医学蜱螨学-授课讲稿:第九章

第九章 新技术在医学蜱螨学中的应用　

第一节 蜱螨细胞的体外培养

一、蜱细胞的培养

（一)材料的选择

实验室人工饲养可获得大量健康、无病的蜱群。此外，应考虑下列因素：①处于发育阶段的蜱组织，其细胞处于有丝分裂阶段。②所选的蜱组织能提供大量细胞，并保证一定的接种密度。③选择初培养时不需要过繁操作的蜱组织。

目前常用于初培养的蜱组织包括：蜕皮前饱血若虫体内正在发育的成虫组织、虫卵和饱血雌虫的血淋巴。

（二)蜱表面灭菌

先将蜱放入0.5%家用漂白粉中浸泡，用蒸馏水冲洗数次，再在1:10的若考（Roccal)液中换洗2次，时间20min；再用70%乙醇洗1次；用灭菌蒸馏水洗2次。

（三)蜱组织的摘出及碎解

取已消毒好的若虫，用昆虫针固定于蜡层，置于灭菌的平皿内，用剪刀沿背缘剪开并去掉背板，用解剖针和镊子取出卵巢、输卵管及其体壁内膜，放在另一装灭菌生理盐水的平皿内，洗涤2次，再移入盛有培养液的小平皿中，吸出培养液，将聚在一起的蜱组织用灭菌PBS洗2次，加入一定量0.25%胰酶威尔逊液，将蜱组织剪碎，消化20~30 min，1500rpm离心10 min，弃上清，沉淀用PBS再洗一次同法离心，将沉淀用预先配好的应用液吹打混匀后，按1ml量分装于容积为5ml的小方瓶内，培养于28℃温箱内。

若用蜱卵进行初培养要比发育的成虫简便且快速。具体方法是：用镊子将消毒好的蜱卵在不锈钢沙网上碾碎，使细胞出来。所得混合物包括胚胎细胞、卵黄和卵壳的碎片。将上述混合物以1 500rpm离心10min，所得沉淀物明显分两层，上层呈奶油色，主要由胚胎细胞组成，下层呈深褐色，主要由卵壳组成。用吸管吸出上层混匀于营养液中，则得到含卵壳碎片很少的细胞悬液，然后进行培养。

（四)培养基

Leibovits（1963)设计的L-15培养基适用于各种蜱组织培养。若进行封闭培养，配好应用液后要加NaHCO₃。使用前还应添加灭活胎牛血清、胰蛋白磷酸盐肉汤、水解乳蛋白、酵母浸膏及青霉素、链霉素等，培养基的pH值6.5~7，常用6.8。

（五)初培养接种细胞的量

对初培养来说，接种蜱细胞量的比例按蜱材料数量来计算。接种细胞密度必须要大。接种细胞数量可依据形成细胞单层所需要的时间来判定。初培养后4周内形成单层，其接种数量较适宜。通常用雷登氏管接种1ml悬液；选用容积为5ml的小方瓶常接种1~2ml悬液。培养瓶容积与培养基容积之比为5:1~10:1为佳。

（六)换液及传代培养的注意事项

1、细胞开始贴壁到完全贴壁这段时间内，该培养瓶应尽量减少移动。

2、应在6~10d换培养液1次，换液时倒去一半旧液并以同容积的新液取代。

3、为缩短初培养的时限，应增加接种物的量，或者换用效果更好的培养基。

4、若细胞层致密不均匀，则可将其重新悬浮，并让其重新贴附于同一培养瓶内。

二、螨细胞的培养

目前常用于细胞培养的螨类主要是革螨及恙螨。

（一)细胞来源

革螨细胞：将野外捕获的革螨置于28℃生化培养箱内饲养，以发育为幼虫和若虫作为细胞培养材料。

恙螨细胞：将从鼠体自行爬下的饱食恙螨幼虫入饲养管于28℃生化培养箱中饲养。以饲养出的若虫、成虫、卵、子代幼虫作为螨细胞培养材料。

（二)方法

1、螨体消毒

将革螨、恙螨的幼虫、若虫置于70%乙醇消毒10min，弃去乙醇后，置含有效氯1%的次氯酸钠溶液作用2min，水洗后再用含0.05%氯化高汞的70%乙醇溶液消毒10min，水洗，在28℃环境中培养10h作用。

2、螨细胞原代培养

将培养10 h后的若虫及子代幼虫用眼科剪剪碎；每种螨加2ml pH7.2~7.4的0.75%胰蛋白酶，37℃消化30min，2000rpm离心15min，弃上清，将沉淀物悬于4ml 10%牛血清199培养液，反复吹打，直至螨组织块成絮状，再用10%牛血清199液离心洗涤3次。每种螨可得细胞悬液3 ml，接种于TC199（Gibco)培养液中，加0.4 %水解乳蛋白，15 %胎牛血清（FBS)，0.03 %谷氨酰胺，100 U/ml青、链霉素和适量18种非必需氨基酸，置pH6.8~7.2、28℃、5%CO₂环境中。每周半量换液培养。

3、传代培养

待细胞生长成单层后移去上层培养液，在“条件培养基”（即换液量与原液量各半) 中继续生长2~3d，刮下细胞层，用吸管吹打分散后传代。数代后，每周以1:2~4 分种率传代，同时作冻存试验。

第二节 同工酶技术在蜱螨学中的应用

一、同工酶技术

同工酶的定义：生物体内催化的化学反应相同，而分子结构、理化性质和免疫学性质不同的一类酶，被称为同工酶（Isoenzyme)。这类酶可以存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。

同工酶技术：是指运用同工酶分离及同工酶谱分析技术，对生物进化、遗传变异和疾病发生等进行研究，并为疾病诊断、治疗和控制提供依据的一项技术。

同工酶技术的原理

由于同工酶是生物体内天然的遗传标记。利用同工酶研究生物的遗传基因，已成为遗传学上的重要内容。同工酶是染色体上不同基因座位基因的表达产物，在生物的生长发育过程中，同工酶可以反映出基因如何表达，能较好地反映不同物种之间的遗传差异以及生物间种或株的基因特征和差异性，具有可靠的生理特性和物种遗传特征。当生物体在感染病害，受到损伤或在不良条件下都会发生同工酶的变化。

根据同工酶分子结构及免疫学性质等特点，目前用于同工酶分离技术的方法主要包括：电泳、层析、酶学及免疫学等方法，其中电泳法最为常用。

同工酶的染色方法有：原染色法、荧光染色法、放射染色法、电子传递染色法和酶连锁染色法。其原理是利用酶活性的特异性，在染色液中加入底物和酶活性所需的因子，通过酶促反应生成有色物，显示酶带，以便观察、记录和分析结果。

同工酶技术的应用

在生物学研究中，同工酶可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等；

在基础医学上，同工酶用于疾病的诊断和研究疾病发生（如肿瘤发生)等；

在临床医学上，一些同工酶被用作诊断指标，如冠心病及冠状动脉血栓引起的心肌受损患者血清中的LDH1（H4)及LDH2（MH3)含量增高，而肝细胞受损患者血清中LDH5（M4)增高。

二、同工酶技术在蜱螨学中的应用

同工酶技术因其敏感性高、特异性强、廉价而简便的特点，弥补了传统方法在种下亚分类方面的缺陷，能成功地区分形态上十分接近的种，并且还能精确阐明种以下各类群间、种间甚至属间的遗传分化程度，被用作蜱螨学分类研究及种类鉴定的重要工具之一。

