综合性实验一 脓汁和粪便标本中病原菌的检测
从临床标本中分离细菌的目的是为了查找与疾病有关的病原菌，这对于临床治疗及预后调查是很有价值的。所以，在分离时应掌握以下原则，以便指导检出病原菌，避免漏诊误诊。
1．了解微生物在人体的分布。人体的很多部位与外界相通，存在正常菌群，分离时应注意
标本中的菌群是正常菌群的污染，还是致病菌。另外，机体的某些部位(如血液、骨髓)是
无菌的，如检出细菌，应视为致病菌。
2．了解标本来源及临床情况，以便有目的地检出病原菌。
3．根据标本来源和可能存在的病原菌确定选用各种分离培养基，以提高检出率。如血平板
常见的化脓性病原菌有葡萄球菌、链球菌、淋球菌、脑膜炎球菌、肺炎链球菌、结核杆菌、
假单胞菌、流感杆菌等。脓汁标本在做细菌分离培养的同时，均须直接涂片检查，观察是否有
典型形态的菌体，芽胞有无，为临床提供最初的诊治依据。
粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目的菌的不同而选择培养基(如SS、伊红美蓝平板，碱性蛋白胨水)，尽可能地抑制杂菌，以利于病原菌的检出。粪便标本中常见的病原菌有
志贺氏菌属、致病性大肠杆菌、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌等。粪便标
本中因各种正常菌群含量甚多，仅以染色性和形态无法分辩是否为病原菌，因此，粪便标本
一般不作直接涂片检查，只有检查霍乱弧菌、结核杆菌、疑似葡萄球菌或艰难梭菌引起的伪
膜性肠炎，以及菌群失调时，才作直接涂片检查。
细菌鉴定工作的原则及基本方法是：
1、必须用纯的细菌培养物作鉴定。因为不同的细菌生化反应结果相差较大，而反应结果是
以阳性或阴性表示的，一旦用混合菌做生化反应，结果不可分析。
2、鉴定方法的选择。测定细菌特征的实验方法很多，应根据鉴定目的选择有价值的、快速
简便的试验项目，既能完成鉴定，试验项目又尽可能少。
一、 培 养 基 的 制 备
Preparation of Culture Media
【实验目的】
1了解细菌生长的基本营养条件。
2熟悉培养基的种类。
3掌握培养基制备的原则和一般方法。
【实验原理】
培养基是用人工方法将微生物生长繁殖所需要的多种营养物质，按比例混合配制而成的营养
制品，其主要用途是分离培养纯种微生物，传代或保存微生物，鉴别微生物的种属，研究微
生物的生理及生化特性，制造疫苗、微生态制剂或其他微生物制剂。
培养基基本成分包括：(1)营养物质，如碳源、氮源、无机盐和生长因子等；(2)水份；(3)
凝固物质，最常用的凝固剂为琼脂；(4)抑制剂，如胆盐、抗生素等，其目的是抑制非检出
菌的生长或使其少生长，有利于检出菌的生长。
培养基的种类很多，根据物理性状，培养基可分为固体、半固体和液体培养基三种，固体培
养基又有平板和斜面之分。根据用途，培养基可分为：
(1)基础培养基含有一般细菌生长繁殖需要的最基本的营养物质
，可作为一些特殊培养基的基础成分。
(2)营养培养基在基础培养基中加入某些特殊营养物质如血液、
血清或生长因子等，用以培养营养要求较高的微生物。
(3)选择性培养基利用微生物对某些化学物质的敏感
性不同，在培养基中加入这类物质，
抑制不需要的微生物生长，有利于所需分离的微生物生长，从而达到分离或鉴别某种微生物
的目的。
(4)鉴别培养基是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基。某
种微生物在这种培养基上
培养后，产生某种特定代谢产物，与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应
。
培养基的制备原则：(1)适当的营养成分；(2)合适的酸碱度；(3)配制后经灭菌手续使之无
菌，方可使用。将灭菌后的培养基在37℃培养24小时，必须无细菌生长。
培养基制备程序可分为调配、溶化、矫正pH、分装、灭菌、检定及保存等步骤。制备好的培
养基，应注明名称、制作日期，存放在4℃冰箱中。
【实验内容和方法】
一肉汤培养基(meat infusion broth)的制备
供作一般细菌培养的基础培养基，其成分为：
牛肉浸膏3g
蛋白胨10g
NaCl5g
蒸馏水1000ml
pH7.4～7.6
【材料】
天平称量纸药勺pH试纸(pH5.4～9)三角烧瓶量筒试管试管架5ml吸管吸
头棉塞标签纸牛皮纸线绳
【方法】
1称取一定量的肉汤培养基，置于三角烧瓶中，加入适量的蒸馏水。
2溶解后校正pH至7.4～7.6，分装到三角烧瓶或试管中(装量以试管高度的1/4左右为宜)。
多数生化试验用的鉴别培养基，可分装于毛细玻璃管内，加热熔封，灭菌后备用。
3三角烧瓶和试管口塞上用普通棉花制作的棉塞(棉塞的形状、大小和松紧要合适，才能起
到防止杂菌侵入培养基内而造成污染和有利通气的作用)，在棉塞外包一层牛皮纸，以防灭
菌时冷凝水沾湿棉塞。
4贴上标签，灭菌后使用。
二普通营养琼脂培养基(nutrient agar)的制备
琼脂是从海藻中提取的一种胶体多糖类物质，一般不被细菌分解利用，故对细菌无营养作用
，其特点是能在100℃溶化、40℃以下凝固，因此，它是作为固体培养基赋形的理想凝固剂
。将不同量的琼脂加入肉汤中趁热可制成斜面、平板等不同类型的固体培养基(含琼脂2～2.
5%)或半固体培养基(含琼脂0.3～0.5%)，供分离、培养、传代和保存细菌等使用。
【材料】
普通营养琼脂培养基蒸馏水三角烧瓶平皿试管5ml吸管酒精灯
【方法】
1在上述配制的肉汤培养基中加入2－2.5%的琼脂，或者称取一定量的营养琼脂培养基，置
于三角烧瓶中，加入适量的蒸馏水。
2灭菌后冷却至50～60℃(以防止冷凝水太多)时，以无菌操作倾入已灭菌的平皿中制成平
板。若平皿内径为9cm，可倾注12～15ml；若内径为7cm的平皿，倾注10～12ml。轻轻摇动平
皿底部，待凝固后即成。
3如果要制作斜面，灭菌前将培养基溶化、分装到试管中(装量不超过试管高度的1/5)，灭
菌后趁热斜放，冷却后即成斜面(斜面的长度不超过试管总长的1/2)。
4如果要制作半固体培养基，分装量可为试管长度的1/4～1/3，灭菌后趁热直立待凝。
三血平板(blood agar)的制备
适于各类细菌生长，链球菌、肺炎球菌等营养要求较高的细菌必须要用血平板。一般细菌检
验标本的分离多应接种血平板。在血平板上除了可以观察菌落的形态外，还可判断溶血情况
。
【方法】
1将已灭菌的普通营养琼脂培养基加热溶化。
2冷却至50℃左右时，加入10%无菌脱纤维羊血(临用前，应置于37℃水浴预温)，轻轻摇匀
。
3以无菌操作倾入灭菌的空培养皿中。
四、伊红美蓝(EMB)培养基的制备
分离肠道致病菌用，其成分为：
牛肉浸膏5g
蛋白胨10g
氯化钠5g
琼脂15g
乳糖10g
蒸馏水1000ml
无菌2%伊红Y水溶液 20ml
无菌0.5%美蓝水溶液20ml
pH7.2～7.4
注：
伊红、美蓝为指示剂，且有抑制革兰氏阳性菌生长的作用。大肠杆菌分解乳糖产酸，使伊红
与美蓝呈色，形成紫黑色菌落，且有金属光泽；肠道致病菌不发酵乳糖，菌落呈粉红色，有
时可因碱性物质较多，细菌带负电荷染上美蓝而呈蓝色菌落。
【方法】
1加热溶化已灭菌的蛋白胨、肉汤琼脂，溶化后立即趁热加入已灭菌的乳糖。
2待冷却至50～60℃时，加入已灭菌的伊红及美蓝水溶液，充分摇匀。
3以无菌操作倾注平皿。凝固后，冷藏备用。
【注意事项】
●搅拌或振荡器皿或延长放置时间，以促进干燥培养基的溶解。
●干燥培养基一般已校正pH。用时须再验证。通常培养基灭菌后pH约可降低0.1～0.2，在矫
正时应比实际需要的pH提高0.1～0
.2。
●倾注培养基时，切勿将皿盖全部启开，以免空气中尘埃及细菌落入。
●琼脂平板放4℃冰箱保存，正面向下(倒置)，以防细菌落入而污染。
●新制成的平板培养基表面水分较多，不利于细菌的分离，可将平板倒置于37℃培养箱内约
30分钟，待平板表面干燥后使用。
【思考题】
①人工培养细菌需要提供的条件是什么?
②培养基制备的原则是什么?
③如何证明培养基灭菌是否彻底?
④怎样检查培养基是否合格?
⑤培养基按物理形状分哪几种?各有何用途?
