和碳青霉烯类敏感。之后，全世界许多地区不断有新的ESBL检出，它可分为TEM/SHV型和非TEM/SHV型二大类，产生菌主要是肺炎克氏菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌。尚未发现革兰阳性菌产生ESBL。

1996年，法国某教学医院检出51%肺炎克氏菌产生ESBL。1998年在美国对9777株革兰阴性杆菌进行药敏检测，大肠埃希菌和肺炎克氏菌对头孢他啶耐药率分别为10.3%和23.8%。1999年上海地区产ESBL肠杆菌科菌检出率为34.3%，其中以沟肠杆菌、肺炎克氏菌和大肠埃希菌为主，仅对碳青霉烯类（亚胺培南)和头霉素类（头孢美唑)高度敏感。同年，广州地区产ESBL革兰阴性杆菌检出率为38%，其中以大肠埃希菌和肺炎克氏菌多见。目前革兰阴性杆菌ESBL的携带率呈不断上升趋势。产ESBL菌常常具有多重耐药性，包括对氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素、氯霉素等耐药。

产AmpC酶和碳青霉烯酶菌株  随着新一代β-内酰胺类抗生素的广泛应用，阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌容易在染色体ampC基因调控下，产生新的β-内酰胺酶─AmpC酶。该酶能水解绝大多数类型的β-内酰胺类抗生素，克拉维酸亦不能抑制其活性，优先选择的底物是第三代头孢菌素，仅对碳青霉烯类（亚胺培南)和第四代头孢菌素（头孢吡肟、头孢匹罗)敏感。尤其是因完全去抑制突变而高产AmpCβ-内酰胺酶的菌株，临床上可供选择的β-内酰胺类抗生素更少。

阴沟肠杆菌因能产生AmpC酶，已迅速成为越来越重要的医院严重感染的病原菌，难治性日益突出，尤其是对免疫力低下的患者。

1988年，从铜绿假单胞菌中分离到含锌金属β-内酰胺酶，即碳青霉烯酶，能赋予碳青霉烯类、第三代和第四代头孢菌素耐药性，但不能灭活氨曲南。近年相继在嗜麦芽黄单胞菌和脆弱类杆菌中发现该酶。阴沟肠杆菌和粘质沙雷菌亦能产生碳青霉烯酶，但其活性部位不含锌原子，而是Ser残基。

多重耐药菌株  近年来，因外膜蛋白改变和/或主动外排系统作用而呈多重耐药的革兰阴性杆菌问题尤为突出。我国学者在1996～1997年进行了一次为期2年下呼吸道革兰阴性杆菌（共841株)耐药性检测，多重耐药性发生率为17%，对4种主要抗生素（第三代头孢菌素、氨基糖苷类、喹诺酮类和亚胺培南)中的2类产生耐药性为10%，3类产生耐药性为6%。大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌甚至出现耐“全部”抗菌药物的菌株。近年不动杆菌感染迅速增加，特别是在ICU因使用呼吸机而导致肺炎。该菌对第三代头孢菌素呈高度耐药，仅对亚胺培南仍保持较高的敏感性。

近年来，由于氟喹诺酮类药物广泛应用，大肠埃希菌和铜绿假单胞菌对环丙沙星的耐药性发展速度惊人。据上海某烧伤研究所报道，铜绿假单胞菌对氧氟沙星的耐药率从1990～1993年的20.7%上升到1993～1995年的51.5%。2000年，在我国大肠埃希菌对环丙沙星的耐药率已升至50%以上。

嗜麦芽黄单胞菌已成为呼吸ICU下呼吸道感染的常见病原菌，感染率有时高于铜绿假单胞菌。嗜麦芽黄单胞菌外膜通透性低，往往呈高度多重耐药性，对第三代头孢菌素、氨基糖苷类、环丙沙星和亚氨培南呈高度耐药率，对氨曲南无一敏感，对酶抑制剂无效。目前可选用的抗生素有磺胺类（SMZ/TMP)、多西环素、替卡西林/克拉维酸。

（三)肠球菌

主要包括粪肠球菌和屎肠球菌，对常用抗菌药物青霉素、头孢菌素、克林霉素等具有天然耐性，对氨基糖苷类、红霉素、氯霉素、四环素、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶、环丙沙星等呈获得性耐药，多重耐药肠球菌仅万古霉素惟一有效药。1987年，在英国最先发现耐万古霉素肠球菌（VRE)。1989年在美国VRE临床分离株检出率不到0.5%，而到1994年上升为14%，短短几年增加了20多倍，目前，VRE占所有肠球菌分离株的23%。VRE已在全球蔓延，主要引起医院感染，暴发流行多发生在ICU，病死率高。VRE常呈多重耐药性。

上海地区在1996～1998年期间共检测769株肠球菌，其中VRE占3%。1999年广州地区VRE检出率为9.5%。1999～2001年从我国79家医院收集的102株肠球菌临床分离株对万古霉素的耐药率为3.78%。可见，目前在我国VRE检出率不高。但随着万古霉素和去甲万古霉素的广泛应用，VRE感染可能将日趋严重。因此，必须从现在起严格控制万古霉素的适应证，以延缓耐药性的产生。

VRE的最大危害是可将万古霉素耐药基因传递给金黄色葡萄球菌、链球菌和产单核细胞李氏菌等。由于肠球菌对大多数抗生素具有耐性，第三代头孢菌素和抗厌氧菌药物 (如甲硝唑)的大量应用将成为VRE感染的危险因素。

1997年在美国发生一起万古霉素依赖型VRE（vancomycin-dependententerococci，VDE)医院感染暴发流行，VDE在不含万古霉素的培养基上不能生长。

（四)抗酸杆菌

包括结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌。20世纪80年代后期，结核病呈再次回升趋势，目前已成为传染病中的第一杀手和最大死因，全球每年新增1000万患者，已有5000万人携带耐药性结核分枝杆菌。据WHO1997年公布的35个国家调查结果，结核分枝杆菌的原发性耐药率平均为10.4%，获得性耐药率高达36%，以耐异烟肼、利福平、链霉素等一线药物为主；多重耐药结核分枝杆菌（MDR-TB，通常指至少耐异烟肼和利福平)检出率高，其中，原发MDR-TB发生率平均为1.4%，获得性MDR-TB发生率平均为13%。但在过去20年里，多重耐药结核分枝杆菌检出率在英国增长缓慢，1997年仅为1%～2%，原因不清。

1990年调查发现，我国结核分枝杆菌原发耐药率为28%，获得性耐药率为41%，属高耐药国家，其中MDR-TB较为严重。广东省1998年对40个监测点分离的1648株结核分枝杆菌耐药性分析表明，原发耐药率为18%，原发多重耐药率为5.3%，获得性耐药率为33.7%，获得性多重耐药率为15.7%。

随着艾滋病病毒感染的蔓延和流动人口的增加，多重耐药结核分枝杆菌的发生及传播将更为严重。

二、社区获得的耐药菌

经呼吸道传播的主要有肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和结核分枝杆菌；经粪—口途径传播的有志贺菌和沙门菌；通过性接触传播的主要是淋病奈瑟菌。

（一)肺炎链球菌

肺炎链球菌能引起严重的危及生命的疾病，全球每年死亡300～500万人，其中主要是儿童和老年人。20世纪40年代，肺炎链球菌对最常用的青霉素高度敏感（MIC，＜0.1μg /ml)。60年代在澳大利亚出现青霉素中度敏感株（MIC，0.1～1μg/ml)。70年代末在南非和80年代初在西班牙发现高水平青霉素耐药株（penicillinresistant S.pneumoniae，PRSP)（MIC，4～8μg/ml)。90年代耐药水平继续攀升，有的耐药株MIC竟高出杀死敏感株所需浓度的1000倍。

近年来，PRSP（包括中度敏感菌株)检出率呈明显上升趋势，在多个国家已超过10%。在美国，1989年PRSP检出率＜5%；到1996～1997年该菌对青霉素的耐药率高达34%，其中9%～14%为青霉素高度耐药株；1998年为29.5%。2001年据报道我国13家医院分离的肺炎链球菌中PRSP检出率为22.5%，其中高度耐药菌株为2.5%，但对四环素、大环内酯类、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶等耐药情况非常严重。随着青霉素口服制剂的广泛应用，与PRSP检出率高达50%～60%大周边国家和地区频繁交往，我国PRSP检出率将迅速增长。

目前，肺炎链球菌流行菌株起源于西班牙，其中MMSp23F株对青霉素、四环素、氯霉素等呈多重耐药，MMSp23F变异株对红霉素及第三代头孢菌素耐药。2001年，广州、北京、上海、西安四地肺炎链球菌对红霉素呈高度耐药（＞80%)，明显高于国外大多数国家。1998年在美国，肺炎链球菌对红霉素、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的耐药率分别为19.3%和31%。然而，在加拿大肺炎链球菌对以上药物仍维持较高敏感率。近年来，肺炎链球菌对喹诺酮类的耐药率不断上升。

尚未发现耐万古霉素肺炎链球菌。1999年，在116株肺炎链球菌临床分离株中发现3株万古霉素耐受株（被10倍MIC浓度药物抑制而不被杀死)，有可能进一步演变为万古霉素耐药菌株。

（二)流感嗜血杆菌

20世纪70年代初，氨苄西林取代氯霉素和四环素成为治疗流感嗜血杆菌感染的首选药物。1974年首次分离到产β-内酰胺酶的氨苄西林耐药株。1980年发现不产酶的耐氨苄西林菌株。近20多年来，氨苄西林耐药流感嗜血杆菌检出率逐年增加，遍布全球。

2000年，我国4家医院氨苄西林耐药流感嗜血杆菌检出率为10.3%（94/916)，与东南亚地区相当。所有耐药株对第二代头孢菌素头孢克洛和第三代头孢菌素头孢曲松高度敏感。1995～1997年上海某综合性医院对100多株流感嗜血杆菌检测发现，氨苄西林耐药率为25.5%，较欧美国家的耐药率高，可能与氨苄西林应用频率较高有关。此外，流感嗜血杆菌对磺胺甲噁唑/甲氧苄啶、红霉素亦产生耐药。

（三)淋病奈瑟菌

青霉素一直是治疗淋病的首选药物，但到20世纪70年代中期，出现产青霉素酶的淋病奈瑟菌（penicillinase-producing N.gonorrhoeae,PPNG)。80年代又出现不产青霉素酶的染色体介导的青霉素和四环素耐药菌株。PPNG流行率最高的是东南亚，1994年在菲律宾PPNG检出率高达70.7%，四环素耐药率为6.5%。同年在美国PPNG检出率为15.6%，四环素耐药率为21.7%，但对广谱头孢菌素大多敏感。2000年，在菲律宾和泰国淋病奈瑟菌分离株对青霉素的耐药率高达90%，在美国为42%。

