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医学蜱螨学-授课讲稿:第四章下

医学蜱螨学:授课讲稿 第四章下:第七节 恙螨控制恙螨在我国分布广泛, 不但是恙虫病的传播媒介, 而且还可能传播出血热病毒等其他病原体。因此恙螨控制对防止恙虫病等虫媒病具有重要意义。目前恙螨的控制主要通过消灭鼠类、杀灭恙螨、清除孳生环境等方面综合措施根除孳生地,结合个人集体防护等,以达到控制恙螨,控制恙虫病的目的。一、灭鼠鼠是恙螨幼虫的主要宿主,又是恙虫病的传染源, 消灭鼠类是防治恙虫病的根本方法。其一是在恙螨的生活史的七个阶段中

第七节 恙螨控制

恙螨在我国分布广泛, 不但是恙虫病的传播媒介, 而且还可能传播出血热病毒等其他病原体。因此恙螨控制对防止恙虫病等虫媒病具有重要意义。目前恙螨的控制主要通过消灭鼠类、杀灭恙螨、清除孳生环境等方面综合措施根除孳生地,结合个人集体防护等,以达到控制恙螨,控制恙虫病的目的。

一、灭鼠

鼠是恙螨幼虫的主要宿主,又是恙虫病的传染源, 消灭鼠类是防治恙虫病的根本方法。其一是在恙螨的生活史的七个阶段中,恙螨未食幼虫必须在动物体上吸食,才能继续发育,而鼠类是恙螨幼虫最喜欢的宿主。 没有机会叮咬吸食动物宿主的恙螨幼虫,最终因饥饿死亡; 其二是媒介恙螨体内之所以不间断地携带恙虫病东方体,特别是经过恙虫病东方体在恙螨体内消失一定时间和代数后,恙螨叮咬携带恙虫病东方体的鼠类是又可以重新获得感染,使恙虫病东方体在恙螨体内能长期维持和代代传递,以致恙虫病例不断出现。因此,消灭鼠类是切断恙虫病流行的一个重要环节。灭鼠是消灭恙螨的一项根本性措施。  

二、清除恙螨滋生环境

通过改变恙螨的生长环境来控制恙螨种群的数量。根据恙螨的生态习性因地致宜进行。如定期大搞环境卫生,铲除杂草和去除乱砖堆。恙螨在野外主要孳生在杂草丛中,根据某地铲草经验,铲去杂草和表面浮土,恙螨数量大大降低。清除乱砖堆,也可减少恙螨的孳生。在居民点内,通过修建下水道、开沟渠、填土等方法降低恙螨孳生地所在的地下水位;清除垃圾杂物、瓦砾等; 或锄松表层泥土,铺平后压实,最好加一层黄泥或砂石压实,改变遮荫情况,使地面的蒸发加快,破坏恙螨的孳生地。在野外建筑永久或临时房屋时,可用翻土机翻土,再用压路机压实,达到全部消灭孳生地的目的。不能用这种方法处理的种植地带,尤其是耕作地的边缘地带,应常改变环境,如开垦种植,精耕细作,消灭所有的荒地和半荒地, 以达到消灭恙螨孳生地的目的。

三、药物杀螨

药物杀螨的方法,费用较大,困难较多,效果也并不一致。二十世纪50年代使用的杀螨剂和其它昆虫的杀虫剂种类一样。在恙虫病流行区,曾大面积使用0.5%丙体六六六粉剂,有一定效果。用0.5%丙体六六六粉剂喷洒草地证明持续时间较长,有效杀螨期可达20d,控制恙螨繁殖达40d。疫区处理时,可用0.5~1.0%敌敌畏溶液定期喷洒铺草、地板和房顶之稻草,或用6%六六六1.2克/平方米杀灭恙螨,效果良好。此外,还必须保持室内干燥和清洁。在人们经常活动的场所,喷洒敌百虫等,有较好的灭螨效果。  