二、 消毒与灭菌
Disinfection And Sterilization
【实验目的】
1了解理化因素对细菌的影响。
2掌握常用的消毒灭菌法。
【实验原理】
微生物广泛存在于周围环境，其中有些又是病原微生物，因此，从预防感染出发，医务工作
者必须建立无菌观念和严格执行无菌操作，这就要求必须对所用的物品(如注射器、手术器
械、手术衣等)和工作环境(如无菌操作室、手术室、产房等)进行灭菌或消毒，以确保所用
的物品和工作环境的无菌或处于无菌状态；为防止疾病的传播，对传染病患者的排泄物和实
验废弃的培养物亦须进行灭菌或消毒处理。微生物学实验一般都需要在无菌条件下进行，为
此必须对培养基、实验器材和试剂等进行灭菌，并严格执行无菌操作。可见，消毒与灭菌是
微生物学和临床医学必不可少的基本知识。
物理灭菌方法有干热灭菌、湿热灭菌、过滤灭菌等，可根据具体情况选用不同的灭
菌法。干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和
镊子等，无菌操作时的试管口、瓶口也可在火焰上作短暂烧灼灭菌。
煮沸100℃经5～10分钟，可杀死细菌的繁殖体，但不能杀死细菌的芽胞。因此，煮沸法
主要用于一般外科手术器械、胶管和注射器等的消毒，亦可用于饮水和食具的消毒。
高压蒸汽灭菌法是实验室中最常用最有效的方法。水在大气压中100℃左右沸腾，大气压增
加沸腾温度将随之增加。因此，在密闭的高压灭菌器内，当蒸汽压增加到1.05kg/cm2(15
磅)
时，温度则达到121.3℃，在这种温度下，15～30分钟即可杀死所有微生物及细菌的芽胞。
凡能耐高热和潮湿的物品如培养基、生理盐水、纱布、手术器械、注射器、玻璃器材等都可
应用高压蒸汽灭菌法灭菌。
过滤除菌法适用于除去糖溶液、血清培养基、药物等不耐热液体中的细菌，所用设备为滤菌
器，由孔径细小，能阻挡细菌通过的纤维素膜、陶瓷板、石棉板等制成。各种滤膜或滤板的
滤孔大小不同，可供选择。
波长200～300nm之间的紫外线具有杀菌能力，尤以波长为260nm杀菌能力最强。紫外线通过
干扰细菌DNA的复制而使细菌死亡。因紫外线穿透力不强，可被普通玻璃及纸片吸收，所以
常用于实验室、手术室、传染病房等的空气及物体表面的消毒。紫外线灯距照射物以不
超过1.2米为宜，照射20～30分钟即可杀死空气中的细菌。
化学消毒剂一般对病原微生物和机体都有毒性，因此只能用于物品、周围环境以及人体体表
局部的消毒。消毒剂的作用原理：(1)使菌体蛋白质变性或凝固，如含汞的重金属盐类、龙
胆紫、酒精、甲醛等；(2)破坏细菌的酶系统，如高锰酸钾、双氧水、碘液、漂白粉等
；(3)改变细菌细胞壁或细胞膜的通透性，如新洁尔灭、肥皂、来苏儿等。
图1手
提式高压蒸汽灭菌器示意图
1.螺栓2.销子3.器身4.盖子5.安全阀
6.提把7.压力表8.螺母9.排气阀10.排气管
11.提柄12.密封垫圈13.内桶14.筛片
【实验内容和方法】
一高压蒸汽灭菌法(autoclaving)
手提式高压蒸汽灭菌器(见图1)是一双层筒状金属容器，两层之间盛水，外筒坚厚，上端有
盖，盖旁附有螺旋，使用时将螺旋扭紧，使盖紧闭蒸汽不能外溢。盖上装有排气阀门和安全
阀门，以调节器内蒸汽压力，压力表表示内部温度和压力。内筒用于盛放欲灭菌的物品。
【方法】
1先向器内加水，然后把要灭菌的物品装入内筒，将器盖盖好，拧紧螺旋。
2打开排气阀门，加热，待冷空气完全排出后再关闭排气阀，继续加热。
3待器内压力上升到所需数值(一般为15磅)时，减少炉火，使压力维持不变，约15～30分
钟。
4关闭热源，自然放凉，待压力表指针下降到零后，打开排气阀，开盖取物。
【注意事项】
●灭菌时，应严格按操作程序进行，切勿擅自离开，尤其是升压和保压期间要注意压力表指
针的变化，避免压力过高而导致培养基中营养成分被破坏，以及意外事故的发生。
●高压蒸汽灭菌时，必须待器内冷空气完全排出后才可关闭排气阀加压，否则即使压力达到
15磅，温度也达不到121℃，不能达到灭菌效果。
●务必待压力下降到零时，方可开盖，否则会因器内压力骤然下降，致使瓶内液体冲出瓶外
。
●现在最常用的培养基灭菌条件是15磅15分钟，时间过长有可能破坏培养基的营养成分。含
糖的生化培养基的灭菌条件是10磅(115.6℃)15分钟。器皿的灭菌可以是15磅20分钟。
二、紫外线杀菌试验(germicidal test of UV)
【材料】
大肠杆菌肉汤培养物普通营养琼脂平板灭菌的L形玻璃棒灭菌的“A”字形黑纸片
【方法】
1通过无菌操作，用接种环沾取大肠杆菌菌液放到平板培养基上，然后用灭菌的L形玻璃棒
均匀涂布于整个平板。
2镊子在火焰上灭菌后，夹取灭菌的“A”字形纸片，置于琼脂平板中央，然后将平板打
开，放在紫外线灯管下60～80cm处直接照射30分钟。
3照射完毕，用无菌镊子将黑纸片取出烧掉或投入消毒缸内，随即盖好皿盖，37℃培养24
小时，观察和分析结果。
三化学消毒法(disinfection by chemical factors)
【材料】
大肠杆菌肉汤培养物金黄色葡萄球菌肉汤培养物0.1%新洁尔灭2%红汞2%龙胆紫生
理盐水直径6.5mm的灭菌滤纸圆片普通营养琼脂平板
【方法】
1首先在琼脂平板底部标记上述化学消毒剂的名称，留一对照位置。
2将葡萄球菌与大肠杆菌培养物分别均匀涂布于两块琼脂平板培养基上。
3用灭菌镊子夹取无菌滤纸片分别蘸取2%红汞、2%龙胆紫、0.1%新洁尔灭、生理盐水(对照
)，轻轻贴于琼脂平板表面勿移动，纸片间的距离约3cm。
4将平板置于37℃温箱培养24小时后观察结果。纸片周围无细菌生长的区域，称为抑菌环
。通过比较消毒剂的浓度与抑菌环直径的大小，即可了解化学消毒剂的杀菌作用。
【思考题】
①高压蒸汽灭菌法、紫外线、青霉素、碘酒的杀菌机理各是什么?
②影响化学消毒剂抑菌杀菌的因素有哪些?
③啤酒、饮料常用什么方法消毒?
④为什么说消毒与灭菌是微生物学和临床医学必不可少的基本知识?
三细菌的分离与培养
Isolation And Culturing of Bacteria
【实验目的】
1掌握无菌操作技术。
2掌握病原菌的分离与培养方法。
【实验原理】
细菌学检验所接触的标本，均来自临床病人，大多数是含有病原菌而具有传染性的材料。如
果操作和处理不当，可导致实验室感染和医院内感染。为此，细菌学检验，特别是细菌培养
必须随时为防止污染和病原菌的扩散而进行操作，为达此目的的技术就是无菌操作。
细菌的接种技术主要有：平板划线分离法，斜面、液体或半固体培养基接种法。为避免在接
种过程中污染环境和空气中的细菌污染培养物，细菌接种一般应在超净工作台或无菌室内进
行。鉴于学生实验室的实际条件，要求学生在酒精灯旁进行细菌接种。
细菌的培养技术可分为：
(1)一般培养法即需氧培养法，将已接种好的培养基置于37℃恒
温箱中培养18～24小时，一般细菌即可在培养基中生长繁殖。
(2)CO2培养法某些细菌，如脑膜炎球菌、布氏杆菌等，需在增
加CO2的环境中培养才能生长良好，可采用CO2孵箱培养法、烛缸法、化学法。
(3)厌氧培养法(见综合性实验二·厌氧菌的检验一节)
。
人工培养细菌在医学中的实际应用主要有四个方面：
(1)细菌的鉴定和研究细菌的人工培养是鉴定细菌种属的基本手段。观察细菌的形态，了
解各种细菌的培养特性、代谢活动、生化反应、抗原结构、致病力等，均须首先培养纯种细
菌，使其繁殖到足够的数量。
(2)感染性疾病的诊断和防治由细菌所引起的感染性疾病，最确切最可靠的诊断依据(金标
准)
是用人工培养法，从病人材料中把病原菌分离培养出来，并鉴定其种型。为选择有效的抗菌
药物对病人进行合理治疗，也必须通过人工培养方法，将从病人检出的病原菌进行药物敏感
试验。
(3)生物制品的制备供某些传染病血清学诊断使用的细菌诊断液、供预防接种用的活菌或
死菌菌苗和类毒素、供治疗使用的免疫血清或抗毒素血清或微生态制剂等生物制品，在其制
备过程中均须进行细菌的人工培养。
(4)菌种的保存从不同来源分离培养的菌株，以及实验室常备的标准菌株，常需保存较长
时间以备应用。
【实验内容和方法】
一细菌分离培养法(isolation of pure culture)
细菌在自然界分布甚广，种类繁多，被检的临床标本常含有多种细菌，如果要证明该标本中
是否存在某种细菌，或专门研究其中一种细菌等，必须进行细菌分离与纯化，获得纯种培养
物。
通常采用平板划线法从临床标本中分离出病原菌，即：借助划线而将混杂的细菌在琼脂平板
上分散开来，使单个细菌能固定在一点，在适宜的温度下生长繁殖后，各自形成肉眼可见的
细菌集团——单菌落，进而根据菌落形态特征，将单菌落移植传代后进行大量增殖所得的菌
种，称为纯种微生物(纯培养)。
常用接种工具可分为接种针和接种环两类。接种环用来挑取标本菌液及划菌落涂平板等。接
种针则用来挑取单个菌落，穿刺培养等。用于制作接种针或接种环的金属丝通常用镍铬丝或
铂丝做成，具有红得快、冷得迅速、能经受反复烧灼、不易氧化、无毒性，且软硬适中等特
性。
【材料】
脓汁标本粪便标本普通营养琼脂平板伊红美蓝琼脂平板接种环酒精灯
【方法】
1右手拿接种环(如握笔式)，烧灼灭菌，欲伸入试管内的接种环杆部分亦要迅速通过火焰2
～3次，以杀灭其表面的细菌。
2左手握住盛有标本的试管的下端，右手以无名指、小指与手掌在火焰旁拔出试管棉塞并
挟住之，将管口迅速通过火焰三次灭菌。
3立即将已灭菌冷却的接种环伸入试管内，沾取标本(或菌液)一环。试管口火焰灭菌后塞