我国20世纪80年代PPNG的检出率较低。1996～2001年期间，我国学者分离到794株淋病奈瑟菌，该菌对青霉素的耐药率由1996年的57.2%上升到2001年的81.8%，对四环素的耐药率变化不大，维持在80%左右，并出现同时耐青霉素和四环素菌株。

由于淋病奈瑟菌对青霉素和四环素出现耐药性，使得在治疗不复杂的淋病时不得不首选广谱头孢菌素和喹诺酮类等。正因为如此，近年来各地报道的PPNG虽呈下降趋势，但喹诺酮类耐药淋病奈瑟菌分离株明显增多。广东地区检测了1996～1999年期间收集的622株淋病奈瑟菌，对环丙沙星耐药率从1996年的17.3%猛增到1999年的78.4%，但对大观霉素和头孢曲松的耐药率较低，因此，这二种药物仍是目前治疗淋病的首选药物。

（四)志贺菌属

1959年在日本发现多重耐药痢疾志贺菌感染暴发。1990年布隆迪暴发流行的痢疾志贺菌对该国所有口服抗生素均呈耐药。北京地区在1994～2001年期间共检测327株志贺菌，1994年该菌对常用抗生素诺氟沙星和环丙沙星高度敏感，1999～2001年耐药检出率分别为6.4%和12.8%，虽低于1997～1998年，但中度敏感菌株检出率高达29.8%和76.6%，提示志贺菌对喹诺酮类的耐药性将呈迅速增长趋势。志贺菌对以前常用的四环素、氨苄西林、氯霉素、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶等耐药率高，但对氨基糖苷类、头孢菌素

类呈高敏感性。2001年，上海地区检出的60株志贺菌对磺胺甲噁唑/甲氧苄啶和氨苄西林耐药率呈上升趋势，但对氧氟沙星、第三代头孢菌素的敏感率一直保持较高水平。可见，志贺菌对喹诺酮类的耐药率与各地使用该类药物的频率有关。

（五)沙门菌

由于抗菌药物作为生长促进剂在食源性动物中广泛应用，沙门菌耐药性问题日益严重。例如，1998～2000年，国家细菌耐药监测中心从45家医院共收集伤寒和副伤寒沙门菌237株，除磺胺甲噁唑/甲氧苄啶外，该菌对常用抗菌药物如氯霉素、氨苄西林、环丙沙星和第三代头孢菌素仍呈高度敏感。而122株非伤寒沙门菌对氨苄西林、四环素、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的耐药率高，对环丙沙星和第三代头孢菌素的耐药率呈上升趋势。不同地区伤寒沙门菌有其不同耐药谱。多重耐药的伤寒沙门菌在部分地区检出率较高，最多可耐8种抗生素，使得临床治疗变得极为棘手。

需要特别强调的是，耐药菌的出现和变迁与抗生素广泛应用密切相关（表5-1)。

表5-1  临床常见耐药菌及其变迁

第四节  耐药性产生的生化机制

抗生素抑制细菌生长或杀死细菌，必须能够：①穿过细菌外膜或肽聚糖层或细胞膜，到达作用部位；②经受各种灭活酶的攻击；③与参与细菌基本功能的结构相互作用，并充分地抑制该功能。细菌对抗生素耐药正是在这几个环节上构成防御体系的结果。

一、灭活作用

灭活作用(i医学全.在线nactivation of drug)是细菌产生耐药性的最重要方式。细菌被诱导产生灭活酶，通过修饰或水解作用破坏抗生素，使之转化成为无活性的衍生物。常见的灭活酶有β-内酰胺酶（如青霉素酶、头孢菌素酶)、氨基糖苷类修饰酶（乙酰转移酶、磷酸转移酶、核苷酸转移酶)、红霉素酯酶和氯霉素乙酰转移酶等。

氨基糖苷类修饰酶能将氨基糖甙类抗生素的游离氨基乙酰化，将游离羟基磷酸化、核苷化，使药物不易进入菌体内，也不易与细菌内靶位（核糖体30S亚基)结合，从而失去抑制蛋白质合成的能力。

β-内酰胺酶可破坏β-内酰胺环而使β-内酰胺类抗生素活性失去或减低，这是大多数病原菌耐β-内酰胺类抗生素的主要机制。G^＋菌中只有葡萄球菌产生β-内酰胺酶，可有效地水解天然和半合成的青霉素类抗生素（苯唑西林和甲氧西林除外)，但对头孢菌素不起作用。

革兰阴性杆菌产生的β-内酰胺酶种类很多，不仅在结构上，而且在底物特异性上各不相同（表5-2)。在活性部位大多数是Ser残基，少数是含锌金属酶。其中以TEM-1最普遍，分离阳性率达90%以上。除A类碳青霉烯酶外，均可由质粒介导，由染色体介导的有窄谱β-内酰胺酶和A类碳青霉烯酶。

表5-2  β-内酰胺酶的分类和特性

20世纪80年代，发现肺炎克氏菌和大肠埃希菌能产生超广谱β-内酰胺酶（ESBL)，ESBL属于窄谱β-内酰胺酶TEM-1/TEM-2和SHV-1的衍生物，其中SHV-2呈国际性分布。90年代，法国最先报道铜绿假单胞菌能产生非TEM和非SHV型ESBL，命名为PER-1，之后，相继在多个国家不同菌种中发现。非TEM/SHV型ESBL与TEM/SHV型酶仅有25%～38%氨基酸具有同源性。目前ESBL至少有140多种，已在世界各地流行，其中TEM/SHV型ESBL在临床上检出率较高。产ESBL细菌对大多数β-内酰胺类抗生素耐药（除头霉素和碳青霉烯类外)。

二、靶位改变

细菌通过产生诱导酶对抗生素的作用靶位进行化学修饰，或通过基因突变造成靶位变异（alteration of target site)，使抗菌药物不能与靶位结合或亲和力下降，失去杀菌作用，但细菌生理功能正常（表5-3)。

表5-3  靶位改变与耐药性

青霉素结合蛋白（PBP)  β-内酰胺类抗生素与其作用靶位PBP结合后，可干扰肽聚糖的正常合成，导致细菌死亡。但是，某些G^＋菌（如肺炎链球菌)和G^－菌（如淋球菌、铜绿假单胞菌)能改变其PBP的结构，使之与β-内酰胺类的亲和力降低而导致耐药。肺炎链球菌不产生β-内酰胺酶，PBP发生改变在耐药性形成上具有非常重要的作用。

甲氧西林耐药金葡菌（MRSA)能产生一种新的低分子量PBP-2＇或PBP2a（76kDa)，对所有β-内酰胺类抗生素具有低亲和性，因而在β-内酰胺类抗生素存在的条件下，虽然细菌表面正常的5种PBP被抑制，不能发挥正常生理功能，但PBB-2＇不被抑制，可作为转肽酶完成细胞壁的合成，使细菌对β-内酰胺类耐药。万古霉素中度耐药金葡菌（VISA)耐药机制尚不清楚，VISA日本分离株产生3～5倍的PBP2和PBP2a，具有2倍厚的细胞壁，同时削弱了肽链之间的连接，提示耐药性可能与细胞壁的合成有关。

核糖体  核糖体30S亚基S12蛋白发生构象变化，链霉素失去结合受体而不能发挥抑菌作用。肺炎链球菌能产生甲基化酶，使23SrRNA上的一个关键性的腺嘌呤残基甲基化，使大环内酯类抗生素与靶位即核糖体50S亚基结合力下降而导致耐药。

二氢叶酸代谢酶  甲氧苄啶（TMP)通过抑制二氢叶酸还原酶（Mr21000)而杀菌，但耐药菌能产生大量的功能相同的新蛋白（Mr21000)，不被TMP抑制。细菌改变二氢叶酸合成酶构型，与磺胺药的亲和力下降100倍，敏感菌转为耐药菌。

三、药物累积不足

减少药物吸收(reduced drug uptake)  由于细胞壁的有效屏障或细胞膜通透性的改变，阻止药物吸收，使抗生素无法进入菌体内发挥作用。例如，分枝杆菌的细胞壁存在异常紧密的结构，通透性极低；铜绿假单胞菌外膜上由孔蛋白构成的蛋白通道较特殊，通透能力比大肠埃希菌低100多倍，加之生物膜（biofilm)的形成而使抗菌药物不易进入菌体，故结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌对众多的抗菌药物呈现明显的天然耐药性。

革兰阴性菌具有选择性低通透性的外膜屏障（图5-6)，微孔蛋白通道对一些抗菌药物的进入具有阻碍作用，故对许多抗菌药物产生抗性；而G^＋菌无外膜屏障，对许多疏水性抗生素（如β-内酰胺类)更为敏感。在接触抗生素后，细菌可改变外膜孔蛋白的组成或减少其数量（如OmpF和OmpC的表达减少)，降低外膜通透性，产生获得性耐药，如鼠伤寒沙门菌对多种抗生素耐药，即为其缺乏蛋白通道。亚氨培南通过特殊通道OprD₂扩散，铜绿假单胞菌因缺乏OprD₂而呈耐药。

外膜屏障与β-内酰胺酶具有明显的协同作用，即通透性降低可使有效的酶灭活系统作用加强。

图5-6  革兰阳性菌（右)和阴性菌（左)细胞壁结构图

增加药物排出(enhanced drug efflux)  近年研究发现，细菌产生多重耐药性的主要原因是，具有能量依赖性的主动外排系统，可将不同结构的抗生素（如氯霉素、大环内酯类、氟喹诺酮类、β-内酰胺类等)同时泵出体外，使菌体内的抗生素浓度明显降低，不足以杀死细菌。细菌还具有仅排出一种或一类抗菌药物的“单”耐药系统，如最早发现的大肠埃希菌四环素主动外排泵，能通过质膜蛋白TetA利用跨膜氢离子梯度，即质子驱动力（protonmotive force，PMF)作为能量，将累积到一定浓度的四环素泵出胞外，阻止它作用于靶位核糖体。

根据组成和外排机制，主动外排系统可分为主要易化家族、肿瘤耐药性调节分化家族、葡萄球菌多重耐药家族和ATP结合转运器；按能量依赖形式，可分为二类：①具有2个跨膜单位和2个ATP结合单位，利用ATP-Na^＋-K^＋泵作动力；②单跨膜单位，利用质子泵作动力进行反向转运。