1、酯酶同工酶

刘群红、张浩（2001)应用等电聚焦电泳（IEFE)方法研究腐食酪螨（Tyrophagus putrescentiae)和粉尘螨（Dermatophagoides farinae)的酯酶同工酶和蛋白质，并将两者进行了比较。结果显示，腐食酪螨的酯酶同工酶可见8条带，其中2条主带，而粉尘螨的酯酶有7条带，其中3条为主带，表明两种粉螨的酯酶同工酶及相关蛋白质的电泳谱可在一定程度上反映出科、属、种的差别，酯酶同工酶具多态性，可应用于螨种鉴定及遗传变异的探讨。

国内应用原盘电泳对5种革螨的酯酶同工酶、苹果酸脱氢酶同工酶和乳酸脱氢酶同工酶的研究表明不同种属革螨的同工酶谱具有明显的差别，具有重要的分类学意义。

俞小淙等（1991)应用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳技术（ IEF )对8种甲螨的酯酶同工酶酶谱进行研究发现，8种甲螨均具有特异的酯酶同工酶谱，表现在其酶带总数、酶带的排列、主带数及各主带的PI值存在差异，符合形态学分类结果。

2、α-磷酸甘油脱氢酶（α-GPDH )和谷草转氨酶（GOT)

Cicolani et al.（1981)在两种形态学特征不易区分的亲缘种革螨的标本中，发现α-磷酸甘油脱氢酶（α-GPDH )和谷草转氨酶（GOT)具有鉴定酶的性质，从而使所有的标本得到鉴定。

3、检测环境污染

俞小淙等（1992)还应用电泳技术检测汞、镉、铜以及有机氯等有害物质对秋田全大翼甲螨和滑菌甲螨酯酶同工酶的影响。结果表明，这几种有害物质对两种甲螨酯酶同工酶均有明显的抑制作用，且毒性物质的浓度与抑制程度有关。提示这两种甲螨可以作为一种指示生物以监测环境污染、保护人类健康。

三、同工酶技术的优缺点

优点：

① 能较好地反映不同种株间的遗传差异，具有可靠的生理特性和遗传特征；

② 同工酶的遗传和表达遵循遗传学的基本定律，便于遗传学研究；

③ 对同工酶资料进行遗传学计算，使蜱螨系统学和进化的研究有可度量的遗传学基础；

④ 同工酶是结构基因编码的直接产物，其作为基因的标志更直接地反映遗传信息；

⑤ 简便、易行，结果明确，可比性强。

局限性：

① 同工酶是基因表达的产物，是基因的生化表现型，而非基因本身；

② 实验中常用于同工酶分析的同工酶种类有限；

③ 所选同工酶的所有基因不一定都能表达在酶谱上；

④ 同工酶的变异不一定都和形态变异或生态适应性有关；

⑤ 实验中还可能会产生非遗传的或人为的酶带，干扰酶谱分析。

第三节 PCR技术在蜱螨学研究中的应用

一、PCR基本原理

PCR是一种在引物介导和耐热DNA酶催化下体外模拟天然DNA复制过程的酶促反应，包括高温变性、低温退火、适温延伸三个阶段，具有高度的特异性和敏感性。PCR采用了一对寡聚DNA作为引物，通过加温、变性-退火-DNA合成周期性多次循环，使目的DNA片段得到扩增。经过25~30个循环后，扩增倍数可达10⁶，理论上可检出样品中单一拷贝的DNA片段。

随着技术的发展，以PCR技术为基础，又不断涌现衍生许多新的相关技术，如反转录-PCR（RT-PCR)、锚式PCR（anchored PCR)、差异显示PCR（differential display PCR)、免疫PCR等。PCR-ELISA则是将PCR与核酸杂交、ELISA连为一体，用ELISA鉴定PCR产物。

二、基本PCR技术

PCR体系中的基本要素：

① DNA模板：可以是单链或双链，包括基因组DNA，质粒DNA。

② 一对寡聚DNA引物：分别与模板DNA链两侧的3’端序列互补，用于扩增两者间的DNA序列。

③ 耐热DNA聚合酶：通常是Taq DNA聚合酶或其类似物，可在高温下（72℃)催化DNA合成，并能在加热95℃时不失活。

④ 缓冲液：提供DNA合成反应所需pH、离子强度等环境。

⑤ 四种单核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，提供DNA合成的原料。

影响PCR主要因素：

MgCl₂浓度、循环次数、聚合酶稳定性、退火温度等。

三、PCR技术在蜱螨学研究中的应用

1、国外研究

Dean等（2001，2002)采用多位点取代扩增法研究Phytoseinlus persimilis生物学特性，证实其缺乏一种被称为CLO（Cytophage-like organism)样成分。

在研究变异革蜱Dermacentor variabilis诱导宿主最初免疫反应机制中，Ceraul等（2003)采用了RT-PCR从淋巴细胞中扩增出两条分别为624bp和225bp的基因片段，其中可编码一个含74个氨基酸残基的肽酶，该酶存在于昆虫和蜱体内。当宿主受其感染，可侵入宿主粒细胞，通常于15 min后产生分泌性蛋白，持续时间18 h，产生类似细菌感染导致的白细胞升高的结果。

Phytoseiid螨是一类可阻止瘟疫传播的有益螨，还可防止谷物霉变。由于该螨体积微小（通常<0.5mm)，肉眼难以识别。Jeyaprakash等（2002)提取多种螨DNA，先用普通PCR扩增，再有高保真PCR扩增线粒体12S rRNA特异性片段，很容易区别雌雄成卫生资格考试网虫、若虫、幼虫、卵的差异。

Lima等（2001)从Boophilus microplus cDNA文库中分离出GST的cDNA基因，利用RT-PCR检测蜱组织的GST和其幼虫mRNA表达水平，成功地进行了种间鉴定，具有较高的灵敏性。

2、国内研究

我国对蜱螨分子生物学研究较少。李朝品等较早利用PCR法体外扩增粉尘螨Der f 1、Der f 2 cDNA， 序列分析结果证实出淮南地区Der f 1 cDNA与国外粉尘螨Der f 1 cDNA序列存在一定差异，Der f 2 cDNA与国内粉尘螨Der f 2 cDNA存在一定差异，主要表现为缺失一约87bp的插入序列。

第四节 反义核酸技术在蜱螨学中的应用

反义核酸（Antisense oligonucleotide)是指能与特定mRNA精确互补、特异性阻断其翻译的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术。反义核酸技术是基因治疗技术的一种，是根据核酸杂交原理，设计针对特定靶序列的反义核酸，从而抑制特定基因的表达。20世纪80年代以来，反义核酸技术作为一种选择性序列特异性的基因表达抑制方法，已广泛用于病毒、肿瘤、心血管等疾病的治疗。

一、反义核酸的分类

反义核酸包括反义RNA、反义DNA及核酶（ribozyme)。

1、反义RNA

将能对结构基因表达起调节作用的RNA称为反义RNA。反义RNA的种类较多，作用机制复杂，常见的反义RNA见表9-1。

表9-1  原核细胞内天然存在的11种反义RNA

反义RNA按其作用机制可大致分为三大类：

Ⅰ类反义RNA：这类反义RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或编码区，引起翻译的直接抑制（ⅠA类)或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶Ⅲ的敏感性增加，使其降解（ⅠB类)。

Ⅱ类反义RNA：这类反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合，从而抑制靶mRNA的翻译功能。其作用机制尚不完全清楚，可能是反义RNA与靶mRNA的上游序列结合后会引起核糖体结合位点区域的二级结构发生改变，因而阻止了核糖体的结合。

Ⅲ类反义RNA：这类反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录。

反义RNA的构建和转染：反义RNA可以用化学法或酶法人工合成，也可利用重组DNA技术从反义表达载体中产生。载体可为病毒、质粒及脂质体。然后通过显微注射法或共转染法转染细胞，使特定基因表达。