好棉塞(无菌取材操作见图2)。
图2无菌取材的基本步骤
4左手斜持平板，略开盖，在酒精灯火焰左前方约5～6cm处，将接种环上的菌液涂抹
于平板表面的边缘部分。
5烧灼接种环，冷却后，将接种环自涂抹部分沾取少许菌液，使接种环与平板
表面成30～4
0°角，用腕力将接种环在平板表面来回轻快地划线，动作要轻巧，划线要密但不能重叠，
充分利用平板的面积。
图3平板曲线划线分离法
以上为曲线划线分离法(见图3)，多用于接种材料中含菌数量相对较少的标本或培养物
。而
分区划线分离法(见图4)多用于粪便等含菌量较多的标本，方法是：从原涂抹部分开始，连
续平行划线，每次只划平板的1/4～1/5，划毕后接种环再经火焰灭菌，冷却后用同样方法在
平板其余部分划线，每次划线要与前次划线重叠1～3条，共计3～4次(区)。
6接种完毕，将接种环烧灼灭菌后方可放下。
7将培养皿倒置(琼脂平板的底部向上)，37℃培养24小时后，观察结果。
图4平板分区划分离法
图5琼脂斜面接种的
好环映型
【注意事项】
●每次取菌(或接种)前后，均须烧灼接种工具，接种完毕，不能直接将接种环在火焰中烧灼
，以免环上的细菌或标本因受高热爆烈四溅，应先将细菌或标本烤干后再烧灼。
●不要划破琼脂表面。
●注意无菌操作，防止空气中微生物掉入平板中造成污染。
●初学者可将平皿盖打开放在实验台上，再行划线接种。
二斜面培养基接种法(inoculation of slant medium)
用于细菌增殖和菌种传代、保存。
【方法】(见图5)
1右手拿接种针(环)，烧灼灭菌(方法同前)，冷却后，左手拿平板并略打开平皿盖，通过
无菌操作挑取少许菌苔或一个单菌落。
2左手迅速放下平板，握住一个斜面培养基管的下端(斜面部应向上，勿成水平，以免凝固
水浸湿培养基表面)。右手以无名指、小指与手掌在火焰旁拔出斜面培养基管棉塞并挟住之
，将管口迅速通过火焰三次灭菌。
3立即将接种针(环)伸入斜面培养基管内，在琼脂表面先从底部向上行拉一线，然后自下
而上轻轻地作蜿蜒连续划线，勿触破培养基表面。
4接种完毕，试管口迅速通过火焰2～3次灭菌，塞好棉塞。接种环或针烧灼后方可放下。
5斜面培养基管置于37℃培养过夜。
三液体培养基接种法(inoculation of liquid medium)
用于测定细菌生化特性，观察细菌的不同生长情况。
【方法】
1接种环接种法：通过无菌操作(方法同前)挑取菌苔少许或菌液一环，立即移入肉汤培养
基管中，在接近液面的管壁上轻轻研磨，并沾取少量肉汤调和，使菌液混合于培养基中，混
匀。接种完毕，试管口迅速通过火焰2～3次灭菌，塞好棉塞。接种环烧灼后方可放下。
2移液管或滴管接种法：先拧断移液管或滴管大口端的包扎纸，套上吸球抽出移液管，
并且不要触及其他物体以防污染。左手拿菌种管，右手的拇指和食指夹住移液管和吸球，用
小指和掌边拔出试管棉塞，将移液管或滴管伸入菌种管中，
吸取菌液后立即接种至肉汤培养基管或三角烧瓶中，然后管口火焰灭菌塞上棉塞，
充分摇动几下使菌液与培养基混匀
。带菌的移液管或滴管应浸入5%石炭酸缸中，至少浸30分钟。
四半固体培养基接种法(穿刺接种法)(inoculation of semisolidmedium)
用于细菌动力试验，即观察细菌有无运动能力。
图6半固体培养基穿剌
接种法
【方法】(见图6)
1如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种的半固体琼脂培养基。
2右手握接种针，灭菌冷却后，挑取菌苔少许，垂直刺入半固体琼脂培养基的中心，可刺
达近管底处，但不要达于管底，然后沿原路退出。
3接种完毕，试管口迅速通过火焰2～3次灭菌，塞好棉塞。接种针烧灼后方可放下。
4斜面培养基管置于37℃培养过夜。
【思考题】
①做细菌培养时，平板为什么要倒放?
②培养细菌的常用方法有哪些?
③从临床标本中分离病原菌，应注意哪些事项?
④为什么接种环在使用前、后都必须烧灼灭菌?忽略了有什么危害?
⑤半固体穿刺接种时，为什么要强调“原路返回”?
四细菌群体生长特征的观察
Observation of Growth Characteristics of BacterialPopulation
【实验目的】
了解并比较细菌在固体、半固体及液体培养基上的生长特征。
【实验原理】
不同的细菌生长在一定的培养基上往往有不同的特征，因此，培养特征可以作为细菌分类鉴
定的重要依据。
【实验内容】
一观察细菌在固体培养基上生长特征
1平板菌落特征
细菌在琼脂平板上培养一定时间后，形成菌落。各种细菌菌落都有一定的特点，表现在以下
几方面：
①大小：大(直径约3mm以上)，中(直径约1～3mm)，小(直径约1mm以下)。
②形状：圆形，卵圆形、假根形、丝状、不规则等。
③边缘：整齐，锯齿状，波浪状，羽毛状。
④表面：隆起、平坦、中心凸起、脐形凹陷；光滑或粗糙、湿润或干燥。
⑤溶血性：不溶血，不完全溶血(菌落周围呈草绿色、不透明)，溶血(菌落周围出现透明环)
。
⑥色素：一般为无色或灰白色，特殊色素有两类：脂溶性色素(菌落本身着色，培养基不着
色)和水溶性色素(菌落及培养基均着色)。
2斜面菌苔的特征
不同的细菌在斜面培养基上生长，往往也具有一定的特征，表现在生长量、菌苔形状(如线
状、念珠状、假根状、薄膜状等)、表面形状、光泽、透明度、颜色等方面。
二细菌在液体培养基中生长特征的观察
细菌在液体培养基中生长可出现肉眼可见的各种特征，如培养液浑浊或澄清，出现形态不一
(如絮状、块状等)的沉淀，或在培养基表面形成菌膜(薄膜、厚膜或仅沿管壁产生一圈菌
膜即菌环等)。
三细菌在半固体培养基上生长特征的观察
不同的细菌经半固体培养基穿刺接种后生长情况不同。能运动的细菌，往往沿穿刺线扩散生
长
(即有动力)，而使穿刺线周围出现模糊或混浊；不能运动的细菌仅沿穿刺线生长；严格好氧
菌仅表面生长，兼性厌氧菌沿整个穿刺线生长。
五细菌个体形态特征的观察
Observation of Morphologic Characteristics of Bacteria
【实验目的】
1掌握油镜的正确使用。
2掌握细菌涂片标本的制备。
3掌握革兰氏染色法。
4熟悉细菌的基本形态。
5了解细菌的特殊结构。
【实验原理】
细菌是一类具有细胞壁的单细胞微生物，在一定环境下有相对恒定的形态结构。尽管细菌菌
落肉眼可见，但要观察单个细菌细胞，必须借助光学显微镜将其放大900～1000倍，因此，
掌握显微镜的使用方法是研究细菌的基本技能。在微生物学中主要使用的是油镜。油镜是因
为在使用时需要香柏油作介质而得名。
细菌菌体在强光下呈透明或半透明，其折光系数与玻璃片相似，在光学显微镜下难以看清楚
，所以，必须将细菌制成涂片，固定后，用化学染料使菌体着色，从而和周围背景产生鲜明
对比，才能观察到细菌的形态与结构。
染色方法有单染法和复染法。单染法是只用一种染料染色，如美蓝或复红，能清楚观察菌体
大小、形态与排列，但不能鉴别细菌。复染法，即鉴别染色法，是用两种或两种以上染料，
可将细菌染成不同的颜色，用于协助鉴别细菌。常用的复染法有革兰氏染色法和抗酸染色法
。
革兰氏染色法是细菌学中最为经典的、广泛应用的染色法，可将细菌分成两大类：革兰氏阳
性(G+)菌和革兰氏阴性(G-)菌。
革兰氏染色法的原理尚不完全清楚，主要有三种学说：
(1)通透性学说：G+菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质
含量少，酒精不易透入，反
而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。G-菌细胞壁比较疏松，肽聚糖
层
很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，
细胞内的结晶紫—碘复合物容易被酒精脱出。
(2)等电学说：G+菌等电点(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，一般
染色时染液的酸碱度在pH7.0左
右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱
色。
(3)化学学说：G+菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是
核
糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料—媒染剂复合物结合，使已着色的细菌不易脱色。
革兰氏染色法的实际意义有鉴别细菌、指导临床上选用有效药物和了解细菌的致病
机理。在细菌分离培养或细菌药敏试验来不及做的情况下，常可根据细菌涂片染色镜检的初
步结果来选择用药，有利于及早控制感染。
【实验内容和方法】
一油镜的使用和保护(use and care of oilimmersionmicroscope)
1将显微镜平置于实验台上。
2转动物镜转换器使低倍镜与镜筒垂直到位(听到“咔”声即可)。然后将反光镜凹面对着
日光灯源翻动，打开聚光器的光圈，将聚光器升至最高，侧面观察聚光器明亮或从目镜观察
视野明亮即说明对光完成。
3将标本(标本面向上)放入载物台上的标本夹中，先用低倍镜找出标本的范围。
4在镜头对准的玻片部位滴一滴香柏油，转换油镜(镜头刻有一个“HI”或“oil”字或标