主动外排系统通常由外排转运蛋白、外膜通道蛋白和连接蛋白（或辅助蛋白)三部分组成。例如，铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排系统包括（图5-7)：①MexB：具有主动转运功能，镶嵌在细胞膜；②OprM：位于细胞外膜，具有孔蛋白的作用；③MexA：为辅助蛋白，存在于外膜和膜之间，起连接MexB和OprM的作用。

图5-7  多重耐药菌主动外排泵模式图

β-内酰胺类抗生素经外膜孔蛋白进入膜间隙，结合于细胞膜外侧，可被MexB捕获，借助MexA辅助蛋白的桥联作用，经OprM排出菌体。非β-内酰胺类抗生素经外膜孔蛋白进入膜间隙后，通过扩散等过程穿过细胞膜进入菌体，MexB可以在细胞膜内侧捕获这些抗生素，经过MexA和OprM排到协同作用细胞外。

MexAB-OprM等主动外排系统与外膜通透性降低的协同作用，使得铜绿假单胞菌对多种类型的抗菌药物耐药，

具有抗菌药物主动外排系统的病原菌主要是：大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克氏菌、流感嗜血杆菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌和结核分枝杆菌等，常见的细菌主动外排系统有大肠埃希菌TetA、AcrAB，金黄色葡萄球菌NorA，铜绿假单胞菌MexAB-OprM，淋球菌MtrCDE等。但伤寒沙门菌、志贺菌未见主动外排系统，这可能是这两种病原菌耐药性上升较为缓慢的原因。目前尚未发现能够泵出氨基糖苷类抗生素的主动外排系统，可能与其独特的化学结构有关。

四、其他

细菌可通过增加抗菌药物作用靶位的产量而耐药，如磺胺类耐药金黄色葡萄球菌对氨基苯甲酸产量可为敏感株的20倍。

值得注意的是，细菌对某一抗菌药物可能存在多种耐药机制（表5-4)。

表5-4  细菌对常用抗生素的耐药机制

第五节  耐药性产生的遗传（分子)机制

细菌耐药性可分为固有耐药和获得性耐药，前者是由细菌染色体基因决定的，可代代相传；后者是通过染色体基因突变或耐药基因转移而产生，其中，质粒介导的耐药性远比染色体介导的耐药性普遍，主要原因是：

（1)当细菌在无抗生素环境中生长时，耐药基因显然是不重要的。为减少遗传和生理负荷，耐药基因保持在质粒上是明智的，这样并不需要某一菌种的所有成员都保持一个特定的R质粒，只需少数细菌携带R质粒，在抗生素应用选择压力下，可确保携带R质粒的菌株存活，维持繁衍。

（2)质粒除了垂直传播外，易在同一菌种和不同种属之间发生水平转移，因此，耐药基因在质粒上比在染色体上更易于快速转移。

（3)质粒通常是转座子和整合子的载体，而转座子和整合子常常携带耐药基因。

一、固有耐药

细菌染色体上带有编码耐药性的基因。细菌耐药基因可能起源于产生抗生素的微生物，但不是唯一来源。细菌看家基因（housekeeping gene)编码产物如糖激酶、蛋白激酶和乙酰转移酶在长期进化过程中演变为氨基糖苷类修饰酶等。固有耐药具有种属特异性，如多数革兰阴性菌耐万古霉素和甲氧西林，肠球菌耐头孢菌素，厌氧菌耐氨基糖苷类药物等。

二、基因突变

染色体发生基因突变（gene mutation)可使细菌获得耐药性。细菌耐药性自发突变的频率通常为10^-10～10^-7，即当一个细菌分裂成10⁷～10¹⁰子代才有一次突变出现，可能产生对某一抗生素的耐药现象。由突变产生的耐药性一般只对一种或两种相类似的药物耐药，且比较稳定。细菌耐药性基因突变是随机发生的。发生突变的细菌事实上只是大量菌群中的极个别菌，并且耐药菌生长较慢，因此，在自然界中耐药菌仅居次要地位。

基因突变在耐药性发展上起有非常重要作用，如产超广谱β-内酰胺酶的革兰阴性菌、耐多药结核分枝杆菌等均与基因突变密切相关，将在本节末详述，现以氟喹诺酮类和大环内酯类抗菌药物耐药加以说明。

DNA解旋酶  革兰阴性菌（如大肠埃希菌、淋球菌)对氟喹诺酮类抗菌药物耐药主要与DNA旋转酶A亚基（GyrA)的基因突变有关。gyrA基因位于染色体上。采用PCR─直接测序法研究发现，在gyrA基因5＇端存在一个基因突变热区,即喹诺酮耐药决定区(quinoloneresistance determing region,QRDR)，与氟喹诺酮类耐药性的产生密切相关。QRDR负责编码GyrA N端靠近催化活性部位122位Tyr的一段氨基酸。QRDR发生基因突变，则不能产生完整的GyrA亚基，或GyrA亚基发生氨基酸替换。

比较不同的氟喹诺酮类耐药病原菌QRDR编码的氨基酸序列，发现导致细菌对喹诺酮类敏感性下降或完全耐药的最为关键的突变热点是，对应于大肠埃希菌GyrA的第83位Ser和第87位Asp。大多数引起耐药性的突变发生在DNA旋转酶二聚体界面和与抗菌药物的结合位点。第83、87等位点的氨基酸替换导致GyrA构型的改变，进而影响到与氟喹诺酮类药物的结合，或干扰药物-GyrA酶-DNA相互作用，产生耐药性。

近年发现，革兰阳性球菌（如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌)对氟喹诺酮类耐药主要与DNA拓扑异构酶Ⅳ基因突变密切相关。金黄色葡萄球菌（GrlA) 第80位Ser和84位Glu的密码子的突变，对喹诺酮类耐药性的形成最为重要。

核糖体50S亚基  细菌核糖体50S亚基发生基因突变，使大环内酯类药物不能与之结合，因而不能发挥抗菌作用。例如，目前临床上常用含克拉霉素的短程三联疗法根除幽门螺杆菌，但克拉霉素耐药菌株的出现将导致疗效降低或治疗失败。应用基因分型法，比较治疗前从患者体内分离的克拉霉素敏感株与治疗后的克拉霉素耐药株，结果二者DNA指纹相同，提示突变株来自同一个克隆，并非感染新的菌株。用PCR扩增幽门螺杆菌23SrRNA基因，再进行限制性酶切片段长度多态性（RFLP)分析或直接测序，发现在耐药株23SrRNA基因2143和2144残基上存在A→G点突变，2143上还存在A→C点突变，表明幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性与23SrRNA基因点突变密切相关。

三、基因转移

耐药菌株（供体菌)可将耐药基因转移至敏感菌株（受体菌)中，使后者获得耐药性。基因转移(gene transfer)是细菌耐药性迅速扩散的主要原因。携带耐药基因的基因转移元件主要有质粒（plasmid)、接合型转座子（transposon，Tn)和整合子（integron)。耐药基因在细菌间可通过接合（conjugation)、转化(transformation)、转导(transduction)和转座(transposition)方式转移。

（一)接合

质粒接合转移  质粒是细菌染色体外的遗传物质，大多由闭合环状的双链DNA组成。质粒具有自我复制的能力，所携带的基因往往赋予宿主菌新的生物学性状，增加细菌在不利环境下的存活机会。

两个细菌通过性菌毛直接接触，供体菌将质粒（或染色体)DNA转移给受体菌内，使受体菌获得新的遗传性状，这一现象称为接合（conjugation)。G^＋菌之间亦可发生接合转移，但与菌毛无关，而是受体菌首先分泌一些物质，诱导供体菌产生一种蛋白质（凝集因子)，将两个细菌聚集在一起，然后形成DNA转移所需的小孔。

图5-8  R质粒及其接合转移示意图

耐药性质粒  亦称R质粒（resistanceplasmid)，可存在于G^－菌和G^＋菌中，最先在志贺菌中发现。R质粒至少由两部分构成（图5-8)：① 耐药传递因子（resistancetransfer factor)，能编码性菌毛，决定自主复制与接合转移；② 耐药决定因子(resistance determinats)，含耐药基因，能赋予宿主菌的耐药性。

r决定子可有多个转座子（Tn)或耐药基因盒（resistancegene cassetts)连接相邻排列，构成一个多耐药基因的复合体，这是造成多重耐药的原因。例如，阴沟肠杆菌携带一个69kb多重耐药性质粒pBWH301，包含4个耐药基因，其中aacA和aadB编码氨基糖苷类抗生素（如阿米卡星、庆大霉素等)耐性，sull和chl分别决定磺胺药物和氯霉素耐性。目前，多重耐药（氯霉素、四环素、链霉素、磺胺药物)的沙门菌、志贺菌、变形杆菌等革兰阴性杆菌已大量存在于人及动物肠道中。

R质粒从耐药菌传递给敏感菌，使后者变为耐药菌。R质粒不仅在同一种属细菌间转移，而且可在不同种属细菌间互相传递，从而造成耐药性的广泛传播。R质粒以接合方式传递耐药性在G^－菌尤其是肠道杆菌中比较普遍。研究发现，不同大肠埃希菌菌株之间能发生R质粒转移；伤寒沙门菌能将R质粒传递给大肠埃希菌，反过来，大肠埃希菌也可将不同来源的R质粒转移给伤寒沙门菌和痢疾杆菌。大肠埃希菌比其它致病菌更易接受R质粒，已成为人和动物体内耐药基因储存库。动物间的肠道细菌亦存在广泛的耐药基因转移现象，且动物的耐药菌又有可能传递给人。带有多个耐药基因的R质粒转移导致多重耐药的肠道杆菌日益增加，给临床治疗带来很大困难。

    （二)转化

耐药菌（供体菌)死亡溶解后释放出的DNA片段进入敏感菌（受体菌)体内，其耐药基因与敏感菌中的同源基因重组，使敏感菌转呈耐药。由于进入敏感菌体内的DNA量很少，因此很少有2种或2种以上耐药基因同时转移。

直接的DNA转化可发生在抗感染治疗的过程中。有研究表明，释放到环境中的DNA很稳定，具有穿透细胞膜而实现转化的能力。

（三)转导

转导（transduction)是指以温和噬菌体为媒介，将供体菌DNA片段转移到受体菌内。温和噬菌体感染细菌后不增殖，不裂解细菌，但核酸整合到细菌染色体DNA上，成为细菌DNA的一部分，与细菌染色体一起复制，当细菌分裂时又能传至子代细菌（图5-9)。整合到细菌染色体上的噬菌体核酸称为前噬菌体(prophage)，带有前噬菌体的细菌称为溶原性细菌(lysogenicbacterium)。