2、反义DNA

又称反义寡核苷酸，是指一段能与特定的DNA或RNA以碱基互补配对的方式结合，并阻止其转录和翻译的短链脱氧核苷酸。

（1)反义DNA的作用机制：反义DNA在细胞质和细胞核中均能发挥作用。在细胞质中，反义DNA和mRNA形成杂交体阻断核糖体与mRNA结合，或促进RNA酶H定点切割RNA，阻止mRNA的翻译。反义DNA能穿过核膜，因此在细胞核中可与前体mRNA甚至和DNA上的互补序列结合，从而干扰转录剪接或成熟转录物质运输至细胞质。其他机制包括：与mRNA5’前导序列（从帽子至AUG起始密码子下游几个核苷酸)互补的反义DNA可以不依赖RNA酶H而抑制蛋白质合成；通过与引物竞争、cDNA延长终止，以及与聚合酶结合等抑制逆转录过程。

（2)反义DNA的构建和应用：人工构建的反义DNA大多经化学修饰，以硫代磷酸酯（PS)修饰的ODNs较多，可以防止核酸内切酶的作用。反义DNA进入细胞方法主要为胞饮作用。但PSODN等不易透过细胞膜，因此常通过脂质体包埋、胆酯共聚物、PEG共聚物等与其形成复合体利于细胞的摄取。

3、核酶

Cech等发现四膜虫核糖体RNA前体在成熟过程中，可精确地自我切除某些片段并重新连接，这种具有酶催化活性的RNA称为核酶。核酶是具有酶活性的RNA，主要参加RNA的加工与成熟。随着反义核酸技术的发展和成熟，已逐渐应用于抗某些人体寄生虫病的研究。

核酶广泛存在于生物细胞中，有锤头状和发夹二种结构。酶活性中心由两个臂和中间的功能区组成。两个臂序列高度保守，与靶RNA特异互补结合，相当于一种反义RNA，功能区则可通过降解RNA的磷酸二酯键而分解消化靶RNA，核酶本身在作用过程中并不消耗。核酶裂解分子依赖严格的空间结构形成，裂解部位总是位于靶RNA分子中GUX三联体（X：C、U、A)下游方向即3"端。

核酶可人工合成。根据核酶的作用位点、靶mRNA周围的序列和核酶本身高度保守序列，可方便地人工设计合成核酶的特异性序列。此外，利用基因工程将核酶的编码基因克隆在SP6或T7等启动子下游，通过转录合所需核酶。核酶能特异切割RNA分子，阻断基因表达，特别是阻断有害基因的表达成为可能。如果已知靶mRNA中GUX三联体的位置，可将核酶的编码基因插入反义表达载体的适当位置，这样转录所产生的含有核酶的反义RNA具有双重功能：一方面具有反义抑制作用，另一方面具有切割靶mRNA的催化作用。

二、反义核酸技术在蜱螨学中的应用

螨是引起过敏性哮喘的常见变应原，国内外均有报道反义核酸技术在哮喘中的应用。其作用分为以下七个方面：抗病毒，抑制炎性介质，抑制细胞因子的表达，抑制NF-кB的活性，抑制gob-5的表达，抑制哮喘速发型超敏反应，抑制胞内信号分子传递。

第五节 RNA干涉技术在蜱螨研究中的应用

一、RNA干扰的概念

RNA干扰（RNA interference, RNAi)是一种利用小分子双链RNA（double strain RNA, dsRNA)高效、特异的阻断体内特定基因表达或使其沉默，诱使细胞表现出特定基因表型缺失的技术。RNAi是一种典型的转录后基因调控方法，又被称为转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing，PTGS)。由于RNAi可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，曾被Science评为2001年度最重要的成果之一，而被形象地誉为基因敲低（knock down)或基因沉默（gene silencing)。

自Fire和Mell（1998)发现RNAi以来，已陆续证实植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、鼠、猴、人类的多种细胞中均存在该现象。因此，有学者猜想RNAi可能是生物界，包括植物和动物等普遍存在的一种古老、保守而又极其重要的遗传行为。

二、RNA干扰的机制

RNAi的确切机制尚不清楚，许多研究结果显示dsRNA通过干扰基因组DNA的甲基化、转录后水平降解mRNA及蛋白质的翻译等不同的机制对基因表达进行调控，从而诱导特定基因的沉默。

1、转录后基因沉默机制

外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式导入的dsRNA在细胞内被Dicer酶切割成约22nt的具有双链结构的小干涉RNA （small interfering RNA, siRNA)，这些siRNA具有5’磷酸、3’羟基末端以及两个游离核苷酸突出，这种结构在RNAi调控途径中起着关键性的作用。siRNA与核酶结合形成沉默复合物（RNA induce silencing complex, RICS)。随即RICS 中的siRNA在 Dicer酶解旋酶活性作用下开始解旋、解链，然后依靠siRNA反义链，通过碱基配对定位到同源mRNA上，此过程需ATP提供能量。部分结合到mRNA的单链siRNA充当引物，以mRNA为模板合成新的dsRNA，新合成的dsRNA仍可被Dicer酶切割而发挥调控作用；部分siRNA在其3’端下游12个碱基的位置由Dicer酶切割mRNA，切割后的mRNA由于没有5’帽状结构和Poly（A)尾巴的保护，很快被其它的核酸酶降解。

近来研究表明Dicer酶属于RNA酶Ⅲ家族成员，至少包含了四个结构域，即N-末端解旋酶结构域（依赖ATP酶活性)、PAZ结构域、双链RNA酶催化结构域及双链RNA结合结构域，能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的dsRNA。Dicer结构细微的变化即可导致切割间距的改变，表现为被切割成的siRNA长度发生改变，从而不能发挥RNAi作用或者表现出非特异性基因沉默。

2、翻译水平的调节机制

细胞内70nt的茎环结构或dsRNA前体转录物被Dicer/Argonaute复合物特异性识别后，降解成为成熟的大小为21nt、5’端为单磷酸基、3’端为羟基的单链小RNA分子，即小时序RNA（small temporal RNA, stRNA)或微RNA（micro RNA, miRNA)。stRNA与相关蛋白结合成另一种RISC复合体，可识别并结合靶序列的3’端非编译区（UTR)，抑制其翻译过程从而调控基因表达。

3、基因组DNA甲基化机制

在植物研究发现dsRNA可以影响基因组的甲基化修饰及改变染色体结构，从而调控基因的表达，为RNAi的机制带来了极大的补充。若外源基因以多拷贝形式整合到同一位点上形成正向或反向重复，甲基化酶可识别这些重复序列，引起这些基因位点医学检验网的甲基化。若甲基化发生在启动子则产生转录水平的基因沉默（transcriptional gene silencing, TGS)；如果发生在编码序列则产生PTGS。dsRNA还可通过细胞内一种名为Polycomb的蛋白质调节染色质构象的“开关”状态。在这一过程中，dsRNA或siRNA通过碱基互补首先与靶DNA序列结合，随后引导Polycomb复合体与邻近序列结合，靶基因随即沉默，这一效应可在细胞分裂后传至下一代。

三、RNA干扰的特点

dsRNA介导的RNA干扰具有以下特点：

1、RNAi具有高度特异性

对某些特定目的基因的dsRNA转入细胞内仅能使该基因的mRNA发生特异性降解，特异性阻抑该内源基因的功能。

2、RNA干涉抑制基因的表达具有高效性

低浓度的dsRNA可以产生强烈的阻抑效应。研究表明每个细胞内只要有几分子的dsRNA就能作用于高丰度的内源性mRNA分子，阻抑靶基因的功能。

3、干涉作用的广泛性

在部分生物中，siRNA分子能通过细胞膜、细胞间和组织屏障被转运，从而使得RNA干扰作用广泛。例如在线虫小肠中微注射稀释的dsRNA分子，在线虫小肠以外的其它组织也产生对靶基因的阻抑效应；如果用含表达目的基因dsRNA载体的大肠杆菌喂养线虫，在体细胞、生殖细胞等中都产生dsRNA介导的RNA干扰在美丽线虫中RNA干扰不仅发生在亲代动物本身，还发生在子代动物中。