有100×)，眼睛从镜筒侧面看油镜头，将粗调节器作顺时针或逆时针方向(取决于不同
型号的显微镜)缓缓转动使镜筒下降，并使油镜头浸泡于油中，几乎与标本接触。然后用左
眼看目镜，一面观察，一面仔细调节微调节器使镜头提升，直到物像清楚为止。
5油镜用毕，应立即以擦镜纸拭去香柏油，然后再用擦镜纸沾少许二甲苯擦拭，最后用干
净擦镜纸擦去二甲苯。将各物镜转成“八”字形，聚光器稍下降，以免接物镜与聚光镜相碰
受损，然后放入镜箱。
【注意事项】
●取送显微镜时动作要轻，一只手持镜臂，一只手托镜座，防止反光镜、目镜、物镜等脱落
损坏。
●勿将镜臂弯曲，因为微生物学实验经常使用油镜，若载物台倾斜，镜油易流淌外溢，
影响观察或造成污染。
●使用油镜时，一定要等标本干后才能滴加香柏油，滴油时应避免气泡形成。
●调焦时要特别谨慎，切忌采用眼睛对着目镜边观察边下降镜筒的错误操作，以免物镜与玻
片相撞，损坏镜头和压破标本。
●油镜用完后一定要擦洗，以防油干影响其使用寿命。
附录
使用油镜时，须加香柏油的原理(见图7)是：油镜的透镜孔很小，自标本玻片透过的光线，
图7油浸镜使用的原
理
因介质密度(从载物玻片至空气再进入油镜)不同，有些光线因折射或全反射 ，就不能进入
透镜，致使射入的光线较少，物象显现不清，若在油镜与载物玻片中间加入和玻璃折射率(n
=1.52)相仿的香柏油(n=1.515)，则不使通过的光线有所损失，进入透镜的光线即多，视野
的亮度也就增大了。
二细菌涂片(Smear)标本的制备
细菌是胶体性物体，染色镜检时，必须经过轻烤脱水使菌体固定在玻片上。固定的目的是：
①杀死细菌；②使菌体不易变形；③使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水洗掉
；④使菌体蛋白变性易着色。
【材料】
脓汁标本分离菌粪便标本分离菌酒精灯接种环载玻片生理盐水
图8细菌涂片的制作
【方法】(见图8)
1涂片：取洁净的载玻片一张，用在火焰上烧过的接种环取生理盐水1～2环于玻片上。接
种环灭菌后，挑取细菌培养物少许与盐水轻轻磨匀，涂抹成直径1厘米大小的均匀薄膜。临
床标本如脓汁、痰、分泌物等可直接涂片。
2干燥：涂片最好在室温中自然干燥，必要时可将涂片膜面向上，小心间断地在弱火高处
略烘，以助水分蒸发，但切勿紧靠火焰，以免涂膜烤枯，染色后难以检查。
3固定：手持玻片的一端，标本面朝上，在火焰外层快速地来回通过2～3次，共约2～3秒
，使标本固定，即可进行染色。
【注意事项】
●涂片不可过厚，一定要涂成薄膜。
●涂片必须注意轻轻操作，如果动作过猛，可能会产生气溶胶，造成飞沫传染。
●固定要适当，温度不宜过高，否则可能使细胞形态改变。
三革兰氏染色法(Gram′s stain)
【材料】
结晶紫染液(第1液)芦戈氏碘液(第2液)95%酒精(第3液)稀释石炭酸复红(第4液)染
色架吸水纸
【方法】
1初染：在已固定的细菌涂片上滴加结晶紫染液1～2滴，经1分钟后用细流水缓缓冲洗，并
倾去玻片上余水。
2媒染：加芦戈氏碘液1～2滴，经1分钟后用细流水缓缓冲洗，并倾去玻片上余水。媒染剂
的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，不易脱落。
3脱色：滴加95%酒精数滴，轻轻摇动玻片几秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片，使脱掉的
染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精无色或稍淡紫色为止(约需20～30秒)，立即
用细流水将酒精冲掉，并倾去玻片上余水。
4复染：加稀释复红1～2滴，经30秒～1分钟后用细流水缓缓冲洗，并倾去玻片上余水。
标本凉干后，滴加香柏油，用油镜观察，革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。
【注意事项】
●革兰氏染色时，关键环节是脱色。若脱色不够，革兰氏阴性菌可被染成阳性菌；脱色过度
，革兰氏阳性菌可被脱色而误认为是革兰氏阴性菌。
四细菌的基本形态与特殊结构的观察
【材料】
1.球菌示教片：葡萄球菌淋球菌
2.杆菌示教片：大肠杆菌痢疾杆菌
3.螺菌示教片：幽门螺杆菌霍乱弧菌
4.特殊结构示教片：鞭毛(伤寒杆菌)芽胞(破伤风杆菌)荚膜(肺炎链球菌)
【思考题】
①如何使用油镜?
②革兰氏染色法的关键步骤是什么?为什么?
③染色时为什么通常要用新鲜的细菌培养物?
六细菌生化反应鉴定
Characterization of Bacteria by Biochemical Reaction
【实验目的】
1熟悉几种常用的细菌生化反应的名称、原理、方法、结果分析及用途。
2掌握血浆凝固酶试验的原理、方法及用途。
【实验原理】
由于细菌的种类和基因结构不同，所形成的独特酶系也不同，故对糖和蛋白质的分解能力及
其代谢产物亦不一，能表现各自的特点。据此采用生化反应检测细菌对各种基质的代谢作用
及其代谢产物(分解代谢和合成代谢产物)，不仅可以区别和鉴定细菌的种类，而且可以探讨
细菌的生活规律、代谢机理及其与周围环境物质之间的关系。
不同细菌分解糖类的能力不同，分解产物也不一样。有的细菌能分解某些糖类而产生多种酸
(如乳酸、醋酸等)和气体(如H2、CO2等)，有的只产酸不产气。有的细菌不能分解某些
糖。某些细
菌能分解蛋白质中的胱氨酸等含巯基氨基酸，形成硫化氢。硫化氢遇醋酸铅或硫酸亚铁则形
成黑褐色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。借此可协助鉴别菌种。
细菌在生长繁殖过程中，还能产生一些具有鉴别意义的酶，如：
(1)幽门螺杆菌能在胃中(酸性环境)定植和生长，其中一个重要原因是该菌产生大量的尿素
酶，分解尿素释放出氨，从而缓冲酸性pH的作用，造成一个局部的中性微环境。
(2)致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或兔等动物血
浆发生凝固，凝固的血浆沉积于菌体表面，阻碍吞噬细胞的吞噬，或即使被吞噬，也不易被
杀死，从而有利于细菌繁殖，引起感染。在临床微生物学检查中，血浆凝固酶是鉴别葡萄球
菌有无致病性的重要指标。
【实验内容和方法】
1糖发酵试验(sugar fermentation test)
单糖发酵微量管是只含有一种糖(如葡萄糖、乳糖)的pH7.6的蛋白胨水，并加入一定量的指
示剂。接种细菌经培养后，若该菌具有分解该糖的酶，有酸产生时就能使指示剂变色。如指
示剂为酸性复红［pH4.2(红色)～6.2(黄色)］，则变成红色；溴甲酚紫［pH5.2(黄色)～6.8
(紫色)］则呈黄色。若有气体产生，则微量管内集聚气泡。
【材料】
粪便标本分离菌接种针小砂轮葡萄糖发酵微量管(管底红色)乳糖发酵微量管(管底
黄色)
【方法】
1通过无菌操作，用灭菌接种针刮取细菌新鲜培养物少许，分别接种在葡萄糖发酵微
量管和乳糖发酵微量管内。
2将微量管平放在平皿盖内，37℃培养过夜后观察结果。
3结果判断：如培养基中指示剂颜色未变时，表明细菌不分解糖，以“-”表示。如颜色改
变时为细菌分解糖产酸，以“+”表示；如果同时有气泡产生时，则为细菌分解糖产酸又产
气，以“”表示。
【注意事项】
●观察结果时，应先观察是否产气，切勿将微量管竖立，以免气体溢出。
二甘露醇发酵试验(mannitol fermentation test)
【材料】
脓汁标本分离菌甘露醇微量管
【方法】
1通过无菌操作，用灭菌接种针挑取细菌新鲜培养物少许，接种在甘露醇微量管内。
237℃培养过夜后观察结果。
3结果判断：培养基中指示剂颜色改变时为细菌分解甘露醇产酸，以“+”表示，不变为阴
性反应。
三硫化氢试验(hydrogen sulfide test)
【材料】
粪便标本分离菌硫化氢微量管
【方法】
1通过无菌操作，用灭菌接种针挑取细菌新鲜培养物少许，接种在醋酸铅微量管内。
237℃培养过夜后观察结果。
结果判断：醋酸铅培养基中出现黑色沉淀为阳性反应，不变为阴性反应。
四尿素分解试验(ureasplitting test)
细菌产生的尿素酶能分解尿素形成大量的氨，使培养基酸碱度上升而变成碱性，酚红指
示剂呈现红色，是为阳性反应。
【材料】
粪便标本分离菌尿素微量管
【方法】
1通过无菌操作，用灭菌接种针挑取细菌新鲜培养物少许，接种在尿素微量管内。
237℃培养过夜后观察结果。
3结果判断：尿素培养基从黄色变为红色者为阳性反应，不变为阴性反应。
五血浆凝固酶试验(coagulase test)
【材料】
脓汁标本分离菌兔血浆生理盐水载玻片
【方法】
1取干净玻片一块，用计号笔将玻片分为两格，其中一格加兔血浆1～2滴，另一格加生理
盐水1滴。
2将接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌冷却后，取细菌新鲜培养物少许，在生理盐水中研磨
混匀成细菌悬液。
3用灭菌接种环取细菌悬液1环，或挑取细菌培养物少许，在兔血浆中轻轻磨匀。
4稍待片刻，观察结果。
5结果判断：先观察生理盐水对照，应呈均匀混浊现象。再观察细菌与兔血浆混合物，
若有凝块出现，则为阳性；无凝块出现为阴性。
【注意事项】
●兔血浆和细菌培养物要适量，以免干燥，难以观察结果。
【思考题】
①细菌生化反应在感染性疾病诊断中有何重要意义?为什么?