少数溶原性细菌的前噬菌体可从染色体上脱离，进行增殖，装配成新的子代噬菌体，使细菌裂解，转变成溶菌周期。大约在10⁵～10⁷次装配中发生一次错误，将大小合适的供体菌DNA片段误装入噬菌体头部蛋白质外壳中，成为“假噬菌体”或转导噬菌体。当再度感染受体菌时，可将供体菌DNA带入受体菌内（图5-9)。

图5-9  普遍性转导机制

与转化方式相比，转导可转移更大片段DNA，而且由于包装在噬菌体的蛋白质外壳中，可免受DNA酶降解，故DNA转移效率高。由于噬菌体有特异性，故耐药性转导的现象仅能发生在同种细菌内。

转导是金黄色葡萄球菌转移耐药性的重要方式。例如，金葡菌对苄星青霉素耐药的主要机制是质粒介导的青霉素酶，但这类质粒不像革兰阴性菌的R质粒是由RTF传递的，而是通过噬菌体转导方式将耐药性转移到敏感菌。金葡菌对其他β-内酰胺类抗生素、氯霉素、四环素和红霉素等的耐药基因，也可以噬菌体为媒介传递给敏感菌。

此外，转座子和整合子也可经温和噬菌体这一载体转移。

（四)转座

转化或转导机制难以解释耐药基因的可移动性及染色体基因插入质粒的频率，因为基因重组常常仅在具有高度同源性的DNA区域之间发生，这提示还存在其他的基因转移元件，即转座子和整合子。

转座子  是一个DNA片段，可在质粒之间或质粒与染色体之间随机转移（即插入或切离)，故称之为“跳跃基因元件”。转座子在质粒之间或质粒与染色体之间的自行转移现象，称之为转座。

最早发现的转座子（Tn)是在R质粒上带有抗药基因的Tn。与质粒不同，转座子不能独立复制，必须依附在染色体、质粒或噬菌体上与之同时复制。转座子大小为2000～8 000bp，在结构上分为二个部分（图5-13)：中心序列和2个末端反向重复序列。中心序列带有遗传信息，包含3个主要的功能基因，即：①tnpA基因：负责编码转座酶（整合酶)。该酶能特异识别Tn及其受体靶位点两端的DNA序列，使Tn与靶点序列交错接合；②tnpR基因：编码产物具有解离酶和抑制tnpA与tnpR转录的阻遏蛋白的功能；③结构基因：决定细菌的耐药性和某些毒力因子，通常带有一种或多种耐药基因。

转座子通常整合在细菌基因组中。转移时，首先自行剪切形成一个不能复制的环状中间体，整合到载体质粒或噬菌体上，然后经接合或转导方式转移至受体菌。如果载体在新宿主中不能复制和生存，转座子则可能整合到受体菌基因组中。

转座子插入某一基因时，一方面可引起插入基因失活产生基因突变，另一方面在插入部位又引入一个或多个耐药基因，使细菌产生耐药性或多重耐药性。转座子可在质粒之间或质粒与染色体之间容易发生自行转移，不需要核苷酸碱基对同源就能插入；宿主范围很广，可在G^－菌和G^＋菌之间转移，故而促进耐药性的产生和迅速扩散。

整合子  是大小为800～3 900bp的可移动的基因元件，含有位点特异性重组系统决定子，能捕获外源基因，尤其是抗生素耐药基因。整合子由5＇端高度保守的核心区和3＇端高度可变的结构基因区组成，前者编码DNA整合酶，并包括attI重组位点，后者包括1个或多个基因盒（genecassetts)的中心序列（图5-9)。许多耐药基因，如编码氨基糖苷类、β-内酰胺类、氯霉素、TMP等耐性的基因，以插入形式存在于整合子中，这些耐药基因包含在可移动的基因盒中。

图5-9 整合子结构图

基因盒含有耐药基因和位于3＇末端的59碱基单元（59base element,59be)（图5-9)59be亦称为重组位点，是不完全的反向重复序列。不同基因盒的重组位点在序列和长度上不尽相同，但都具有末端重复序列，能被整合子编码的DNA整合酶所识别，在基因捕获过程中发挥关键性作用。通过位点特异性重组，基因盒能插入到整合子的DNA整合酶基因邻近的attI（Int特异重组)位点，成为整合子的组成部分，因此，耐药基因盒可从一个整合子转移到另一个整合子，使整合子中耐药基因不断积累，成为多重耐药整合子。

基因盒的起始密码子位于盒的一端，通常不含启动子，但可从整合子的一个共同启动子P_ant开始表达。P_ant在整合子的保守区内，大小为214bp，位于基因盒5＇端。耐药基因的表达受启动子变异和基因盒插入部位的影响。

自然界存在的整合子对所插入基因盒的数量和次序没有任何限制，而基因盒又是分散的遗传单位，能被整合酶单独移动，因此，整合子插入区域的基因盒排列能通过剪接、重组或插入而发生改变。正是由于碱基序列的重新组合，导致耐药基因扩大，细菌的耐药水平不断提升。通过转座方式，整合子和转座子可导致在单个质粒中多个耐药基因聚集成簇，这是多重耐药菌株产生的重要原因，

目前已鉴定出40多种抗生素耐药基因盒，可以整合到整合子中。研究表明，许多临床分离菌株都带有整合子，如整合子可介导传播超广谱β-内酰胺酶（ESBL)编码基因。整合子常存在于临床耐药菌株质粒和转座子上，能在不同细菌之间转移，近年来已经在医院蔓延，它们的出现已削弱许多抗生素的有效性。

总之，自然界（包括人体正常菌群)肯定存在一个相当大的抗生素耐药基因（或与之密切相关的基因)库，细菌复制子及其宿主菌之间的“基因流”很可能是经常性的而不是偶然的，以便对外界环境变化作出快速反应。当病原菌暴露于强大的抗生素选择压力下，即处于生死关头，这一基因库随时对细菌开放，使细菌迅速摄取耐药基因获得耐药性，渡过不良环境。不难想象，在微生物王国，耐药基因的水平传播（耐药基因转移)和垂直传播（耐药菌克隆扩散)十分频繁。

四、耐药基因转移元件的稳定性

尽管获得新的耐药基因是耐药菌株增多的一个重要因素，但关键的是耐药基因转移元件的稳定性。耐药基因转移元件能迅速适应新的宿主，甚至在无抗生素选择压力时也不易丢失，这或许能解释耐药性日益增多而难以逆转的原因之一。

在抗生素选择压力不存在时，R质粒保持稳定的策略之一是，同时携带能赋予另一选择优势的基因（如编码能增强定植能力的酶)，从而为耐药基因的稳定提供一个长期选择压力。整合子的存在对质粒稳定也十分重要。整合子含有参与基因位点特异性整合的整合酶和启动子，为外来基因盒提供一个整合位点，以捕获外源耐药基因，产生多重耐药性。整合子的中心序列不仅有抗生素耐药基因，而且常常有重金属耐性基因，因此，重金属污染或牙科填充物汞合金也能提供选择压力，在无抗生素应用时得以保持质粒及其基因簇的稳定性。转座子在大多数宿主中相当稳定，原因可能是，转座子不能自我复制，而是整合到宿主基因组中，并可进行基因重排。

自然界中分离获得的耐药菌株耐药性的稳定性似乎已成定论，微生物产生的耐药突变很可能在进化历程中很难回复成为敏感菌株，如肺炎链球菌在无抗生素选择性培养基传代培养数百代后，仍然保持多重耐药性，这提示阻止耐药性最好时机是细菌产生耐药性之前，即第一时间阻止耐药基因的获得。采取措施越早，细菌耐药性发展越慢。

五、一些重要病原菌的耐药分子机制

（一)结核分枝杆菌

迄今未发现结核分枝杆菌由质粒或转座子介导耐药的报道，故染色体介导的耐药性显得十分重要。结核分枝杆菌对不同药物耐药突变的染色体位点互不相连，不会因某位点突变而产生多重耐药菌株，因此，染色体多个耐药基因突变的逐步累加是多重耐药结核分枝杆菌产生的分子基础。由于单药治疗、药物剂量不足及不规则用药，可使结核分枝杆菌敏感菌株在几个月内对多个药物转呈耐药。

对异烟肼（INH)耐药  与一个或多个基因的突变有关，包括katG（编码过氧化氢-过氧化物酶)、inhA（编码烯酰基enoyl-ACP还原酶)和kasA（编码β-酮酰基载体蛋白合成酶)等。KatG、InhA和KasA与分枝菌酸生物合成有关。结核分枝杆菌摄取INH后，KatG氧化INH，形成活性中间产物，后者可抑制enoyl-ACP还原酶的活性，导致细胞壁中分枝菌酸合成减少；INH亦可通过与KasA结合，干扰分枝菌酸的合成，引起细菌死亡。

katG基因大小为4 795bp。采用PCR-SSCP法研究发现，部分INH高耐药菌株的katG基因完全缺失，但大部分INH耐药菌株在katG的中心部位有突变，从而导致在酶活性上起关键作用的氨基酸残基发生改变（主要是羧基端Arg⁴⁶³→Leu和氨基端Ser³¹⁵→Thr)，KatG的活性降低或丧失，INH不能转化为活性形式。可见，katG基因完全缺失和突变是结核分枝杆菌INH耐药的分子机制之一。

在约25%IHN耐药菌株中，发现inhA调节基因序列突变，可能使enoyl-ACP还原酶过度表达，其数量超过了INH抑制作用，故产生耐药。

在KatG和inhA基因均未发生突变的INH耐药菌株中，kasA基因存在突变，干扰INH与KasA的结合，分枝菌酸得以合成，导致耐药性产生。

KatG、医学三基inhA和kasA基因突变可解释80%结核分枝杆菌临床分离株耐INH机制，但仍有20%耐INH菌株这三个基因均未发生变异。

对利福平耐药  与几乎所有耐利福平细菌一样，97%结核分枝杆菌临床分离株也是由于编码RNA聚合酶β亚单位的rpoB基因突变，使该酶不再与利福平结合而耐药。在rpoB基因中央附近69bp的高变区域内，存在35种以上不同的错义突变，其中以Ser⁵³¹→Leu和His⁵²⁶→Tyr的2种突变最为常见，约占总突变65%以上。

对链霉素耐药  链霉素不可逆地结合在核糖体30S亚基（包括16SrRNA和核糖体蛋白S12某个位点)，从而阻止细菌蛋白质合成的起始。结核分枝杆菌对链霉素耐药大多是由于rrs（编码16SrRNA)和rpsL（编码S12蛋白)基因发生突变所致。这二个基因突变使16SrRNA和S12蛋白的结构发生改变，前者多发生在530环区和第904位碱基，后者主要是Lys^43/88→Arg，从而破坏了链霉素与16SrRNA和S12的相互作用，导致耐药。