4、与传统的研究基因的方法如基因敲除、诱变等技术相比，RNAi技术具有简单、快速、省时、省力等特点。

四、RNA干扰在蜱螨研究中的应用现状和前景

在寄生虫学领域，RNAi技术主要集中在对秀丽新杆线虫 （Caenorhabitis elegans)基因功能的研究，目前人们已应用RNAi技术成功的阐明该线虫至少1/3的基因的功能。

RNAi技术在医学蜱螨学应用领域，仍是方兴未艾，自Sukanya N成功的运用dsRNA阻断Ixodes scapilaris唾液腺抗凝血酶Salp14基因的表达，证明该技术可以应用于蜱螨的研究以来，RNAi技术仅被应用于Amblyomma americanum 唾液腺相关蛋白v-SNARs基因和组胺酸结合蛋白HBP基因的研究，RNAi技术应用于医学螨类的研究至今仍未见报道。将RNAi技术应用于蜱螨研究目前遇到的挑战是蜱、螨基因组的提取及其cDNA文库的建立和在体外连续培养、传代大多数寄生蜱螨。相信随着分子生物学、基因工程技术的发展，以dsRNA为基础的RNAi技术将大大推动蜱螨的基因组学的研究，还有可能设计出RNAi芯片，高通量地筛选药物作用靶基因，逐个检测蜱、螨基因的表达抑制情况来明确基因的功能，并且它还将在关键蛋白质在蜱和螨发病机制中的重要作用，防止蜱螨在人群中的传播、基因治疗等领域推动医学蜱螨学的发展。

第六节 噬菌体表面呈现技术在蜱螨研究中的应用

噬菌体表面呈现技术（Phage display technology, PDT)是利用在改造的噬菌体外壳蛋白质基因PⅢ或PⅧ区引入外源基因，以融合形式表达外源肽或蛋白，使其随着噬菌体的组装而呈现在噬菌体表面，保持特定的空间构象，并通过免疫亲和吸附法筛选特异性肽或蛋白的一项新技术。

在蜱螨变应原研究方面，可以利用噬菌体表面呈现技术建立各种属蜱螨的噬菌体cDNA文库，并进行文库的筛选和抗原蛋白的鉴定。Eriksson TL等曾利用噬菌体表面呈现技术构建尘螨Lepidoglyphus destructor的cDNA表达文库并对新的抗原进行了筛选，分离、鉴定了L. destructor的三种新变应原。

噬菌体表面呈现技术极大地推动了抗体工程的发展，为在体外模拟免疫系统的抗原选择和抗体多样化过程，进而筛选高特异性、高亲和力的基因工程抗体提供了技术支持，噬菌体抗体技术已被广泛用于构建筛选特异性单链、单区或更小片段抗体。

利用噬菌体表面呈现技术，将抗体分子片段基因与外壳蛋白基因（基因Ⅲ或基因Ⅷ)连接，构建表达性基因文库，即为噬菌体抗体展示文库（phage antibody display repertoire)，经筛选可获得特异性抗体基因，噬菌体抗体库的构建大致分为以下几步：

1、噬菌体抗体的构建

抗体Fab和ScFv（单链抗体可变区基因片段)均可在噬菌体中表达，并呈现在噬菌体表面。在Fab表达呈现时，可将L链基因和Fd段基因构建于一个载体上，转染大肠杆菌。Fd段或L链基因与噬菌体外壳蛋白基因（基因Ⅲ或基因Ⅷ)相连，融合蛋白锚定在细菌细胞内膜上，与另一条链（游离状态)结合可形成抗原结合特异性的抗体。在ScFv表达时，利用PCR技术和DNA接头（linker)，可将L链和H链的V区基因随机重组在一起，再克隆到载体中去表达ScFv抗体分子片段（ScFv基因与基因Ⅲ或Ⅷ连接)，并呈现在噬菌体表面利于筛选。将特异性抗原固相化，用文库的噬菌体与其反应，经过洗涤，洗脱，收获和纯化表达特异性抗体的噬菌体。

2、噬菌体抗体的表达载体

用于噬菌体抗体表达的载体包括噬菌体载体和噬粒（phagemid)。将抗体片段基因与野生型噬菌体基因Ⅲ的5端连接，可表达与蛋白Ⅲ基因的N端融合的抗体片段分子，呈现在噬菌体的表面。噬粒是含噬菌体基因间隔区的质粒载体，本身不含噬菌体蛋白编码基因，在导入大肠杆菌后不产生子代噬菌体。当用辅助噬菌体感染时，辅助噬菌体编码的噬菌体蛋白，可将单链噬粒DNA包装成噬菌体病毒颗粒释放出来，其外壳蛋白呈现抗体分子片段，同时含有gp3和gp8，并能再次感染大肠杆菌而繁殖。噬粒具有质粒特性，带有抗药性基因和复制起点，便于筛选含目的片段的克隆和在大肠杆菌内的扩增。

3、噬菌体抗体分子的亲和力成熟

同模拟体内B细胞经抗原多次刺激后产生的抗体亲和力增加一样，由于抗体基因库的容量大，基因的随机组合及CDR区的碱基突变（可采取PCR错配、随机突变等)，可获取高亲和力的抗体基因片段。

4、抗体分子基因片段的可溶性表达

在噬菌体抗体呈现中，抗体分子片段在融合蛋白的N端呈游离状态，可正确的折叠，形成具有功能的蛋白分子。如果抗体片段基因和外壳蛋白基因（Ⅲ或Ⅷ)间放置amber终止密码子（TAG)，则在不带琥珀抑制基因（amber suppressor)的宿主菌中，TAG为终止密码子，合成的抗体分子蛋白多肽穿过细胞内膜，以可溶蛋白的形式分泌表达；而在带有琥珀抑制基因的宿主菌中，合成的抗体分子多肽以融合蛋白的形式锚定在细菌膜上。

构建噬菌体抗体库可以绕过杂交瘤途径来制备单克隆抗体，这既可以免去制备免疫性抗原和免疫小鼠的繁琐，又能克服异源抗体，杂交瘤融合率低、稳定性差、抗体产量低的缺点，而且筛选的抗体目的性强。但有关蜱螨的免疫抗体文库尚未见有报道。

此外，噬菌体表面呈现技术可在分子水平研究抗原、抗体之间作用的特点，尤其是IgE与变应原之间的相互作用。也可用于蜱螨源性变态反应患者体内IgE水平的研究。

第七节 蜱螨的分子系统学

生物系统学（systematics)是研究生物多样性以及它们中间的任何一个类群和其他类群的各种关系的科学。系统学研究是建立在分类学基础之上的，而对生物进行分类是人类认识生物世界的第一步。60 年代开始，新的系统发生、数据逐渐积累，计算机硬件和软件的建立使系统发生学取得了长足的进步，特别是蛋白质、核酸分子结构检测方法和生物信息技术方法的迅猛发展，给生物系统学注入了新鲜的活力。从物种的进化到高级分类单元的相互关系，从种群的个体变异到近缘种的鉴定，大量的分子生物学技术越来越多地应用于生物系统学研究的各个层次，这样就产生了一门新的学科——分子系统学（molecular systematics)。

一、定义及其发展历史

分子系统学是通过检测生物大分子包含的遗传信息，定量地描述、分析这些信息在分类、系统发育和进化上的意义，从而在分子水平上解释生物的遗传多样性、系统发育及进化规律的一门学科。它以分子生物学、系统学、遗传学、分类学和进化论为理论基础，以分子生物学、生物化学和仪器分析技术的最新发展为研究手段，是一门交叉性很强的学科。