②分析本次实验的结果。如结果不佳，原因何在?
③为保证实验结果的可靠性，你认为上述试验应还设立哪些对照?
七细菌血清学反应鉴定
Characterization of Bacteria by Serological Reaction
【实验目的】
1掌握玻片凝集试验的原理、方法、结果观察与判断。
2熟悉肥达氏反应的原理、方法、结果判断和分析。
【实验原理】
血清学反应是指抗原抗体www.med126.com在体外的特异性结合反应，可用已知抗原检测未知抗体或用已知抗
体检测未知抗原。常见的有凝集反应、沉淀反应、补体结合反应和中和反应等。血清学反应
常用于传染病的诊断和微生物菌株的鉴定。
将已知的抗体(诊断血清)直接与未知的颗粒性抗原物质(如细菌)混合，在有适当电解质存在
条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应
便无凝集物出现，即为阴性，称为直接凝集反应，属定性试验，有玻片法和试管法两种，主
要用于检测抗原，如菌种的鉴定与分型、ABO血型鉴定等。
用各种标准的伤寒杆菌H、O抗原和甲型副伤寒H抗原、乙型副伤寒杆菌H抗原与病人不同稀释
倍数的血清做定量凝集试验，称为肥达氏反应，可用于测定患者血清中相应抗体的含量及其
增减情况，以辅助肠热症(伤寒和副伤寒)的诊断。
【实验内容和方法】
一玻片凝集试验(slide agglutination test)
【材料】
载玻片诊断血清粪便标本分离菌
【方法】
1取干净载玻片二张，用计号笔将玻片分为两格，分别加入大肠杆菌诊断血清、痢疾杆菌
诊断血清、伤寒杆菌诊断血清、乙型副伤寒杆菌诊断血清各1～2滴。
2将接种环烧灼灭菌、冷却后，取细菌培养物少许，分别在4种诊断血清中研磨混匀，接
种环作灭菌处理后方可放下。
3如上述混合悬液由均匀混浊变为澄清透明，并出现大小不等的乳白色凝集块者即为阳性
；如混合物仍呈均匀混浊则为阴性。如肉眼观察不够清楚，可将玻片置于显微镜下用低倍镜
观察。一般可立即出现凝集现象，如结果不明显，可转动玻片数次。2～3分钟仍不出现凝集
者，可认为阴性。
4观察完毕，将载玻片立即放入指定的消毒缸内(为什么?)
【注意事项】
●诊断血清和细菌培养物比例要适量，以免干燥，来不及观察结果。
●每一菌株应同时作生理盐水对照，防止误将细菌自凝现象认为凝集反应。
二肥达氏反应(widal test)
【材料】
病人血清甲型副伤寒杆菌“H”菌液乙型副伤寒杆菌“H”菌液伤寒杆菌“H”菌液与
“O”菌液试管吸管吸头生理盐水37℃水浴箱
【方法】
1取小试管28支，在试管架上排成4排，每排7支。
2在中试管加入生理盐水3.8ml，再换一支吸管，吸取患者血清(须先经56℃，30分钟灭活)
0.2ml，并用原吸管吸吹3次混匀(这时血清稀释度为1∶20)。
3取1∶20血清2ml，在每排第1管中各加入0.5ml。
4吸生理盐水2ml，加入到上述中试管中，与余下的2ml1∶20的血清混匀，即稀释成1∶40
。然后吸取2ml1∶40的血清，向每排第2管中各加入0.5ml。
5按上法将血清不断做倍比稀释，并依次加入各管，直至每排第6管止。
6各排第7管不加血清，各加入生理盐水0.5ml作为对照。
7依7、6、5……1管的顺序，加入菌液：
第1排各管中加入伤寒杆菌“H”菌液0.5ml。
第2排各管中加入伤寒杆菌“O”菌液0.5ml。
第3排各管中加入甲型副伤寒杆菌“H”菌液0.5ml。
第4排各管中加入乙型副伤寒杆菌“H”菌液0.5ml。
这时每排各管中血清的最终稀释度如下：
试管序号〖〗1〖〗2〖〗3〖
〗4〖〗5〖〗6〖〗7
血清稀释度〖〗1∶40〖〗1∶80〖〗1∶160〖〗1∶320〖〗1∶640〖〗1∶1280〖〗——
8将各管中悬液混匀，置37℃水浴箱中2小时，取出置室温过夜，次日观察结果。
附：结果判断与分析
先看各排对照管，应无凝集，悬液仍然均匀混浊，或仅有极少量菌体沉于管底呈一集中的小
点；伤寒杆菌“H”抗原、甲型和乙型副伤寒杆菌“H”抗原与相应抗体的凝集块呈絮状疏松
，沉于管底，轻摇时沉淀物极易浮起，且易破碎；伤寒杆菌“O”抗原的凝集较紧密，呈颗
粒状沉于管底。
根据凝集反应的强弱，分别以、、、＋记录之。
：液体清彻透明，菌体全部被凝成块，沉于管底。
：液体较透明，菌体大部分被凝集而沉于管底。
：液体稍透明，管底有少量凝集沉淀物。
＋：液体较混浊，可见极少量凝集沉淀物。
-：液体的混浊度及管底沉淀物与对照管相似，无沉淀。
一般以出现凝集的血清最高稀释倍数作为该血清对某抗原的凝集效价。
在分析结果时，首先应考虑当地正常人效价。一般以单份血清凝集效价：伤寒O应达1∶80以
上、伤寒H应达1∶160以上，甲型和乙型副伤寒H应达1∶80以上才有诊断价值。若第二次血
清效价比第一次高4倍以上，有诊断价值。
【思考题】
1、血浆凝固酶试验和玻片凝集试验观察完毕，应将载玻片立即放入消毒缸内，为什么?
2、根据实验结果，试分析标本中可能有何种细菌，为什么?