对吡嗪酰胺耐药  吡嗪酰胺在细胞内酸性环境中经吡嗪酰胺酶作用转变成吡嗪酸而发挥杀菌作用。大多数吡嗪酰胺耐药株吡嗪酰胺酶编码基因pncA发生改变，包括核苷酸丢失、插入、转换或颠换，使酶活性丧失或降低。pncA基因突变的位点高达100多个，且呈弥散分布。

（二)产ESBL肠杆菌科

超广谱β-内酰胺酶（ESBL)产生的分子机制仍不十分明确，可能涉及：

（1)基因突变：某些窄谱β-内酰胺酶可通过耐药结构基因或其侧翼调控序列的突变，产生ESBL。TEM/SHV型ESBL来源于母体酶TEM-1和SHV-1。比较大肠埃希菌ESBL和70%青霉素耐药菌株野生型β-内酰胺酶的氨基酸序列，发现在活性部位（或与之相邻部位)通常仅存在1～3处差异（表5-5)，如β-内酰胺酶SHV-1活性部位1个氨基酸的置换后即变为超广谱β-内酰胺酶SHV-2，能灭活第三代头孢菌素。ESBL基因克隆和测序结果表明，氨基酸改变是β-内酰胺酶基因发生点突变的结果。因此，编码β-内酰胺酶基因的1个碱基变化，往往使得价值超亿美元的医学研究成果化为乌有。

β-内酰胺酶容易发生基因突变的可能原因是，β-内酰胺酶只有1个活性部位，不需要与任何辅助因子相互作用，而其他的抗生素修饰酶通常有2个活性结合部位。

表5-5  超广谱β－内酰胺酶活性部位的氨基酸改变

━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

氨基酸所处位置

   β－内酰胺酶  ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

  39 104   164   205   237   238   240   265  

━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

   TEM-1*  Gln   Glu   Arg   Gln   Ala   Gly   Glu   Thr

   TEM-2*     Lys  

  TEM-3   Lys   Lys  Ser  

   TEM-4   Lys  Ser  Met

   TEM-6   Lys   His

   TEM-17  Lys

   TEM-19 Thr

   SHV-1*  Gln   Asp   Arg   Arg   Ala   Gly   Gla   Leu

  SHV-2  Ser

    SHV-3  Leu  Ser

   SHV-4  Leu  Ser   Lys 

━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

  *：亲本型，缺乏超广谱酶活性

（2)基因转移：绝大多数ESBL由转座子编码产生，少数由整合子编码。该转座子定位于一个可自行移动的R质粒上。转座子能以转座方式插入到不同质粒中，之后，通过质粒接合转移，ESBL编码基因容易在同种或不同种属的G^－菌之间传播。从同时期不同感染个体、不同种属或不同基因型菌株中可分离到相同耐药质粒，临床上常见的肠杆菌科致病菌均可携带编码ESBL的R质粒，提示接合性质粒在介导ESBL的传播中发挥重要作用。但亦有少数携带ESBL基因的质粒为非接合性质粒。

ESBL产生菌存活时间较长，可籍人类活动在同一医院或不同医院传播，甚至造成更远距离传播。产ESBL菌曾在欧洲引起暴发感染，因缺乏有效药物难以控制。

（三)耐青霉素肺炎链球菌

肺炎链球菌对β-内酰胺类耐药不由质粒介导，亦不产生β-内酰胺酶，主要是由于青霉素结合蛋白（PBP)发生改变，导致PBP与抗生素的亲和力下降所致。肺炎链球菌含有6种PBP，即PBP1a、PBP1b、PBP2a、PBP2b、PBP2x和PBP3，在青霉素耐药菌株（PRSP)中，至少有3种PBP与青霉素的亲和力下降，即PBP1a、PBP2b和PBP2x，对超广谱头孢菌素耐药主要涉及PBP1a和PBP2x。突变主要发生在PBP的青霉素结合区，PBP结构和种类变化越大，耐药水平越高。

低亲和力的PBP是由变异的pbp基因编码。DNA序列分析显示，所有青霉素敏感株的pbp1a、pbp2b和pbp2x基因序列完全相同，而耐药菌株则各不相同，例如，不同的PRSP南非分离株的pbp2b基因有多个DNA片段发生替换（图5-10)，DNA序列差异高达25%。变异的pbp基因呈“镶嵌（mosaic)”结构。这些高度变异区与青霉素耐药草绿色链球菌pbp基因相对应区具有高度同源性。

图5-10  镶嵌型和野生型pbp2b基因的比较

［注：阴影区域：供体菌耐药基因；空心区域：野生型DNA；a：肺炎链球菌青霉素敏感株pbp2b基因；b：草绿色链球菌pbp基因（阴影区域)；c～h：PRSP菌株镶嵌型pbp2b基因］

pbp基因改变的广泛性用独立的基因突变累积难以解释，提示肺炎链球菌可能通过自然转化方式，从亲源关系近的青霉素耐药的口腔血链球菌、缓症链球菌和草绿色链球菌中直接摄取突变的pbp基因片段，通过基因重组，形成镶嵌pbp基因，即青霉素敏感株的部分pbp基因被来自耐药株同源序列所代替。草绿色链球菌pbp基因在转化到青霉素敏感肺炎链球菌之前，可能通过发生点突变而产生耐药性。

可以推断，镶嵌型耐药基因仅见于对转化具有自然能力的菌种，如肺炎链球菌和奈瑟球菌。链球菌具有高度的自溶性，溶解后释放的DNA进入周围环境。另外，在鼻咽部链球菌混合感染现象相当普遍，为肺炎链球菌pbp耐药基因多样性的产生提供了可能性。由于镶嵌基因可能含有不同供体的DNA，所编码的PBP不同于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a。

肺炎链球菌对青霉素呈高水平耐药，原因就在于形成镶嵌pbp基因，编码多种与青霉素亲和力下降的PBP，需要更高浓度的青霉素才能有效抑制PBP的功能。在青霉素广泛应用选择压力下，镶嵌pbp基因能通过转化方式水平转移到敏感菌株中（水平传播)，或耐药菌株的克隆传播（垂直传播)，加速PRSP菌株在全球流行。

（四)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

耐药基因  MRSA对β-内酰胺类抗生素耐药机制主要是产生PBP2a。研究发现，MRSA临床分离株染色体上均带有甲氧西林耐药基因mec。mec大小为30～50kb，是一段非金葡菌DNA，可能是通过转导或转座方式整合到金葡菌染色体上。mec基因的整合具有位置和方向的特异性，均插入在SmaI-G段上编码A蛋白的spa基因和嘌呤生物合成所必须的purA基因之间（图5-11)。

mec基因主要由调节基因和结构基因组成（图5-11)，其中结构基因mecA长2130bp，为高度保守DNA片段，负责编码PBP2a。完整的mecA为表达高水平甲氧西林耐药性所必需。当Tn551插入mecA时，甲氧西林耐药株则转变成敏感株。

图5-11  mec基因结构及染色体定位

mecA基因表达受调节基因mecR1-mecI、blaR1-blaI等共同控制。blaR1-blaI基因定位于β-内酰胺酶基因（bla)的上游区，调节bla基因和mecA基因的转录表达，这与MRSA对β-内酰胺类高度耐药及多重耐药有关。mecR1-mecI基因定位于mecA基因上游区，mecR1负责编码诱导因子MecR1，mecI则编码抑制因子MecI。MecI蛋白结合到mecA基因的启动子部位，使mecA基因不被转录。MecR1蛋白可被b-内酰胺类抗生素结合诱导而活化，从而解除MecI蛋白对mecA的阻遏作用，启动合成更多的PBP2a，产生耐药。mecI基因缺失、突变或失活后，mecA基因的转录及PBP2a的产量将成倍增加，对甲氧西林表现为高度耐药。

研究发现，mec基因序列的核心还包含至少一类整合子（IS431 /IS257)。IS431能捕获其他耐药决定因子，整合到mec片段中，如可作为转座子Tn554（编码大观霉素和红霉素耐药性)整合位点。因此，mec整合子在MRSA的进化和多重耐药的发展中具有重要作用。

mecA基因来源尚不清楚，可能是pbp基因和bla基因在一种未知微生物中进行基因重组的产物，也可能是从耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌通过水平传播获得的。

耐药辅助基因  除了mecA基因的调节系统外，金黄色葡萄球菌染色体上一些辅助基因fem也参与肽聚糖合成代谢（图5-11，图5-12)，共同负责甲氧西林耐药性的最适表达。到目前为止，已分离出10多种fem基因的新家族，其中femA是高度保守的看家基因，几乎存在所有的金葡菌中，为MRSA表达对β-内酰胺类抗生素高水平耐药性所必需的。femA、femB或femX基因灭活后，可使β-内酰胺类耐药株转变成敏感株，因此，FemA、FemB和FemX有可能成为抗菌药物的新的潜在的作用靶位。

图5-12  fem基因产物作用的部位

（FemA：负责将第2、3个甘氨酸连接到五肽交联桥之中；FemB：负责将第4、5个甘氨酸连接到五肽交联桥之中；FemC：负责异谷氨酰胺的氨酰化作用；FemF：负责L-赖氨酸与UDP-N-乙酰胞壁酰二肽链之间的连接；FemD：负责将D-丙氨酰-D-丙氨酸加入到N-乙酰胞壁酰三肽链中；FemX：可能涉及第1个甘氨酸的连接)

（五)耐万古霉素肠球菌（VRE)

VRE至少有VanA、VanB、VanC、VanD4种表型（表5-6)，其中VanA型VRE已在全球范围内蔓延。

表5-6  耐万古霉素肠球菌耐药情况

VanA型万古霉素耐药基因位于接合性R质粒携带的转座子Tn1546上。该转座子大小为10 851bp，包含9个基因，分为4个功能区（图5-13)：①转座基因：开放读码框ORF1和ORF2，分别编码转座酶和解离酶；②耐药调节基因：vanR和vanS；③耐药结构基因：vanH、vanA和vanX；④辅助蛋白基因：vanY和vanZ。

图5-13  转座子Tn1546上糖肽类抗生素耐药基因及其编码产物

IR_L和IR_R：反向重复序列

VanS为组胺酸蛋白激酶，可作为一个感受器，检测环境中万古霉素的存在，特别是万古霉素对细胞壁合成的早期影响，然后向反应调节器VanR传递信号。活化的VanR的DNA结合域（DNAbinding domain)与耐药基因VanH的启动子调节区结合，从而激活耐药结构基因的转录活性，大量表达与耐药性有关的蛋白质（VanH、VanA、VanX)。