其发展历史根据研究方法的发展大致可分为三个阶段：

第一阶段：20 世纪50～60 年代, 分子系统学的研究主要在蛋白质的水平。主要研究方法是传统的免疫学方法（血清学鉴定)和60 年代中期出现的酶电泳技术。

第二阶段：酶电泳技术在20世纪70年代成为分子系统学的热点技术，并在脊椎动物亲缘关系的研究上取得了一定成果。同时分子系统学研究随着DNA分子结构的研究进入了核酸水平时期，早期的技术有核型分析、带型分析、荧光原位杂交、染色体原位隐藏杂交、细胞分型、脉冲场梯度交变电泳等，70 年代末期，mtDNA的限制性片段长度多态性技术开始在脊椎动物和无脊椎动物的种群结构研究中应用, 并逐渐成为动物分子系统学研究的有力工具。

第三阶段：80 年代以来, 以PCR和Southern 杂交为基础发展了一系列衍生技术, 如限制性片段长度多态性技术（restriction fragment length polymorphism, RFLP)、PCR-RFLP、DNA指纹图谱技术（DNA fingerprinting, DNAfp)和随机扩增多态性DNA 技术（randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)等, 近几年来又发展了微卫星DNA 指纹图谱技术（mircoDNA fingerprinting)、基因芯片技术（gene chip)及核酸序列测定技术（gene sequencing)等, 使分子系统学在DNA水平的研究飞速发展并取得了大量的显著成果。

二、分子系统学研究的一般步骤和实验技术

1、研究步骤

分子系统学的主要研究步骤包括：① 标本的收集，包括标本与模式标本、已有标本和新标本；② 选择可取、合适的分子分类手段对标本进行分析；③ 选择合适的数据模型和分析方法分析所得到的数据，建立符合物种发育关系的系统树（phylogenetic tree)，并进行检验校正；④ 结合形态学分类等传统方法，确定该物种的分类地位和亲缘关系。

2、研究手段

分子系统学研究可应用分子生物学、生物化学及仪器分析等多种技术手段。限于篇幅，这里仅介绍近年来发展迅速的蛋白质分子系统学和核酸分子系统学技术。

三、分子系统学实验技术及在蜱螨学研究中的应用

（一)蛋白质的分子系统学

20 世纪60 年代，蛋白质分子系统学研究以组织匀浆液中可溶性蛋白质的免疫学方法为主。以后又发展了纯蛋白的微量补体技术。70 年代产生了单克隆抗体技术，使免疫（血清)系统学方法更加准确可靠。70～80年代主要以等位酶基因电泳为主，以后蛋白质序列和立体结构数据也用于系统学研究中。到目前为止,蛋白质分子系统学研究方法可归为四类:免疫学（血清学) 方法、电泳方法、一级结构分析方法和立体结构分析方法。

1、免疫学（血清学)方法

血清系统学（Systematic Serology)是应用抗体、抗原反应研究蛋白质之间或有机体之间进化关系的学科。20世纪五六十年代应用于系统学较多的是传统的血清学反应，即凝集反应（agglutination)、沉淀反应（precipitation)、补体结合反应（complement fixation reaction)和中和反应（neutralization)。七十年代以来微量补体固定技术和免疫标记技术大量的应用于系统学研究的各个层次和领域，其中应用最为广泛的应属酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)及基于ELISA的一系列衍生实验技术。

2、酶电泳技术

60年代中期酶电泳技术开始应用于分子系统学研究，随后在昆虫的分类和进化研究中广泛应用。同工酶和等位酶电泳技术通过分析酶的电泳谱带可间接达到在基因水平上研究遗传变异的目的, 同工酶和等位酶是应用最多的两类酶。由于等位酶谱带与等位基因之间关系更加明确, 因而以等位酶电泳的应用更为广泛。

酶电泳分析步骤可分为蛋白质的提取、分离、染色、解释和应用。得到的蛋白质必须在-70℃温度下保存，但即使在这样的温度条件下，一些蛋白质也会在数月内降解。可用于酶检测的电泳主要有淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和醋酸纤维素膜电泳等。多数研究表明，改变电泳条件能检测出更多的变异。

酶电泳方法的优点：可以在相对短的时间内检测出大量样本中许多座位上的遗传变异，在种群水平上检测遗传变异快速有效，仪器设备简单，方便节省，较短时间的预电泳和反应材料的长生命周期。缺点：可利用的遗传位点数量较小，只能检测编码酶蛋白的基因位点，对非编码基因的变异则无能为力；同时, 密码子同义突变的广泛存在使之无法检测全部的DNA变异，因而低估遗传变异水平，而且等位基因位点易受选择压力的影响，进一步降低了它用于估计遗传变异的精确性，因而用等位酶数据实现系统发育重建说服力较弱。

3、蛋白质一级结构分析

不同种属生物的功能相同的蛋白质分子，其一级结构有种属差异，差异的大小反映了种属之间的亲缘关系和蛋白质分子进化的规律。在这些蛋白质的一级结构中，有一些位置上的氨基酸残基不因种属来源的不同而改变，即在进化过程中始终保持不变。利用蛋白质一级结构进行分子系统学的研究极有意义，根据其序列建系统树有两大优点，即蛋白质中位点变化的规律可用经验模型描述（如最著名的Dayhoff 模型)，物种间无明显的氨基酸偏爱性。但是，蛋白质测序工作较困难、费用高，现已逐渐有被核酸测序所代替。依据一级结构进行蜱螨分子进化和分类的研究至今尚未见报道。

4、蛋白质立体结构分析

蛋白质的立体结构是指蛋白质在一级结构基础上，经过空间盘旋折叠成为具有生物活性和功能的大分子。生物大分子的功能主要是在其三维结构上体现的，分子间的相互作用也依赖于三维结构及其附近的环境，而且由于同源生物大分子的三维结构比其一级结构更具保守性。例如，来自不同种属的细胞色素C，它有的可能在一级结构上差异大，但在三维结构上其主链构象却是相同的。通过比较生物大分子的立体结构特征来推断生物类群之间的系统发育，可以得到一些在仅用一级结构来进行研究时所不可能得到的有意义的信息和结果。Bajaj等（1984)通过对蛋白质三级结构的比较研究表明，在细菌和哺乳动物的丝氨酸蛋白酶中，除Ser195、Ser 214、His 57、Asp 102 和Asp 194 这几个位点上的氨基酸外，其余位于活性部位的所有氨基酸都是保守的，且其中有5个甘氨酸残基和2个半胱氨酸残基是不变的。

5. 质谱分析

质谱分析（mass spectrometry)包括质谱检测、软件程序分析及数据库检索。质谱分析可以对蛋白质的分子量进行准确测定，通过数据库检索，质谱分析可以比较被检蛋白的多肽质谱与数据库中蛋白的多肽质谱，并以此为根据对被检蛋白进行鉴定。而且，质谱分析还可检测到蛋白消化后形成的多肽的氨基酸序列，再通过数据库检索对蛋白进行鉴定。质谱分析所获得的蛋白氨基酸序列是对蛋白进行鉴定的最准确而有效的手段。

此方法是将蛋白质用双向电泳（two-dimensional electrophoresis)从混合样本中分离出来，进行染色，目前主要的染色方法有金属银染色、金属锌负染色（negative zinc imidazole staining)、考马斯蓝染色（coomassie blue staining)等，然后用质谱仪检测，计算出差异蛋白，进行鉴定。