八细菌药物敏感性试验
Test of Susceptibility of Bacteria to Drug
【实验目的】
1熟悉药物敏感性试验方法的种类、原理及应用。
2掌握纸片扩散法。
【实验原理】
自从抗生素、磺胺类等抗菌药物广泛应用以来，致病菌对这些药物产生耐药性的情况日益增
多，并以金黄色葡萄球菌、结核杆菌、痢疾杆菌、铜绿色假单胞菌、大肠杆菌等尤为突出。
细菌耐药性变异，是临床工作中必须注意的问题。为了防止细菌产生耐药性和确保治疗效果
，在用抗生素治疗前，应做细菌药物敏感性试验，选用敏感的药物进行治疗，避免为耐药性
突变的菌株提供选择和发展的条件，这就要求细菌学工作者必须保证药敏试验结果高度准确
性。
细菌对抗生素敏感性试验方法有：
(1)液体稀释法：在试管中加入一定量适于测试菌生长的液体培养基作为稀释液，将不同剂
量的药物加入各管中，使形成一组含不同递减浓度的药物试管，然后逐管加入一定量的测试
菌，在合适温度下培养一定时间后，用肉眼观察其混浊度或用光电比色计作比浊测定，以不
长菌管的最低药物剂量为该药的MIC；
(2)琼脂稀释法：将不同剂量的药物与一定量融化的固体培养基相混合，制成含不同递减浓
度的药物平板，然后将一定量的测试菌接种于含药平板上，在合适温度下培养一定时间后，
观察测试菌的生长情况，以不长菌的平板所含最低药物剂量为该药的MIC；
(3)纸片扩散法：是利用抗生素在琼脂培养基的扩散渗透作用，将含已知浓度的药物滤纸片
贴于含有敏感性试验菌的琼脂培养基表面，抗生素就自纸片向平板四周扩散渗透，在抑菌浓
度所达范围内敏感菌的生长被抑制而出现抑菌圈，通过比较抗生素浓度与抑菌圈的大小以测
定抗生素的抑菌浓度。
细菌药敏试验中所用的专门名词解释如下：
最低抑菌浓度(Minimal InhibitoryConcentration,MIC)：抗菌药
物能够抑制细菌生长所需要的最低浓度。
最低杀菌浓度(Minimal BacteriacidieConcentration,MBC)：抗
菌药物杀灭细菌所需要的最低浓度。
敏感(Sensitive)：常用量预期有效。
中度敏感(Moderate sensitive)：常用量体内药物浓度较高的部
位或超常用量增加血中药物浓度预期有效。
耐药(Resistant)：常用量预期无效。
病原菌对某种抗菌药物敏感、中度敏感和耐药的分界点是根据该菌在血中的治疗浓度和病原
菌对该药物的最小抑菌浓度而确定的。
【实验内容和方法】
一纸片琼脂扩散法(Kirby Bauer method)
本法快速、简便，已为多数临床细菌学实验室所采用。
【材料】
脓汁标本病原菌粪便标本病原菌MullerHinton琼脂平板肉汤培养基青霉素、链霉
素、庆大霉素和生理盐水滤纸片尺
图9纸片法药敏试
验图型
【方法】
1培养基制备MH琼脂(pH7.2～7.4)倾注入直径9cm平皿中，厚
度约为4mm。临用时，半开
盖平板，倒置于35℃培养箱10～20分钟使表面干燥。链球菌或其他较难生长的细菌可在上述
培养基中加入5%无菌脱纤维羊血。
2被检菌液的制备挑取单菌落4～5个，接种于4～5ml肉汤培养
基内，置35℃孵育4～6小
时，使菌液达到或超过1.5×108/ml麦氏比浊管浓度。加入灭菌盐水，使其浓度与标准管
一致。
3接种制备好的接种菌液必须在15分钟内使用。用无菌棉拭沾
取新鲜菌液，涂布接种于M
H琼脂表面，重复三次，每次将平板旋转60度，保证菌液均匀分布。盖好平皿，放置5分钟，
待平板表面水分被琼脂完全吸收。
4贴抗菌纸片用无菌眼科镊子夹取抗生素滤纸片(直径为6.35mm
，每片吸水量约为20μl)
，分别贴在平板上。用镊尖压一下，使其贴平。各滤纸片之间距离应基本相等(不少于24cm)
，纸片中心距平皿边缘约15mm。在平板底面上做好标记。在15分钟内将平板置35℃培养18～
24小时后取出观察结果。
5结果判断如细菌对药物敏感，则含该药物的滤纸片周围无菌
生长。无菌生长的区域称
抑菌环。如细菌对该药物具有耐性，则无抑菌环或抑菌环直径较小。记录并比较抑菌环直径
大小，判断细菌的敏感性。
6同时接种质(量)控(制)菌株作为阳性对照。KB法质控用菌株常规有三种，分别是金黄
色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。生理盐水纸片作为
阴性对照。
常用药敏试验纸片判断标准
抗菌药物〖〗纸片含药量〖〗抑菌圈直径(mm)〖〗耐药中度敏感敏
感
青霉素G(葡萄球菌)〖〗10单位〖〗≤28〖〗-〖〗≥29
链霉素〖〗10微克〖〗≤11〖〗12-14〖〗≥15
庆大霉素〖〗10微克〖〗≤12〖〗13-14〖〗≥15
四环素〖〗30微克〖〗≤14〖〗15-18〖〗≥19
【注意事项】
●购取抗生素滤纸片因产地不同，纸片含药量也可能不同，因此在判断结果时应注意参照标
准。
●结果的读取应首先测量质控菌株的抑菌环直径，如在允许范围内，被检菌结果才可信。
二琼脂平板稀释法(agar dilution method)
琼脂平板稀释法药敏试验的优点：(1)比液体稀释法重复性好；(2)可同时检测多种被检菌；
(3)可发现混合菌和污染菌；(4)可观察菌落生长良好与否。因此，WHO推荐此法为细菌药敏
试验最佳方法。
【方法】
1制备含不同浓度抗菌药物营养琼脂平板，当琼脂温度在50℃左右时加入抗菌药物，温度
过高，抗菌药物受破坏，温度过低则药物不能混匀。
2接种新鲜菌液。用接种环接种5～8mm圆形区，
同时接种被检菌和已知MIC的标准质控菌株。
335℃培养18～24小时后，以完全抑制细菌生长的最低药物浓度为被检菌的MIC，薄层极微
弱生长或只生长1～2个菌落可忽略。阳性对照(不含抗菌药物)培养基应出现接近融合生长。
附：药敏自动化检测系统
目前有MIC2000，MS2，Cobas Bact和Vitek AMS等。这些仪器基本原理是利用光学手段
监测细菌增殖的程度。以只含菌不含药的小管(或小凹)内的光学浊度(或透明度)的增长程度
与含药和细菌的小管(或小凹)内的细菌增殖程度，对比判断敏感(S)、中度敏感(MS)或耐药(
R)。
一般而言，自动化检测仪主要优点是可快速(约4～5小时)获得药敏结果，且可同时测十
多种抗菌药物，临床医师可及时选用有效治疗药物，缩短住院日期，降低医药费用。但不论
哪种自动化检测仪均不能完全代替WHO推荐的药敏试验方法。Vitek AMS与KB扩散法的符合
率95～98%，CobasBact与KB扩散法符合率88.1～90.1%。特别值得注意的是，自动化检测
仪
不能检出某些异型耐药菌株，有时误将耐药报告为敏感。AMS也不能发现污染菌株，可能将
敏感报成耐药。而KB法可察觉异型耐药菌株和污染菌株。AMS可避免扩散慢的药物如SXT药
敏试验结果出现假耐药，而KB法则不能避免。
【思考题】
1、抗生素敏感性实验有何实际意义?
2、报告纸片法试验结果，是否符合你所鉴定的细菌的药敏特性?
3、细菌药物敏感试验要设立哪些对照?为什么要设立这些对照?
九.细菌的动物感染与致病性试验
Animal Infection And Pathogenicity Tests of Bacteria
【实验目的】
1掌握细菌动物感染的常用方法。
2了解感染动物的细菌学检查原则。
3了解细菌外毒素和内毒素测定的原理和方法。
【实验原理】
为了证明人类的某特定感染性疾病是由特定病原菌引起的，必须采取Koch准则的所有步骤，
即：
①在同一特定疾病的机体中常能发现同一种病原菌；
②能从患病机体中分离出这种病原菌，并获得纯培养；
③将这种培养物接种到易感动物体，应能引起相同的疾病；
④能从感染的实验动物中重新分离出与原接种菌相同的病原菌，并获得纯培养。
这或许需要在人身上进行某些不合道德的、而又迫不得已的科学实验。但是，并不是在所有
情形下都有可能采取这些步骤，如不宜在人体中做鼠疫杆菌感染实验。因此，通常需要在动
物体中进行微生物感染实验。
细菌的动物感染应用十分广泛，如：①细菌的鉴别和诊断；②细菌致病物质和致病机理的研
究；③考察抗菌药物和生物制品的疗效；④制备各种免疫血清及抗毒素。
不同的细菌对动物的易感性不一，感染的途径也不一，因此，在进行细菌的动物感染时应选
择易感动物，确定适当的感染途径，严格执行无菌操作。常用的实验动物有小鼠、豚鼠、家
兔等。为使动物试验正确、可靠，必须按实验要求，选择动物种、系及体质健康，生长发育
良好，一定的体重和年龄，具有高度敏感(或易感)性，且饲养管理比较方便的动物。
病原菌突破机体的屏障结构并定居于某组织后，能适应机体生化环境进行生长繁殖，其中大
多数细菌能产生毒性酶(如血浆凝固酶、透明质酸酶)，构成细菌的侵袭力，同时合成和释放
毒素(内毒素和外毒素)，引起宿主的损伤而致病。
【实验内容和方法】
一动物的实验感染方法与感染动物的细菌学检查
(infecting method of experimental animal and bacterial examination ofinfected a
nimal)