VanH具有脱氢酶活性，可将丙酮酸还原成D-乳酸（D-Lac)，为VanA提供底物。VanA具有连接酶活性，催化由D-Lac与丙氨酸合成缩肽：D-Ala-D-Lac。细菌的加合酶能利用该缩肽与UDP-N-乙酰胞壁酰-三肽连接成相应的UDP-乙酰胞壁酰-五肽侧链，后者在转肽酶作用下与邻近五肽交联，形成肽聚糖（图5-2)。

VanX是二肽酶，不能水解D-Ala-D-Lac，但可水解D-Ala-D-Ala，减少用于合成正常前体五肽的D-Ala-D-Ala数量。如果一些D-Ala-D-Ala避开了VanX水解，结合到前体三肽上，VanY则作为羧肽酶水解前体五肽末端的残基D-Ala，形成一个前体四肽，使万古霉素不能与之结合。VanZ功能不清，并非万古霉素耐药性产生所必需，可能与替考拉宁耐药性有关。

万古霉素的作用靶位是N-乙酰胞壁酰五肽侧链末端的D-Ala-D-Ala（图5-2)，二者结合后可抑制转肽酶和羧肽酶的作用，阻断四（五)肽侧链的形成或侧链交联，从而阻止细胞壁的合成，导致细菌死亡（图5-2)。在万古霉素耐药菌株中，合成的D-Ala-D-Lac（或D-Ala-D-Hbut)代替D-Ala-D-Ala，用于肽聚糖合成。由于D-Ala-D-Lac酯键中的氧取代了D-Ala-D-Ala酯键中的NH基，破坏了万古霉素与靶位之间的氢键，对药物的亲和力下降至1/1000以下，从而导致万古霉素不能阻断侧链交联，细菌得以生存。

Tn1546以转座方式整合到可自行移动的质粒上，后者以接合方式在不同肠球菌临床分离株中频繁地转移，引起万古霉素耐药基因扩散。近期发现，由Tn1546和插入序列IS1251组成的转座子Tn5482能将VanA型耐药基因从肠球菌转移到不同种属的细菌，如金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌。

对于大多数万古霉素非依赖型VRE，仅仅只有在万古霉素存在时，才会诱导合成相关的脱氢酶（VanH)和连接酶（VanA)，以产生D-Ala-D-Lac取代D-Ala-D-Ala。万古霉素依赖型VRE（VDE)菌株生长时，需要万古霉素存在，最可能的解释是，VDE菌株关闭了正常的D-Ala-D-Ala的合成途径，即缺乏D-Ala-D-Ala连接酶，或被VanX作用所水解。只要万古霉素存在（如患者接受万古霉素治疗时)，D-Ala-D-Ala不为VRE细胞壁合成所必需，而是诱导形成一个替代的二肽样结构，参与肽聚糖合成，VRE得以生长繁殖。一旦万古霉素去掉，VDE菌株中D-Ala-D-Lac不再合成，没有D-Ala-D-Lac和D-Ala-D-Ala，细菌则不能继续生长繁殖。

第六节  抗生素应用选择压力与耐药性的产生

耐药菌株出现和扩散的因素繁多，但起关键作用的是：①耐药基因发生突变使耐药谱增大；②细菌间遗传物质交换，将耐药基因转移到新宿主；③医院及社区抗生素的广泛应用，为耐药菌产生和长期存在于体内，或更为广泛地扩散，以及引起疾病提供了重要的选择压力（selective pressure)。前两个为细菌本身生物学特性的因素，是耐药性产生的客观依据，后一个是人为因素，是抗生素耐药性迅速传播的主要推动力。此外，还与感染控制措施应用不当，各种先进的侵袭性诊治手段的广泛应用，以及免疫忍容性宿主(immuno-compromised host)增多等因素有关。

一、抗生素的诱导作用

近年研究表明，抗生素能诱导某些细菌耐药基因的表达。

AmpC β-内酰胺酶基因表达的诱导  AmpC β-内酰胺酶具有很强的可诱导性。通常情况下，AmpC酶不表达或低水平表达，但在β-内酰胺类抗生素存在时，该酶产量显著上升，如阴沟肠杆菌AmpC酶活性比诱导前提高100倍左右，甚至1000倍，达到完全去抑制型水平。通常在强诱导剂（特别是亚胺培南、头孢孟多、头孢西丁)诱导后，AmpC酶的活性可以灭活第一、二、三代头孢菌素和单环内酰胺类。

目前对革兰阴性菌染色体编码的诱导性AmpC酶的调控机制已基本阐明（图5-14)。研究发现，AmpC酶的表达受amp复合操纵子调控，amp操纵子由4个不连锁的基因ampC、ampR、ampD和ampG组成。ampC是结构基因，编码AmpC酶。ampR编码诱导性反式转录调控因子（AmpR)。ampD编码N-乙酰葡糖胺-L-丙氨酸酰胺酶（AmpD)，ampG编码膜结合转运蛋白（AmpG)，参与肽聚糖的合成。

图5-14  AmpC的表达调控

位于细胞膜上的AmpG将正常代谢中细胞壁降解物（UDP-N-乙酰葡糖胺-N-乙酰胞壁酰三肽)从周浆间隙转运到细胞内，胞内AmpD能水解细胞壁降解物（包括UDP-N-乙酰葡糖胺-N-乙酰胞壁酰三肽，UDP-N-乙酰胞壁酰三肽)，释放糖和小肽（L-Ala-D-Glu-DAP)，重新参与细胞壁合成的再循环。

当β-内酰胺类抗生素不存在时，AmpR为负调控因子（抑制子)，主要与一个抑制性配体-细胞壁前体UDP-N-乙酰胞壁酰五肽结合，以失活状态结合在ampR-ampC之间区域，使ampC基因的转录处于受抑制状态。但当β-内酰胺类抗生素存在时，细胞壁合成受阻，细胞壁降解产物UDP-N-乙酰胞壁酰三肽水平升高，UDP-N-乙酰胞壁酰五肽水平降低，N-乙酰胞壁酰三肽与抑制性配体竞争AmpR上的结合位点，从而解除抑制性配体的抑制作用。此时，AmpR为正调控因子（激活子)。AmpR激活ampC基因的转录，过量表达AmpC酶。

AmpD维持UDP-N-乙酰胞壁酰五肽与UDP-N-乙酰胞壁酰三肽在数量上的平衡，控制着ampC转录信号的强弱。AmpD基因突变产生有功能缺陷的AmpD时，AmpR即以激活子状态发挥作用，引起大量的β-内酰胺酶表达，成为稳定去抑制表型。在使用某些第三代头孢菌素期间，可诱导选择出稳定的去抑制的突变株，使AmpC酶高水平表达。

金黄色葡萄球菌mecA基因表达的诱导  临床实验室常规检测发现，一些携带mecA基因的金黄色葡萄球菌仍然显示对甲氧西林敏感，被称为“准MRSA”，这是由于其mecA基因被强烈抑制所致。当它们接触β-内酰胺类抗生素诱导剂后，即迅速激活MecR1，产生PBP2a，对甲氧西林转呈耐药。

此外，长期使用抗生素可诱导细菌耐药水平提高，增加耐药基因如R质粒在细菌之间转移的频率。

二、抗生素的筛选作用

通过自发突变或“耐药基因”转移而成为耐药性的菌株，具备了适应外界环境改变的能力，但是，耐药菌株在菌群中仅占极少部分，并且需消耗能量保持耐药基因（如R质粒)或泵出抗菌药物，外膜通透性降低虽能阻止抗生素进入，但同时亦影响营养物质的吸收，因此，在自然环境下，耐药菌难以与占有压倒优势的敏感菌竞争，其生长规模必然受到正常菌群的拮抗。然而，抗生素的广泛应用提供了对耐药突变株的选择环境。

研究发现，许多很少服用抗生素的病人刚住院时，其肠道及其他部位分离的菌株大部分是敏感菌株。当给病人长期使用抗生素，尤其是广谱抗生素时，敏感菌株（包括拮抗耐药菌的部分正常菌群)将迅速被抑制或“淘汰”，使得病人对医院流行的耐药菌株变得更加易感，耐药性细菌（主要来自医护人员或住院已久的病人，或自身耐药突变株)乘机侵入并大量繁殖，成为新的优势菌，最终取代敏感菌株的地位。可见，抗生素在耐药菌产生过程中起到筛选作用。例如，在日本，1993～1994年淋球菌对青霉素耐药率为20.5%，对环丙沙星耐药率为6.6%。由于第三代头孢菌素和环丙沙星取代青霉素，成为治疗淋病一线药，到1997～1998年，青霉素耐药率下降为12.7%，而环丙沙星则上升到24.4%。

现今大多数质粒与前青霉素时代菌株中的质粒唯一不同之处是，携带了耐药基因，提示耐药菌大多产生于抗生素发现之后。在抗生素使用不受限制的国家，细菌（特别是肠杆菌科)携带R质粒的频率通常较高。

G^－杆菌R质粒的产生和扩散伴随着β-内酰胺类抗生素的发展和应用。20世纪50年代，青霉素耐药肠杆菌科菌迅速增长，大多携带编码青霉素酶的质粒。耐酶青霉素和头孢菌素问世后，随之出现产β-内酰胺酶的菌株，尤其是超广谱头孢菌素的泛用和滥用，导致β-内酰胺酶基因发生点突变，编码ESBL的质粒迅速出现和传播。目前，ESBL的种类和数量正以惊人的速度在发展。

近年来，在临床广泛应用β-内酰胺类抗生素/克拉维酸和头霉素的选择压力下，AmpCβ-内酰胺酶由原来局限于染色体编码逐渐向质粒编码转移，每年发现1～2个新质粒，这大大提高了AmpCβ-内酰胺酶的水平传播能力。可以预见，在不远的将来，各种编码AmpCβ-内酰胺酶的质粒将在全球范围内流行。

抗生素的筛选作用从总体上导致耐药基因库扩充，病原菌获得耐药性机会增加，一些耐药菌本身也可成为条件致病菌。例如，万古霉素投入临床使用30多年后，一直没有出现明显耐药现象。随着MRSA、耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌和艰难梭菌感染暴发流行，万古霉素用量急剧上升，20世纪80年代出现VRE，并迅速波及全球，粪肠球菌已成为万古霉素耐药性贮存宿主，进而可能传播到金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌。又如，肠道正常菌群粪肠球菌对头孢菌素呈现固有耐药，头孢菌素的广泛应用促进粪肠球菌大量繁殖，已成为医院感染重要病原菌。