目前质谱分析主要应用于蛋白质组学研究，由于其耗资大，费时多，操作复杂，至今还未应用于分子系统学的研究，相信随着技术的不断进步，不久的将来必将成为分子系统学研究的有力工具。

（二)核酸的分子系统学研究

　　根据核酸（DNA 和RNA)结构进行分子系统学研究开始于70年代。最早是测定基因组大小[（G+ C)%含量] 和基因组DNA2DNA（RNA)杂交等。1979年RFLP开始应用于分子系统学研究，1980美国学者Botstein发现DNA限制性酶切片段长度多态性（RFLP)可作为遗传标记。1985年PCR 技术和DNAfp 的出现，扩展了分子系统学的方法和对象。90年代，RAPD2PCR、AFLP、微卫星和小卫星DNA的DNAfp及DNA序列分析技术成为分子系统学的主要方法。

1、限制性片段长度多态性技术分析

限制性片段长度多态性技术分析是80年代中期发展起来的一种DNA多态分析技术，它将目标DNA序列经一定数目和种类的限制性内切酶（RE)进行酶切, 由于不同的目标DNA 的序列结构（遗传信息)有差异，RE 在其上的识别位点的数目和距离就发生了改变，因而产生相当多的大小不等的DNA 片段。然后通过Southern 杂交可以把与被标记DNA 相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱（较简单的靶序列，如mtDNA 可以省却杂交直接用电泳方法检测)，进行系统进化和亲缘关系的分析。

RFLP 分析数据多态信息量大，结果稳定可靠，重复性好，不受环境及物种发育阶段影响，呈孟德尔遗传，可以有效区分纯合子和杂合子，而且非等位的RFLP标记不存在上位效应，只要有探针就可检测出不同物种或个体的同源DNA分子的RFLP，对于物种间亲缘关系的研究特别有用。但RFLP技术对样品纯度要求较高，当样品很少时要结合应用PCR扩增，探针的制备很费功夫，标准方法必需先构建cDNA文库并筛选出可用作探针DNA序列，技术路线复杂，而且杂交中存在放射性安全问题, 不宜为一般的实验室所采用。另外，它无法检测靶序列中的重复序列区，态性检测水平过分依赖于所选用的RE的种类和数目，由于不同的RE识别位点的进化速率不同，因而，对于不同的进化靶序列，如果选样不当就会导致分析结果出现偏差。

目前在分子系统学中用于RFLP分析的靶序列主要是基因组DNA和线粒体DNA（mtDNA)，其中mtDNA是系统进化研究的一个强有力的工具，尤其是动物线粒体。因为它的碱基替换速率相对较快，而且高效的单倍体遗传和母系遗传方式减小了检测时的有效种群大小（effective population size)，提高了遗传漂移的敏感性，是目前分子系统学上最佳的靶序列。

2、微卫星DNA指纹图谱技术

微卫星DNA也称简单串联重复序列（simple sequence repeat, SSR)，在所有真核生物基因组中随机分布，由于重复次数和程度的不同使所在的基因座位呈现一定的多态性。微卫星DNA 的重复在基因组的进化中起着非常重要的作用，因而，被认为是遗传信息含量最高的遗传标记，并日益成为基因组分析和分子进化分析最普遍的工具。在分子系统学研究中，可以利用某个微卫星DNA两端的保守序列设计探针，同基因组DNA杂交或通过PCR 扩增产物，然后对通过放射自显影得到的杂交信号进行分析，得到标记的探针杂交检测微卫星DNA 的变异。

微卫星DNA在基因组中多态性高，并且等位基因数目多，呈共显性遗传，其指纹图谱有极高的多态性，结果稳定可靠，重复性好，适用于任何真核生物的系统进化研究。但是，微卫星座位突变机率高，对变异反应极其灵敏，所以易受到趋同变异引起的平行演化（homoplasy)程度（size)的影响，从而给物种间亲缘关系的评估带来误差；此外，这一技术耗时较长，花费较大，并存在着放射性安全的问题，而且只能检测那些已知序列的微卫星DNA。

3、随机扩增多态性DNA的聚合酶链式反应

随机扩增多态性DNA的聚合酶链式反应（Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)技术是在PCR技术的基础上建立起来的，以一系列随机合成的寡核甘酸单链为引物进行聚合酶链式反应。RAPD在寄生虫的分类鉴定上应用较广泛，尤其对传统分类学方法难以解决的问题更加适用。以一个随机引物对生物标本进行PCR扩增，每个标本都能扩增出一些DNA片段，其中有些片段为种特异，且为种内所有个体所共有，有些片段则为某些个体所特有。而用不同的引物扩增同一标本，即使引物中一个碱基对的差异也将导致全套扩增产物带型的完全改变，所以可用RAPD技术可对蜱螨的种、株型及种群进行鉴定区分。

杨银书等选取3条不同的随机排列碱基顺序的多聚核苷酸单链为引物（P、P6、P7)进行RAPD-PCR扩增反应，并对这7种硬蜱的DNA多态性进行分析。结果显示7种硬蜱分别扩增出不同数量与不同分子质量的DNA片段，有些硬蜱DNA扩增产物中具有相同的DNA条带，反映出它们的基因组DNA具有同源性；同时又具有各自独特的DNA条带，且DNA条带的亮度也有差异。被扩增出的7种蜱的DNA片段既表现为种特异性，又反映了种的同源性，因此，RAPD技术可以准确地区分这 7种蜱。刘运喜等采用聚合酶链反应/限制性片段长度多态性分析（PCR/RFLP)技术对恙虫病东方体山东分离株、小盾纤恙螨匀浆及恙虫病病人全血中提取的DNA Sta56基因进行分析，并与Nested PCR基因分型的结果进行比较，来鉴定山东地区恙虫病东方体的基因型。结果山东地区恙虫病东方体流行株主要基因型与日本地方株Kawasaki型类似,但与日本地方株存在遗传差异；同时还有Karp型Ot存在。采用PCR/RFLP方法可以准确对Ot-Sta56基因分型。

Tonya等以线粒体细胞色素ｂ（Cyt b)和核糖体rRNA基因的内部转录空间ITS1作为种群目标分子标记位点，采用SSCP-PCR技术对黑脚硬蜱的种群结构进行了分析。结果在Cytｂ位点上共发现7个单倍基因型，在ITS1位点上共发现13个基因型，沿美国东海岸分布的黑脚硬蜱隶属于两个不同的南北种群。

RAPD的优点是简便快速，在24小时内可完成全部实验；无需贵重仪器;需样量少，特别适于微小型昆虫；可扩增干制或固定标本；应用多种引物可进行高级阶元间比较；与RFLP技术结合可进行快速序列分析。尽管诸如RAPD等分子标记技术在寄生虫分类中有较广泛的应用，但这些技术还存在一些不足，如 RAPD标记为显性分子标记，不能区分纯合子及杂合子；而且结果重复性较差，各实验室资料缺乏可比性。但如果进行实验条件的优化和标准化，这些不足可以克服。

4、扩增片段长度多态性

扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymophism, AFLP)技术是由VOS. P 和Zebeau M等将RFLP 分析法和PCR法结合起来发展的一种新的基因组DNA 多态性分析技术。该技术将得到的DNA样品先进行PCR扩增，然后有RE酶切，电泳。与RFLP相比最大的优点是：所需的DNA 量少，不需Southern 杂交，实验结果稳定,重复性较好,表现孟德尔遗传，每个AFLP反应可以检测的位点50～100个,多态性强,适宜于遗传多样性分析、种质鉴定、分子系统学研究。