根据病原菌不同，可采用不同的接种法，如腹腔内注射、静脉内注射、皮下注射、脑内接种
、眼角膜接种、肌肉注射和喂饲接种法等。
【材料】
小白鼠肺炎球菌菌液无菌注射器及针头碘酒、酒精棉球
【方法】
1、用无菌注射器以无菌操作要求吸取肺炎球菌菌液，吸取量稍多于使用量，注射器内不能
有气泡，故吸入菌液后应将注射器针头朝上，在针头上裹以消毒棉花，使气泡上升，然后轻
轻推出，避免菌液四溅，特别注意防止眼结膜感染。
2、用右手轻轻拖鼠尾，使其爬行于粗物表面上再以左手拇、食两指抓紧小白鼠两耳及其颈
项皮肤，使鼠体被固定在左手掌间，以左手无名指或小指夹住鼠尾及左后腿，然后用碘酒消
毒腹壁皮肤。
3、左手倾斜，使小白鼠头部稍向下，将预先准备的菌液注入腹腔内，注射时右手持已吸有
菌液的注射器，针尖自小鼠左侧腹股沟处刺穿皮肤，使针尖在皮下组织内向前移行约1厘米
左右，然后再轻轻向下刺进腹腔，抽吸注射器，如无回血或尿液，表示针头未刺入肝、膀胱
等脏器，即可注射。
4、接种完毕，将小白鼠标以记号，置入鼠罐中，并填写动物实验记录卡或标签，注明试验
动物名称、编号、注射材料、部位、剂量以及注射日期，然后将卡片挂在动物容器上。
5、感染动物予以隔离喂养，并逐日观察，注意有无发病症状，如食欲不振，竖毛，不活泼
等现象，并加以记录，必要时定期测量体重及体温，若有致死可能，务必在动物濒死前及时
杀死，作病原学分离与病原学检查。
6、实验动物或患病动物的细菌检查应根据病原菌不同，采集不同的标本，如血、尿、粪便
、内脏等。对待检标本，可进行直接涂片、染色镜检，或进行细菌的分离培养与鉴定。
二透明质酸酶实验(spreading test of hyaluronidase)
透明质酸酶，又称扩散因子，能溶解机体结缔组织中的透明质酸，使组织疏松，通透性增加
，使病菌易在组织中扩散、病灶扩大。
【材料】
家兔碘酒、酒精棉球无菌注射器墨汁(或美兰)溶血性链球菌培养物(或透明质酸酶
溶液)生理盐水。
【方法】
1取家兔一只，将其背部两侧毛剪去，用碘酒、酒精消毒。
2用注射器吸取0.1ml墨汁(或美兰)和0.1ml溶血性链球菌培养物(或含透明质酸酶600单位
的溶液)，注射一侧皮内。
3于另一侧背部皮内注射0.1ml墨汁和0.1ml生理盐水，作为对照。
4注射后1小时后观察结果，比较两侧墨汁扩散范围的大小。
三内毒素的致热实验(fever action of endotoxin)
内毒素具有多种生物学活性，主要毒性作用有发热反应、白细胞反应、休克等。将含内毒素
的细菌培养物注入动物体内，由于内毒素的毒性作用，动物可表现出这些症状。
【材料】
家兔内毒素(伤寒杆菌培养滤液)半导体点温度计无菌注射器碘酒、酒精棉球
【方法】
1注射内毒素前，用半导体测温计固定测量家兔耳内凹处皮肤体温，并记录结果。
2以手指轻弹兔耳，去毛，压迫耳根部静脉，使耳外缘部静脉充血而怒张，然后先用碘酒
，再用酒精消毒，用无菌注射器吸取内毒素0.5ml，注入兔耳静脉内。
3另取一只家兔，同法注射生理盐水0.5ml，作为对照。
4注射后，每间隔20分钟测量一次体温，直至2小时为止，并记录结果，观察是否体温升
高。
四破伤风外毒素的毒性作用实验
(toxic action of Tetanus exotoxin)
破伤风杆菌外毒素(痉挛毒素)是一种神经毒素，对脑干神经和脊髓前角神经细胞有高度亲和
性，以毒害中枢神经系统为主，有导致肌肉强直性痉挛等一系列表现。
【方法】
1取健康小白鼠二只，将其后腿用碘酒、酒精消毒后，一只经肌肉注射破伤风杆菌培养滤
液(含破伤风外毒素)0.1ml；另一只注射肉汤培养基0.1ml作对照，分别将二只小白鼠放入已
标记好的鼠缸内。
2填写动物实验记录卡片，注明试验动物名称、记号、注射材料、部位、剂量以及注射日
期等，然后贴于鼠笼上。
3每隔2小时观察一次。小白鼠尾巴强直，注射毒素侧的下肢麻痹，呈强直性痉挛，随着时
间的延长，症状逐渐加剧，并可见全身肌肉痉挛、角弓反张等现象，1～2日内小白鼠死亡。
对照小白鼠无异常表现。
【思考题】
请设计一个破伤风抗毒素中和作用的实验方案。
十微生物快速诊断新技术
自1876年Koch创用固体培养法分离培养细菌以来迄今的百余年中，微生物诊断技术的进展大
体可分为三个阶段。
第一阶段在纯培养的概念指导下发展起来的常规微生物学诊断技
术，主要包括病原体的显
微镜检查、分离培养、生化反应鉴定、血清学反应鉴定及动物实验等技术。这些技术所需检
样量大，耗用药品器械多，一般要数天才能出结果，因而不能满足临床诊断和治疗的需要。
进入本世纪以来，许多微生物学工作者试图改变这种状况，努力向简单、快速的目标迈进，
取得了一些进展，但始终摆脱不了纯培养概念的束缚。
第二阶段自本世纪七十年代以来，随着物理学、化学和免疫学的
发展而建立起来的分析微
生物学技术及免疫学技术，使微生物学诊断技术摆脱了纯培养的概念，打破了常规微生物学
诊断的旧框框，绕过了繁琐的纯培养操作，直接对标本进行检测，在几小时甚至几十分钟内
获得结果，使微生物的快速诊断成为可能，达到对传染病进行早期诊断、治疗效果评价及预
后判断之目的。分析微生物学技术主要包括，气相色谱技术、电阻抗测量技术、放射测量技
术和发光技术等。用于微生物快速诊断的免疫学技术常用的有免疫荧光技术、免疫酶联技术
、放射免疫技术和对流免疫电泳技术等。
第三阶段近十几年来，由于分子生物学的发展而建立起来的用于
检测病原体核酸和蛋白质
的分子生物学技术，如核酸探针诊断技术及聚合酶链反应技术等，使病原体的鉴定不再局限
于其外部形态结构及生理特性等一般性质的检验上，而是站在分子水平的高度，检测病原体
内部的生物大分子(蛋白质、核酸)结构。这些新技术具有简便、快速、微量、特异等优点，
有着广阔的应用和发展前景。
以下就API鉴定系统及分子生物学技术作一简单介绍：
一API鉴定系统及其在微生物检验中的应用
长期以来，我国临床微生物学实验室一直沿用100多年前由革兰、巴斯德、科赫及皮特里等
创造的传统的细菌学鉴定方法。但在今天看来，传统的鉴定方法不仅过程繁琐，费时费力，
且在结果的判断上易发生主观片面，难以进行质量控制。随着微生物感染类型的改变，新型
病原菌的种、属不断增加，因此，临床上迫切需要建立快速、准确的细菌鉴定方法。
本世纪70年代诞生的微生物数码分类鉴定法集数学、电子、信息及自动分析技术于一体，
可将已知菌科鉴定到属、群、种和亚种或生物型，以根据不同来源的临床标本进行有针对性
的鉴定。该法目前已在世界范围内广泛应用，具有标准化、商品化、简易化、微量化、快速
化和系统化等优点。
在众多的细菌快速鉴定系统(API、Minitek、Enterotube、MicroID)之中，API(AnlyticP
roducts INc)系统是目前世界上应用最广、种类最多的系统。根据待鉴定的细菌种类的不同
，以及为满足快速鉴定药敏试验和研究工作的要求，API系统设计了不同的项目与底物组合
，可分为四类：
1快速鉴定系统；
2特定菌属(群)的鉴定系统；
3ATB(Automatic Testing Bacteriology)系统；
4用于研究细菌对糖的发酵、氧化和同化能力以及细菌所具有的酶谱。
使用生化反应谱索引时，必须先将生化反应所得阳性或阴性结果转换成数码，并与索引手册
中数码相比较。
编码的原则是将所有的20(或32)个生化反应，加上接触酶和3个形态特征，即是否产生芽胞
、革兰氏染色和菌体形态是否球状，从阳性到阴性的信息浓缩成一组数字。具体用法是每
三个反应为一组，每组内按其位置，第一位阳性为1，第二位阳性为2，第三位阳性为
4，阴性反应时均为0，每个组内数之和就可能为0、1、2、3、4、5、6、7。如此可将API系
列试验条测定，组成一个八位或十位的数字。其数值举例如下：
靛尿葡
基萄
质素糖〖〗甘乳蔗露醇糖糖〖〗麦水木芽杨糖素糖〖〗阿明七拉
伯叶糖胶灵〖〗甘纤甘维二露油糖糖〖〗松棉山三子梨
糖糖醇〖〗鼠海触李藻糖糖酶〖〗芽革细兰胞氏形染胞色态
①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④
- - +〖〗+ - -〖〗- - -〖〗- + -〖〗- + +〖〗+ - -〖〗- - -〖〗+ + -
〖〗〖〗〖〗〖〗〖〗
〖〗〖〗
4〖〗1〖〗0〖〗2〖〗6〖〗1〖〗0〖〗3
这株菌的数值编码为41026103，根据数值编码检索，即可查出此菌的菌
属和菌种名称，该菌为艰难梭菌。
从数值编码检索表中查出哪类群菌属种名称，同时根据鉴定概率(%id)对鉴定的可信度作出
评价：
%id≥99.9最佳的鉴定可信
%id99.0～99.8很好的鉴定
%id90.0～98.9好的鉴定
%id80.0～89.9可接受的鉴定
如果%id过低时，应按补充试验进一步鉴定。从数值编码检索表中查不出类群，可以考虑以
下可能：①编码的菌是极不典型的；②概率小，不能接受的鉴定；③可疑的鉴定或新种。
API试剂条由高质量透明塑料制成，便于观察结果，有20个小管式反应杯，内含干燥生化基
质液，常用的生化反应有五类：