三、抗生素在临床和临床之外的应用

（一)在临床方面的应用

细菌耐药性的产生与变迁与临床上抗生素广泛或过度应用有绝对关系。医院环境中抗生素选择压力的长期存在，一方面筛选出毒力弱，但对许多抗生素呈固有耐药的条件致病菌；另一方面筛选出毒力强，原来对抗生素敏感转呈耐药的致病菌。

医院是抗生素使用集中的地方，院内的细菌耐药率明显高于社区，同一种细菌，院内分离株耐药性较强和较广谱。对某一特定药物耐药率的波动与医院抗生素使用规定的变化有关。大医院在高价位抗生素上用药比例和数量较多，院内多重耐药菌比例和量也较大。

在ICU，耐药菌检出率远高于其他病房，常见的MRSA、凝固酶阴性葡萄球菌、VRE、革兰阴性杆菌等均呈多重耐药性。产ESBL菌在ICU、血液病科、肿瘤病房、烧伤病房、新生儿房分离率较高，这与抗菌药物使用频率密切相关。一些原本无害的不动杆菌和黄单胞菌属数年前几乎未听说过，因抗生素的滥用出现多重耐药性，已成为住院患者致命的血源性感染的重要病原菌。以上反映了ICU抗生素选择压力的水平，已形成抗生素大量使用与耐药菌株顽强递增的恶性循环。

那么，人类是如何陷入细菌耐药性的困境呢？调查发现，在绝大多数病历，在病原菌及其药敏结果出来前已开始凭经验选择用药，待药敏报告再作调整，而有的可能始终无药敏结果，从某种意义上讲，这是细菌产生耐药性的主要原因。一些医生不顾抗菌药物使用限制的有关规定，继续开出过量或不适当的抗菌药物，例如：

（1)用于无细菌感染并发征的病毒感染。全球抗生素处方中用于呼吸系统感染治疗占3/4。实际上，90%以上的感冒和呼吸道感染是由各类病毒而非细菌引起，抗生素对病毒性感染不起作用，反而会因过度使用引起菌群失调，加速细菌抗药性的产生和扩散，使原本容易治愈的病症变得难以治疗。

（2)选用对病原菌无效或疗效不强的药物。病原体产生耐药后继续用以往药物，产生耐药菌二重感染时未改用其他药物。有的人为了追求经济效益，总喜欢使用昂贵的新型广谱抗生素，或多种抗生素联用。对高危重病患者，越来越依赖最新的更广谱的抗菌药物。

（3)剂量不足或过大，过早停药或感染已控制多日而不及时停药，尤其是外科手术无感染指征的预防性使用抗生素，术前应用过早，术后停药过晚。目前一般采用术前2～3d、术后5～7d的给药方法，但现在认为这种方法不很恰当，需用抗生素加以覆盖的感染危险期一般不超过24～48h。

在美国超过1/2的住院病人和1/3门诊病人属于不该使用抗生素或使用不当。在很多发展中国家，许多抗生素不需处方随便可以买到，无指征滥用现象严重……。据报道，我国抗生素的合理使用率只有40%，例如，某部队大医院对7800份住院病例调查发现，临床无感染及预防指征使用第三代头孢菌素占23.5%，治疗首选第三代头孢菌素占64%，依据病原学检查结果治疗的病例只占12.5%，参考药敏结果选药者仅占7.8%，显然存在不合理用药现象。

（二)在兽医与畜牧业方面的应用

耐药菌株产生和扩散速度不仅仅是临床上广泛使用抗菌药物的结果，还与兽医学、畜牧业、农业和水产养殖泛用抗生素有密切关系。例如，美国生产的40%以上抗生素用于畜牧业，其中80%混入饲料作为生长促进剂（growth promoter)，因为进食含亚治疗剂量抗生素饲料的动物能增重4%～5%。1992～1996年澳大利亚每年进口近600公斤万古霉素用于临床，而用于畜牧业的另一糖肽类抗生素阿伏帕星（avoparcin)超过6000公斤。畜牧业长期大量非治疗性应用抗生素必然导致耐药性细菌的出现，主要是动物源性病原菌，如引起腹泻的沙门菌和空肠弯曲菌，以及人畜共患病原菌，如大肠埃希菌和肠球菌。

由于人和动物微生态系关系密切，抗生素耐药性容易突破物种界线，即通过进食和直接与感染动物（或动物粪便)接触，动物体内耐药菌进入人体消化道，然后将耐药基因转移到人体致病菌中，导致耐药基因扩散，抗生素耐药性细菌库不断增大。例如，阿伏帕星是非人用抗生素，但由于交叉耐药，动物饲料中添加阿伏帕星明显促进耐万古霉素肠球菌的出现。万古霉素耐药基因vanA整合在接合性质粒上，可在动物肠球菌菌株之间扩散，并传递给人体肠球菌。可见，畜牧业应用抗生素是某些病原菌耐药性发展的重要推动力。

四、耐药菌的扩散

虽然抗菌药物使用和滥用是耐药性迅速产生的一个重要因素，但医务人员感染控制基本技术的应用不当是造成耐药菌株在医院内扩散的主要原因。调查发现，医护人员的手是耐药菌的主要传播途径。例如，医务人员与病人大量接触前后忽视洗手；未按规定戴手套；脱去手套后没有充分洗手。在拥挤不堪、严重缺员，以及抵抗力极差的重症患者集中的单位，耐药菌经医务人员污染的手为媒介的人─人传播的危险性最大。这些患者呼吸道和消化道正常（敏感)菌群能迅速被医院流行的耐药菌株所取代，通常数天之内，每毫升呼吸道分泌物或每毫克粪便中耐药菌的数量达到数万亿个。如操作不严格，机械通风或患者大小便失禁将大大增加医务人员污染手的可能性。

最新研究表明，如果不用含抗菌药物的肥皂洗手，耐药的G^＋球菌和G^－杆菌仍然存活，如万古霉素耐药肠球菌（VRE)在手上能存活约30min。

分子流行病学研究表明，耐药菌可以在同一病房或医院内、医院之间、一个地区引起暴发流行，有时甚至跨越国界扩散，其中最突出的是，青霉素耐药肺炎链球菌MMSp23F血清型首先在西班牙报道，之后传播到美国、南非、欧洲和香港等地。美国曾发生多次VRE暴发，在同一医院不同患者体内常常鉴定出相同的VRE菌株。在美国洛杉矶从5所不同医院分离的VanB型VRE，91%菌株为同一克隆，不仅在患者和医务人员体内检出，而且存在于许多医疗器械和病人所用物品上，提示存在医源性交叉感染。

全球化贸易大幅度增加了人员流动，进而加速病原微生物包括耐药菌株的传播和蔓延。

第七节  细菌耐药性的控制策略

如果说抗菌药物的出现是人类第一次征服细菌，细菌耐药性则是对人类智慧的又一次严峻挑战。

一、强细菌耐药性监控

这是了解细菌耐药性趋势、正确制定治疗指南和恰当评定措施有效性的关键因素。应加强国际间交流与合作，构建细菌耐药性全球监测网络，协调现有的耐药性监控网点，大力培训监测人员，以保证结果的标准化、有效性、可靠性，为耐药细菌流行的监控提供高质量的数据，共同制定对策，遏制耐药细菌的发生和扩散。

临床微生物学实验室应利用计算机软件，对临床各种标本的病原菌分离率和耐药谱，以及抗菌药物应用结果进行统计分析，定期报告给医院感染科，再反馈给临床各科室，以便让临床医生及时掌握所在医院病原菌及其耐药性变化的最新动态，有计划地交替使用高敏感性的抗生素。

目前对耐药菌的监测重点是MRSA、VRE、PRSP和产ESBL革兰阴性杆菌。应对各科室治疗室、换药室和ICU的空气和物品，以及医护人员的手，尤其是癌症患者，ICU监护患者，器官移植患者和烧伤患者等易感人群进行耐药菌监测。

二、少选择压力，逆转耐药性

早在1960年就有学者指出，应通过减少抗生素应用选择压力，让那些产生耐药突变的微生物群体失去与野生型敏感菌的竞争优势而逐渐减少或消失，从而阻止耐药性的发生与蔓延。近年来，根据耐药性变迁特点，通过限制某些抗生素的应用或改变抗生素的应用种类，有计划地定期或划区停用某种抗生素，或循环使用抗生素，对恢复细菌对抗生素的敏感性和遏制细菌耐药性已显示出良好的前景。

在芬兰，1990年从咽部和脓汁中分离的红霉素耐药A族链球菌为13.2%，1993年上升为19%。随着红霉素和其他大环内酯类抗生素的用量减少，到1998年该菌红霉素耐药检出率下降了50%。又如，1996年，为对付VRE和艰难梭菌假膜性肠炎暴发流行，美国某医院减少了第三代头孢菌素用量，改用氨苄西林/舒巴坦或哌拉西林/他唑巴坦，结果一年后患者粪便中VRE定植率从47%下降到15%，艰难梭菌感染率亦下降了50%。

可见，只要坚持正确引导合理使用抗生素，停止药店无处方出售抗生素，限制抗生素的使用，鼓励农场主在食用动物中使用非人用和不会选择交叉耐药的抗生素，或用微生态制剂替代抗菌药物，高耐药率是完全可以逆转的。

三、速准确检测耐药性

在处理细菌感染时，速度极为重要。在病原菌及其药敏鉴定结果出来之前（通常为48h)，病人已经开始接受经验性治疗，抗菌药物的选择是基于感染的临床特征。当疑为严重感染或医院感染时，常采用广谱抗生素治疗，尤其是对ICU住院病人或急诊室病人使用更为频繁，这就难免不出现不合理用药现象。因此，快速检测病原菌及其耐药性，将会大大减少误用的抗生素处方率，帮助医生选用针对性更强的抗生素，缩短疗程，减轻细菌耐药性产生和扩散的选择压力，延缓耐药菌株的出现。

常规药敏试验（如平板扩散法、E试验法)是以“菌”为中心，首先从临床标本中分离出病原菌，再作药敏试验，至少需要2d才能得到结果，对于生长缓慢和营养要求苛刻的细菌所需时间更长，对于耐药株与敏感株混合感染难以保证结果的可靠性。因此，建立快速、准确地检测耐药性的分子药敏试验法十分重要。