5、基因芯片技术

基因芯片（Gene chip)又称 DNA芯片、DNA微阵列（DNA microarray)，是将大量的 DNA片段按预先设计的排列方式固化在载体表面如硅片、玻片，并以此为探针，在一定的条件下，与样品中待测的靶基因片段杂交，通过检测杂交后的信号，实现对靶基因信息的快速检测。基因芯片可以分为很多种类，常见并广泛应用的有cDNA微阵列和寡核苷酸原位合成。目前，基因芯片技术的应用领域主要有：基因表达谱分析、新基因的发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和分型、药物筛选、基因测序等。

国内基因芯片技术在蜱螨学中的应用主要为恙螨媒性传染病的检测和分型等，根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列，设计群特异性引物及探针，制备寡核苷酸芯片，用Cy3标记的引物，利用不对称PCR技术扩增DNA片段，将扩增的DNA片段与芯片上的探针杂交，用荧光扫描仪检测并分析信号，建立了特异、灵敏、快速检测恙虫病东方体标准株DNA的基因芯片检测技术。崔红等以16 SrDNA为对象，设计并合成4条寡核苷酸探针，利用微阵列技术构建立克次体检测用生物芯片技术，建立了一种能在未知标本中快速检测 6种立克次体的方法，对伯氏考克斯体、汉氏巴尔通体、恙虫病东方体可以将其鉴定到种或属。朱进等根据汉坦病毒属（HV)76-118株和R22株S基因核苷酸序列，设计引物和探针，制备寡核苷酸芯片，能够检测出汉坦病毒HTS型和SEO型病毒核酸的特异性荧光信号；同时与疟原虫、钩端螺旋体、恙虫病东方体、大肠杆菌O157、霍乱弧菌、血吸虫等6种病原体的特异性探针对照，可快速鉴定出7种病原体。

国外基因芯片技术在蜱螨学中的应用较多。Revel等采用DNA微阵列技术研究莱姆病病原伯氏疏螺旋体在不同宿主和环境条件下的基因表达，螺旋体生活状态不同，其基因的表达也不尽相同，微阵列技术可为伯氏疏螺旋体的生活史假设提供可检测的依据。Heishi等用螨抽提物接种NC/Nga小鼠获得遗传性过敏性皮炎（AD)模型，并用寡聚核苷酸阵列分析其基因，结果表明此模型可用于阐明AD的发病机制并可为AD的治疗提供有效的模型。

基因芯片技术有其显著的特点。其一，基因芯片能对微量样品中的核酸序列进行检测和分析，其高通量、快速、并行化采集生物信息的特点更是优于其他传统的技术方法。第二，基因芯片技术以一种系统、整体的方法进行研究，打破了“一种疾病、一种基因”的陈旧模式，整体宏观的研究生物体基因的表达及功能。

基因芯片技术仍存在很多的问题，如核酸杂交反应的特异度与检测灵敏度不够理想、制作方法复杂、样品处理繁琐、标记过程耗时以及价格昂贵难以普及等。另外，基因芯片上的基因是已知，但很多基因的功能目前尚未研究清楚，有时尽管知道某基因的表达发生了变化，但无法知道这种变化的生理和病理学意义。基因表达终极结果是产生相应的蛋白质和酶，才能实现其各项生理功能，但基因与蛋白质功能并非完全平行，因此基因芯片技术还需要与其他检测蛋白质和酶的实验方法相结合。

5、DNA 的序列分析

核酸序列分析是指通过测定核酸序列来比较同源分子之间的相互关系的方法。比较不同类群个体的同源的核酸的核苷酸序列，据此建立分子系统发育树，并推断类群间的演化关系，是目前分子进化和系统发育研究的热点。DNA 序列分析可以保证使某一区段每个核苷酸位置上出现的变异都被发现。

直接测定DNA 序列可以测出所有的DNA 变异，从而获得最为准确的遗传信息，但是这一技术耗资较大，目前DNA 样品制备技术和DNA序列图象的获得及数据分析方法都不十分理想，序列数据本身存在的多重替换问题、协同进化问题和序列进化速率的变异等问题以及数据分析中的序列对准方法的不足都使得它目前的应用受到一定的影响。

6、核酸分子标记的几种方法比较

在几种核酸分子标记方法中只有RFLP和DNA指纹图谱能够提供杂合子的带型，即共显性遗传，而其它的分子标记如RAPD-PCR、AFLP为显性遗传，不能显现杂合子。RFLP方法优点是稳定性高，重复性高，但需用放射性探针检测，耗资较大。另外，RFLP需要的DNA 量较大（较RAPD 方法而言)，多态性出现率低，只能检测内切酶识别位点上的变异，能提供的信息有限。原位杂交的优点是准确直观，在用整个基因组DNA或基因组特异重复序列作探针时，可以明显区分不同物种的染色体组成，在鉴定远缘杂种染色体构型和结构变异，物种起源演化方面有重要作用。但原位杂交技术复杂，对操作要求较高。RAPD技术的特点：可以在对物种没有任何分子生物学了解的情况下对物种的基因组进行DNA片段多态性分析，并结合其他方法，通过统计分析，确定其在系统演化中和分类中的地位；RAPD 技术的引物种类很多，可以对整个基因组进行地毯式多态分析，两个基因组之间的微小差异也能被反应出来；RAPD技术所需材料的量很少，便于对大量的小型昆虫进行研究；RAPD技术不需大型仪器，操作较方便，可以在一般实验室开展。AFLP技术的特点是：所需的DNA量少，不需Southern杂交，实验结果稳定可靠，重复性强，每个AFLP反应可以检测的位点多达50～00个，多态性强，非常适宜于遗传多样性分析、种质鉴定、分子系统学研究,但实验条件要求严格，耗资大。核酸序列分析在系统发育分析中有独特的优势，能够检测出基因组的插入、缺失、点突变和转座。

近年来测序与PCR及RFLP技术相结合，可以快速经济地测量大量个体，是今后有发展前途的方法。现有的研究结果表明，每个基因均能以其自身特有的平均进化速率，可用于不同水平的系统发育研究；不同基因间的进化速率不同，同一基因不同区段的核苷酸的保守程度也不一样，这种保守性与编码蛋白质或RNA的二级结构有关。快速进化的基因或核苷酸区段（如mtDNA、rRNA的IGS 区域) 适合于种内或近缘种的系统发育分析；慢速进化的基因（如rDNA及其产物rRNA)适合于远缘种类或高级阶元的系统发育。

7、基因打靶技术

基因打靶（gene targeting)通常是指用含已知序列的 DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源 DNA导入技术。基因打靶的技术要点如下：基因打靶载体的构建，把目的基因和调控序列等与内源靶序列同源的序列都重组到带标记基因的载体上；打靶载体的导入，用电穿孔和显微注射等方法将打靶载体导入受体细胞内；同源重组子的筛选，用选择性培养基筛选打靶重组阳性细胞；将重组阳性细胞转入动物胚胎，产生转基因动物，并进行性状观察和分子生物学检测。基因打靶技术在寄生虫学研究中有如下应用：寄生虫基因功能的研究、抗寄生虫药物的研究、抗寄生虫免疫的研究和抗寄生虫疫苗的研究。

基因打靶有如下特点：基因打靶能把外源基因引入染色体DNA的特定片断上，在设计合理的情况下基因打靶可对宿主细胞染色体基因进行精细的改造；基因打靶后被击中的基因或新引入的基因随染色体DNA的复制而稳定复制。基因打靶也还存在着不足，表现为打靶命中率低；外源基因导入细胞核内的难度比较大；易受非同源重组随机插入的干扰；靶细胞染色体如有缺失，则在缺失部分打靶是无效的。