1.发酵试验为碳水化合物与酸的分解代谢试验，反应结果通过pH
值的变化而引起指示剂颜色的改变。
2.同化试验将待测菌分别培养于含各种基质的培养基中，根据其
能否利用其中的单一碳水化合物作为碳源而得以生长以帮助鉴定，是一种生长试验。
3.同化或发酵抑制试验为生长抑制试验，待测菌如遇到对其有毒
的化合物就不能生长或不出现相应的反应，据此可帮助鉴定。
4.酶试验为分解某些合成底物的化学反应，如待测菌含有相应的
酶就可分解底物自发显色或经添加试剂后显色。
操作程序分准备、接种、观察并记录结果三个阶段。
一、准备
1.标本处理必要时使用运送培养基及进行细菌的分离培养等。
2.预试验如革兰氏染色、镜检等。
3.菌落的选择挑选可疑致病菌的特征性菌落。
二、接种
1.制备细菌悬液挑取1个或多个菌落按不同要求用蒸馏水或生理盐水制备细菌悬液。
2.接种的浓度根据试剂条的要求制备约1.5亿/ml的细菌悬液。
3.接种的体积有以下三种要求：(1)试验名称下无任何标记的小孔，加入细菌悬液至“半
满”，小管满而小杯空。(2)如试验名称加有方框，则加菌液至平满，小管和小杯皆满。(3)
如试验名称下有一条横线，表示需加液体石蜡，应加菌液至半满后在小杯内加液体石蜡。
三、观察及记录结果
接种后的API试条一般经35～37℃培养18～24小时可观察结果。观察方法有三种(见下表)：
1.自发反应可用肉眼直接观察颜色变化，多数试验属于此种；
2.需添加试剂的反应有些试验需添加不同的试剂后方出现颜色变化；
3.荧光反应有些试验需在紫外灯下观察荧光现象。
API20A生化反应表
测定〖〗底物〖〗反应/酶〖〗结果阴性〖〗阳性
Ind〖〗色氨酸〖〗吲哚产生〖〗加1滴二甲
苯到石蜡中混和，待2～3分钟，再加入1滴Ehr试剂。试验必需浮在二甲苯/石蜡油上。5分钟
之内读结果黄色〖〗红色
Ure〖〗尿素〖〗尿素酶〖〗黄—橙色〖〗红色
Glu〖〗葡萄糖〖〗〖〗溴甲酚紫
Man〖〗甘露醇
Lac〖〗乳糖
Sac〖〗蔗糖〖〗产酸〖〗紫色〖〗黄绿—黄色
Mal〖〗麦芽糖
Sal〖〗水杨素
Xyl〖〗木糖
Ara〖〗阿拉伯糖
Gel〖〗明胶〖〗水解(蛋白酶)〖〗无色素扩散〖〗有色素扩散
Esc〖〗七叶灵〖〗水解(β葡萄糖甙酶)〖〗紫外灯(365nm)黄色—荧光
〖
〗棕黑—无荧光
Gly〖〗甘油〖〗〖〗溴甲酚紫
Cel〖〗纤维二糖
Mne〖〗甘露糖
Mlz〖〗松三糖
Raf〖〗棉子糖〖〗产酸〖〗紫色〖〗黄绿—黄色
Sor〖〗山梨醇
Rha〖〗鼠李糖
Tre〖〗海藻糖
Gat〖〗〖〗触酶〖〗加2滴过氧化氢于甘露醇管，在空气中30分钟后〖〗〖〗〖〗无气泡〖〗有气泡
Spor〖〗〖〗芽胞〖〗无〖〗有
Gram〖〗〖〗革兰氏染色〖〗红色(阴性)〖〗紫色(阳性)
Cocc〖〗〖〗菌体形态〖〗杆状〖〗球状
观察后判断“+”及“-”并在报告单上记录结果，同化试验观察以有无细菌生长(混浊)作为
阳性/阴性判断标准。
二分子生物学技术
近年来，随着分子生物学的不断发展和各项新技术的广泛应用，有关微生物种属间亲缘关系
的分类鉴定工作，正从一般表型特征的鉴定深化为遗传特征的鉴定，技术上也从一般形态、
生理生化、血清学试验等提高到分子水平。目前用于微生物分类鉴定的分子生物学方法有：
DNA中鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)摩尔百分比(mol%)的测定、核酸分子杂交和PCR技术等。
1、细菌的DNAG+Cmol%的测定
G+Cmol%作为鉴别细菌种属间亲疏关系的一个重要遗传型特征，在细菌分类鉴定中的作用已
被公认，它有助于对表型(如形态、抗原抗体反应和理化特征)上难以区分的细菌作分类鉴定
，使分类鉴定依据由表现型向遗传型特征深化，并有助于分子水平上探索生物进化的亲缘关
系。
不同细菌DNA中的G+Cmol%是不同的，变化幅度宽(30～75%)，但同种细菌的G+Cmol%比较稳定
，不受菌龄影响，也不受突变因素之外的生长条件等各种外界因素的影响，所以G+Cmol%用
于细菌分类鉴定极有重要意义。
①G+Cmol%含量不同www.lindalemus.com的细菌，肯定是不同种的细菌；G+Cmol%含量相同的细菌，可能是相近的
种属，但也可能是不相同的细菌，需通过核酸杂交技术和表型特性确定。
②两株细菌的G+Cmol%含量差别在2%以内无意义；若差别有4～5%，可认为是同种内的不同菌
株；若差别在10～15%，可认为是不同属，甚至是不同科的细菌。
2、DNA限制性核酸内切酶图谱(指纹图)分析
限制性核酸内切酶能识别和切割双链DNA的特异部位，产生大小不同的片段，经凝胶电泳后
在凝胶上形成独特的DNA片段带谱。利用薄层扫描仪和计算机，比较不同微生物DNA的特征性
指纹，可以了解它们的同源程度。
如将核酸标记同位素后再行切割和电泳，通过放射自显影，就可在底片上出现不同的斑点，
构成指纹图，从而对病原体基因组的异同进行分析，最后做出鉴定。
因此，限制性核酸内切酶分析是一个重复性、稳定性、敏感性均很好的方法，可快速得到结
果，已成功地应用于病毒和细菌的鉴定分型。
3、核酸探针诊断技术
不同的生物体具有不同的DNA序列，同种生物体含有相同的DNA序列，并且核苷酸序列是相对
稳定的。DNA分子在一定条件下，可以解链成两条单链分子。因此，可以利用核苷酸序列互
补的原理，用特异的核酸探针，通过核酸杂交来检测和鉴定微生物。
核酸探针是指能识别特异碱基序列的，带有标记的一段单链DNA或RNA分子，也可以说是一段
与被测定的核苷酸序列(靶序列)互补的、带标记的单链核苷酸。标记物通常有放射性同位素
、生物素、地高辛等。常用的核酸探针技术有如下几种：
①斑点杂交法将待测的核酸直接点在硝酸纤维膜上，经加热或碱处理，使双链的DNA或RN
R解链，变成单链，然后用已知的探针进行杂交。如果待检的DNA与探针DNA是变性同源的，
便会按配对原则，复性成双链，将探针固定在滤膜上。最后根据标记方法的不同，进行不同
手段的检测。
②Southern印迹法DNA经内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳分离，然后转移到硝酸纤维素膜上
，再与标记的探针杂交及检测。
③Northern印迹法是将RNA混合物经凝胶电泳分离后，转移到DBM纤维素膜上，再与标记的
探针进行杂交和检测。
④原位杂交是用标记的核酸探针直接与组织切片的细胞或菌落进行特异的DNA或RNA杂交。
此法可保持细胞的基本形态，在完整的细胞上进行核酸杂交反应，有利于细胞内基因定位和
检测基因表达。
目前，核酸探针技术主要用于痢疾杆菌、霍乱弧菌、EB病毒、乙型肝炎病毒和艾滋病毒等常
规诊断。由于此法快速、简便、特异，且敏感性可达1～10pg的DNA水平，所以在快速诊断领
域中是主要竞争者，对于不易分离培养或大量培养增殖后有危险性的微生物标本，用核酸探
针技术进行检测更有着特殊的优越性。
4、聚合酶链反应(PCR)
聚合酶链反应又称“体外基因扩增”，是1985年由美国MullisKB等人首创的一项新技术，具
有快速、简便、灵敏、特异等特点，可在短短的几小时内将pg水平DNA中特定序列的单个拷
贝扩增到百万倍，从而为基因的检测工作提供了大量的基因材料。PCR已广泛应用于病原微
生物的检测、遗传性疾病的诊断等领域。
PCR原理是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，在试管内模仿体内DNA的复制，使复制过程
限定在一对人工外源加入的“引物”之间进行。这对引物是依据被扩增区DNA片段的两侧边
界DNA序列人工合成的，通常为20bp左右，每一引物与相对应的一条DNA链互补。人工合成的
两个引物决定了扩增DNA序列的特异性。PCR反应包括下述三个步骤：
①变性(denature)经加热后，DNA双链解离形成两条单链。
②退火(anneal)当反应温度降低时，两个引物分别结合到靶DNA的两个单链的3′末端。
③延伸(extension)在四种脱氧三磷酸核苷存在的条件下，由TaqDNA多聚酶催化，使引物
沿着模板DN
A的3′→5′方向延伸，以靶DNA链为模板合成一条新的双链DNA。新合成的DNA链经变性解离
后，又可作为模板，与剩余的引物结合，并在DNA聚合酶的催化下再次延伸，合成新的DNA链
。如此反复进行上述三个步骤，可使靶DNA片段呈指数性扩增。经20～40个循环，在
短短的几小时内，DNA序列可扩增百万倍。由于PCR的放大作用本身具有特异性，故扩增后的
DNA只要用电泳或简单的非同位素标记的探针即可检测出来，易于在临床推广应用。
目前，PCR技术已广泛应用于各种病原体的检测，用于发现一些不易分离培养的病原体，检
测一些不易获得的少量标本，如人体活检组织；或病原体含量较少的标本，如食器饮水标本
；还可用来研究肿瘤病毒在细胞基因整合状态和位置，用于研究病毒与肿瘤的关系等。随着
PCR技术的进一步完善，尤其是自动化的实现，必将给微生物诊断技术带来巨大的推动。
(龙北国张文炳赵卫罗军)