分子药敏试验是以耐药性检测代替敏感性检测。通常先通过PCR扩增耐药（突变)基因，扩增产物再通过以下方法检测：琼脂糖凝胶电泳、探针杂交、微板杂交-ELISA法、限制性片段长度多态性分析（RFLP)、单链构象多态性分析（SSCP)、直接测序。例如，葡萄球菌对甲氧西林的耐药机制是由于产生新的青霉素结合蛋白，其编码基因mecA的存在和甲氧西林耐药性之间有很好的相关性，因此PCR检测mecA基因可能成为甲氧西林耐药性的“金标准”。又如，幽门螺杆菌耐克拉霉素的分子机制是，23SrRNA基因2143和2144位点发生了A→G点突变，2143位点还存在A→C点突变，可采用PCR-微板杂交（图10-6)或PCR-RFLP法直接检测胃粘膜或胃液中幽门螺杆菌及其对克拉霉素的耐药性。

近年发展的基因芯片技术在检测耐药基因上具有很大潜力，特别适合于检测多个基因和/或多重突变引起的某种微生物的耐药，如结核分枝杆菌对异烟肼的耐药和艾滋病病毒对逆转录酶抑制剂的耐药。美国已研制出同时检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、乙氨丁醇3种药物的耐药性，检出率分别达到75%、50%和70%，并能区分人型结核分枝杆菌和牛型结核分枝杆菌。

与常规药敏方法相比，分子药敏试验法具有特异性强、敏感度高、快速等优点，能直接检测临床标本中病原菌的耐药性，尤其适于难以培养或培养时间长的病原菌，可减少细菌培养过程中耐药性的扩散，应在大多数临床微生物学实验室推广。但是，目前尚需不断完善与发展，特别是在确定细菌耐药基因与耐药性的关系上。

四、学合理用药，防止耐药菌株的产生

耐药菌株非正常增加，往往伴随着抗菌药物的非正常使用。由于人类开发新型抗生素的速度已落后于细菌耐药性的发展速度，因而细菌耐药性不可能根除，只能对抗或延缓耐药性的发生，为此，应有组织、有计划、有目的合理控制使用抗菌药物，以延长抗菌药物使用寿命。然而，这一最重要的防治措施尚未受到应有的重视。应加强对医生进行合理使用抗生素教育，规范医生处方，赋予药师监督处方的权利，让病人和公众了解细菌的耐药现状及其危害。合理用药包括以下几个方面：

严格掌握抗菌药物应用的适应证  病毒性感染和发热原因不明者，除并发细菌感染外，不宜轻易采用抗菌药物。因为一旦用药之后，使临床表现不典型，难以确诊，延误正确治疗。但对病情危重者，抗生素的使用可适当放宽。尽量避免使用抗生素作预防性治疗和皮肤、粘膜等局部用药，以防诱导耐药菌产生。例如，万古霉素的应用仅限于下列适应征：由耐β-内酰胺类抗生素的革兰阳性菌所致的严重感染；对β-内酰胺类抗生素严重过敏患者；因抗生素应用引起艰难梭菌假膜性肠炎，使用甲硝唑治疗失败患者；外科手术后感染和MRSA感染高危患者，可预防性采用亚剂量万古霉素。

正确选择抗菌药物和配伍  在使用抗生素前，原则上除危重患者外应先从患者体内分离致病菌，并做细菌药物敏感试验，以便选择敏感的抗生素治疗，尽可能使用窄谱、价廉抗生素，保留广谱、新型和价昂抗生素作备用。按病情阶梯性选药，不任意跨代用药。病情危重者或培养失败者或受各种条件限制不能培养者，可根据临床经验和感染部位选用抗生素，但可靠性差。

联合用药可降低耐药性突变频率，从不同环节控制产生耐药性，但必须有明确的指征，如：①病原菌未明或单一药物不能控制的严重感染；②多种细菌引起的混合感染；③较长期用药有可能产生耐药者，如结核病往往同时使用利福平、异烟肼和吡嗪酰胺。但一种药物可以控制的感染，不可任意采用多种药物联合。可用窄谱者就不用广谱。

正确掌握剂量、疗程和给药方法  用药量应保证血液或感染组织达到有效抑菌或杀菌浓度，及时杀灭病原菌。避免剂量过大或疗程过长而造成药物浪费和加剧副作用；又要注意由于剂量不足而致病情迁延，转为慢性、复发，诱导细菌耐药性的产生。疗程应尽量缩短，及时停药。

五、格执行消毒隔离制度，防止耐药菌的交叉感染

医院应建立一支感染控制队伍，加强医院感染控制措施，预防耐药菌的暴发流行。医务人员检查病人时必须正确及时洗手，对与病人接触较多的医生、护士和护工，应定期检查带菌情况；发现带菌时应暂时调离病房，以免传播耐药菌感染。

对耐药菌感染的患者，尤其是VISA、VRE和MRSA定植或感染者，应予隔离，主要措施包括：①VRE感染患者住单独病房或与其他VRE感染者合住，教育患者防止交叉感染；②进入VRE感染患者病房戴上手套，离开时用含抗菌药物的肥皂洗手；③当需要与患者身体或病房物品接触时，应穿上隔离衣。

需要隔离保护的易感人群包括：①有严重的基础疾病，如骨髓移植、糖尿病等；②曾接受多种抗生素（特别是第三代头孢菌素或万古霉素)治疗；③ICU、肿瘤科和外科长期住院；④接受侵袭性诊治；⑤与VISA、VRE和MRSA患者接触者。

应大力改善社区卫生条件，通过减少细菌感染来阻止耐药性从动物传播到人类。

六、找新型抗菌药物和新的抗感染方法

一种新的抗生素从发现到临床应用，通常需要6～7年。因此，尚难预料人类发明新的抗生素的速度能否跟上细菌产生耐药性的速度。

改良现有抗生素  保留其原有细菌靶位的作用，但避免现有耐药机制。例如，

1．发展耐酶抗生素或灭活酶抑制剂 针对细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制，可考虑开发具有对酶的失活作用稳定的化学结构的药物，如碳青霉烯类（亚胺培南)、青霉烯类（呋罗培南fropenem)等，亦可筛选β-内酰胺酶的抑制剂，如克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦和硼酸类化合物，与抗菌药物联合应用，如阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦，可阻止对酶不太稳定的抗生素被降解。大多数产ESBL细菌对β-内酰胺酶抑制剂敏感，但上述β-内酰胺酶抑制剂对染色体介导的C组β-内酰胺酶和金属β-内酰胺酶的抑制作用很弱或无。近年已筛选出一些新的β-内酰胺酶抑制剂（如CL-186195、J-110441)，对金属β-内酰胺酶和C组β-内酰胺酶显示强力抑制作用。迄今为止，尚未开发出除β-内酰胺酶抑制剂外的酶抑制剂。

对氨基糖苷类抗生素进行结构改造，使之不被修饰酶灭活。例如，阿米卡星是在卡那霉素分子中引入保护基团而成，可避免修饰酶钝化，地贝卡星则是通过剔除卡那霉素中易被修饰酶修饰的基团而成。

2．抑制外排系统 细菌对四环素耐药主要是通过外排系统不断将进入菌体内药物排出体外。可设计与排出泵亲和力更强的四环素结构类似物，阻止排出泵有效地排出四环素；或对四环素加以改造，抑制泵出蛋白的活性，或降低与外排泵亲和力。如经化学改造的新一类四环素甘氨环素（glycylcycline)具有广谱的抗菌活性。

3．增加与靶位亲和力 万古霉素的分子结构加上一个疏水性环状支链后，对万古霉素敏感的革兰阳性菌和VRE显示很好的活性，如LY333328的药效高出万古霉素1000多倍。针对MRSA，可研制与PBP2a有强亲和力的β-内酰胺类抗生素（如新型碳青霉烯类L-695256和SM-17466)或fem基因抑制剂。三环类β-内酰胺类抗生素sanfetrinem对PRSP的PBP1a和PBP2b有很强的亲和力，对许多常见的β-内酰胺酶稳定。

寻找细菌内抗菌作用的新靶子  修补现有抗生素只是权宜之计，并不能赢得太多时间来对付聪明的细菌，因为这类药物从基本结构上没有避开现有的耐药机制，细菌稍加突变，能很快形成新的耐药机制，因而针对耐药菌设计全新作用机制的抗菌药物迫在眉睫。

要以病原菌为目标，利用细菌基因组学、生物信息学和体内基因表达技术，确定感染过程中被特异诱导的重要疾病基因及其功能，阐明细菌的耐药机制及其与宿主之间的相互作用，发现哪些对病原菌生存必不可少，感染过程又常常优先表达的因子，如病原菌在活体内感染时才表达的基因和基因产物（如毒力)，而不是体外培养皿环境中生长时所表达的产物。有效的靶位可能是基因或基因产物（如涉及细胞分裂、蛋白质合成、代谢物转运、毒力，以及宿主细胞凋亡等)。选择这些因子作为药物筛选的新靶标，采用超高通量药物筛选系统，发展新的治疗药物（或治疗性疫苗)，可以减少耐药基因选择和扩散的机会。不过，对这些高度特异靶位的药物比传统的抗生素具有更窄的作用谱，要求有相应的快速诊断系统与之相匹配。

开发抗菌中药复方和天然抗微生物肽  研究表明，中药复方成份复杂，作用机制和环节多，既有直接的抗菌作用，又有调节机体免疫功能的作用，不易产生耐药性，应加强对中药复方抗菌的研究与开发。来源于动物的抗微生物肽正在开发之中，包括protegrin、爪蟾抗菌肽（magainin)、防御素（defensin)、鲨胺（qualamine)等。此外，将抗药性好的抗生素与最有效的细胞因子合二为一，具有抗菌和调节抗感染免疫的双重作用。

引入“以菌制菌”的微生态调整疗法  抗生素耐药性的发展，忍容性宿主中机会性感染的增加，新的致病菌的出现，导致临床上大量使用抗生素，进而加剧耐药菌株的出现和扩散，需要不断换用新的抗生素。因此，需要寻找新的策略来防治感染性疾病。源于自然、回归自然的微生态制剂（probiotic)能通过生物拮抗、营养争夺、占位性保护等多种机制拮抗某些致病菌，从而调整微生态平衡，提高宿主防御功能。病原菌通过基因突变产生耐药性的危险性减少。微生态制剂将为感染性疾病的治疗提供新途径。

在某些局部感染时可用噬菌体作为一种辅助治疗，如应用铜绿假单胞菌噬菌体治疗创口感染。可通过基因工程技术改造噬菌体，使其进入人体后能攻击多种类的病原菌，突破噬菌体对其宿主裂解的专一性。

发展疫苗  这是解决难以治疗的耐药性细菌的最好办法。疫苗接种可降低细菌感染发生率，从而减少抗生素用量，延缓耐药性的出现，应大力发展较难治疗的常见耐药菌的有效疫苗。

展望21世纪，人类将有可能有效地控制耐药性细菌的感染。

（龙北国  第一军医大学)