第八节 蜱螨的基因组和蛋白质组学研究

一、蜱螨基因组学研究

随着人类基因组计划（HGP)的开展，人体寄生虫基因组研究也受到了广泛的重视，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析（Serial analysis of gene expression, SAGE)等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，从DNA-mRNA-蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控（Transcriptional control)，翻译水平调控（Translational control)，翻译后水平调控（Post-translational control)，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。1993年美国人类基因组研究中心对 HGP作了修订，修订后的HGP将模式生物基因组列入了HGP的内容，认为通过对较为简单的模式生物基因组的研究，可为人类基因的功能鉴定提供线索，并可从简单的基因组分析入手建立技术积累经验。人体寄生虫是一类结构较简单的单细胞生物如原虫或多细胞生物如蠕虫，是研究模式生物较理想的材料。因此，人体寄生虫基因组计划也已成为人类基因组计划中模式生物基因组研究重要内容之一。

所谓基因组计划是指对某个生物体的全部基因进行核苷酸测序，在了解全基因的基础上，研究每个基因或数个基因间相互作用和功能。人体寄生虫基因组计划的主要内容包括基因的发现（gene discovery)、基因作图（gene mapping)、基因的功能分析或称功能基因组学（functional genomics)和生物信息学（bioinformatics)研究等。其中，基因序列测定和新基因的发现是人体寄生虫基因组计划的首要任务。常用的基因序列有两种来源：（1)基因组序列扫描（GSSs)标签，由漂浮基因组序列产生（或随机克隆或人工细菌染色体末端序列)；（2)表达序列标签（ESTs)，由来自寄生虫生活史的一个或多个阶段的mRNA表达产生。

现今世界范围内不少重要寄生虫基因组已在研究之中，包括恶性疟原虫、曼氏血吸虫、克氏锥虫、布氏锥虫、利什曼原虫、艾美球虫、弓形虫、隐孢子虫、溶组织内阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫、日本血吸虫、马来丝虫及其它致病线虫等。从最初阶段网络系统的建立、作图、资源的建库，测序工作以基因发现为开端，很快发展到小片段染色体，现在则是整个成熟基因组阶段，蛋白质组学、功能分析、基因操作及微阵列分析都在不同的水平上进行。

国外蜱螨基因组中以蜱的基因组研究较多，特别是传播重要虫媒病的蜱种，尤以线粒体基因组为多，详细信息可从常见文献检索网站如Pubmed等上查询。国内蜱螨基因组的研究主要在功能基因组分析，如李朝品、杨庆贵等研究粉尘螨Ⅰ、Ⅱ类抗原（Der f1、Der f2)的cDNA克隆序列之间的差异。

二、蜱螨蛋白质组学研究

蛋白质组学（Proteomics)是近5年来发展起来的，2001年的Science杂志已把蛋白质组学列为六大研究热点之一。在后基因组时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。

1、蛋白质组学研究的策略和范围

蛋白质组学研究有两种策略。一种可称为“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质，这种观点从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，也更符合蛋白质组学的本质。但是，由于蛋白质表达随空间和时间不断变化，要分析生物体内所有的蛋白质是一个难以实现的目标。另一种策略可称为“功能法”，即研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。

2、蛋白质组学研究技术

蛋白质研究技术是一项复杂而又困难的技术。不仅氨基酸残基种类远多于核苷酸残基（20/4)，而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰，如糖基化和磷酸化等。蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，往往要同时处理成千上万种蛋白质。因此，发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。当前在国际蛋白质组研究技术平台的技术基础和发展趋势有以下几个方面：

利用蛋白质的等电点和分子量通过双向凝胶电泳的方法将各种蛋白质区分开来是一种很有效的手段。它在蛋白质组分离技术中起到了关键作用。如何提高双向凝胶电泳的分离容量、灵敏度和分辨率以及对蛋白质差异表达的准确检测是目前双向凝胶电泳技术发展的关键问题。国外的主要趋势有第一维电泳采用窄pH梯度胶分离以及开发与双向凝胶电泳相结合的高灵敏度蛋白质染色技术，如新型的荧光染色技术。

质谱技术是目前蛋白质组研究中发展最快，也最具活力和潜力的技术。它通过测定蛋白质的质量来判别蛋白质的种类。当前蛋白质组研究的核心技术就是双向凝胶电泳－质谱技术，即通过双向凝胶电泳将蛋白质分离，然后利用质谱对蛋白质逐一进行鉴定。对于蛋白质鉴定而言，高通量、高灵敏度和高精度是三个关键指标。一般的质谱技术难以将三者合一，而最近发展的质谱技术可以同时达到以上三个要求，从而实现对蛋白质准确和大规模的鉴定。

目前，二维色谱（2D-LC)、二维毛细管电泳（2D-CE)、液相色谱-毛细管电泳（LC-CE)等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。另一方面以质谱技术为核心，开发质谱鸟枪法（Shot-gun)、毛细管电泳-质谱联用（CE-MS)等新策略直接鉴定全蛋白质组混合酶解产物。随着对大规模蛋白质相互作用研究的重视，发展高通量和高精度的蛋白质相互作用检测技术也被科学家所关注。此外，蛋白质芯片的发展也十分迅速，并已经在临床诊断中得到应用。

3、蜱螨蛋白质组的研究进展

蜱螨蛋白质组的研究尚处于起步阶段，研究内容较少。Madden RD等（2004)用蛋白质组学的方法分析蜱的唾液分泌物，蜱的唾液是一类含有生物活性分子的复杂混合物，这些混合物包括能够调节宿主反应以利于扁虱进食的蛋白质。由于蜱的唾液获得量有限，因此用传统的蛋白质化学方法分析唾液中的蛋白受到了阻碍。最近，在二维凝胶电泳、质谱分析、以及生物信息学方面取得的一些进步，为分析少量蛋白质样本提供新的工具。用这些方法分析了取自花蜱美国种和斑点种唾液中的蛋白质。通过注射多巴胺和茶碱诱导蜱分泌唾液。在用二维凝胶电泳分析唾液中的蛋白质之前，必须现对唾液进行脱盐浓缩。比较一维和二维凝胶电泳图，发现唾液中的主要构成蛋白并没有在二维凝胶电泳中出现。通过对唾液中的这种主要构成蛋白进行分析，发现这种蛋白与两种蜱血淋巴中的主要构成蛋白是相同的。虽然两种蜱唾液的一维和二维凝胶电泳获得的蛋白轮廓相似，但是在A maculatum 的电泳图中出现了高浓度的低分子量蛋白。MALDI-TOF质谱分析和western blot分析表明，在两种蜱唾液中除了含量最丰富的分子量为95 kDa的蛋白外，其余探测到的所有蛋白均和宿主具有同源性。

Lai R等（2004)联合应用差别表达基因负向抑制杂交法和蛋白质组学两种方法从花蜱Hebraeum种的硬蜱中的血淋巴中鉴定出两种非阳离子防卫素样的抗菌肽，命名为花蜱防卫素肽1和花蜱防卫素肽2。从蜱的synganglia（中枢神经系统)的差别表达cDNA文库中分离出编码这两种防卫素样抗菌肽的每个cDNA克隆。从每个cDNA序列推导出预期蛋白含有92个氨基酸残基。从已进食过的雌蜱的血淋巴中纯化出花蜱防卫素肽2。纯化的肽显示了针对革兰氏染色阴性和阳性细菌的抗菌活性。花蜱防卫素肽1则进一步通过使用蛋白晶片捕获装置来鉴定。这种装置主要是由SELDI-TOF（表面增强激光解吸/离子化飞行时间)MS。通过对差别表达蛋白的筛选，发现在进食后的4天内，花蜱防卫素肽1的表达是正调节的。此发现首次提供了两种防卫素样的抗菌肽和相应的cDNA序列，这些抗菌肽在阴离子领域是特别新颖的。同时，对于研究差别表达蛋白特别是对于那些无法获得基因组序列信息的机体，负向抑制杂交和蛋白轮廓的联合应用是一种有效的方法。