由于昆虫螨类对上述杀虫剂产生抗药性,杀虫剂种类不断更新, 特别是对人畜毒性大,化学性质不稳定,残效期短,成本高,或对环境污染严重的杀虫剂,不能广泛大量应用。因而不断发展出新型杀虫剂。人工合成除虫菊、植物性杀虫剂等研究增多。目前已生产使用的拟除虫菊酯类杀虫剂,杀虫作用强,快速,对人畜安全,残效较长,成为有发展前途的一类新型杀虫剂。昆虫生长调节剂如保幼激素和发育抑制剂等,还处于试验阶段。 有些地区采用燃烧草地的方法,使地面的潮湿情况暂时改变,不利于恙螨孳生,以达到控制恙螨的目的。

四、个人防护和集体防护

个人防护和集体防护虽然比较麻烦,但容易实施,效果较好。

1. 个人防护  是指在疫区野外作业者使用防护剂和防护措施,以防恙螨幼虫叮咬。具体方法包括:①如在疫区杂草丛生的野外工作、宿营时,要求做到扎紧裤管、袖口和领口;用三角巾包扎头部和面部,防止恙螨幼虫侵袭人体。②不要坐卧草地上,不在杂草丛中坐卧休息,工作时脱下的衣服不要放在草丛上。穿驱虫剂浸泡过的衣服,防恙螨侵袭效果好。早期使用石油油精肥皂和硫磺配置成浸泡液,后使用丁基苯二酸或苯二甲酸二丁酯或苯二甲酸二甲酯,安息香酸甲苯,二苯基乙二酮或水杨酸二甲噻吩酯;近年也试用溴氰菊酯浸泡衣服防螨侵袭。③外露皮肤亦可涂擦驱虫剂和驱避剂等,防螨叮咬。在皮肤裸露部位涂擦邻苯二甲酸二甲脂,苯甲酸苄酯等,防螨侵袭。

在有条件的地方,野外作业后,应立即洗澡和换洗衣服,或用过的衣服立即加以烫熨处理,以杀灭隐蔽在衣服缝隙中恙螨幼虫。  

2. 集体防护  集体活动如在疫区野外宿营或野外作业,必须首先清除地面杂草,最好加以焚烧。营区周围挖防鼠沟并喷洒药物建立防护带,尽量做到睡高铺,防螨叮咬,避免集体性的恙虫病爆发。

第八节 研究技术

一、流行病学调查

(一)恙螨种类调查  以啮齿动物和食虫动物为调查的主要宿主,一般调查的对象为鼠类,为使调查资料能作为流行病学分析的科学依据,对调查鼠体上恙螨种类和数量的准确性,采集恙螨应做到:①捕获活鼠,保证收集到的恙螨种类和数的准确性。②检集恙螨的鼠体部位有耳窝内、耳壳上、耳背基部、肛门、生殖器附近、胸部、后腿、鼻腔内和鼻周围等,做到不漏检部位。③恙螨种类的鉴定包括初步鉴定即在双目解剖镜下根据成堆的活恙螨幼虫体色和外形等初步鉴定属种。进一步鉴定是用贝氏制片液制作l~2片玻片标本,在酒精灯上慢慢加热使标本基本透明(或用饱和石碳酸溶液快速透明亦可),在显微镜下鉴定,证实解剖镜鉴定是否正确,做到捕获的鼠类当天就可分类计数登记。

(二)生态学调查  不同孳生地捕鼠或小鼠定点诱饵收回。检查鼠体的恙螨幼虫,分别记录不同类型孳生地的恙螨种类及数量;以鼠类为主的调查对象,捕获活鼠收集恙螨,可作种类的初步鉴定,计算每种鼠的带螨率和带螨指数来表示某种恙螨对宿主的选择性。计算方法如下:

带螨率=(带恙螨鼠数÷检查鼠总数)×100

带螨指数=(检获某种恙螭数÷检查鼠总数)×100

恙螨的季节分布是采用逐日或逐旬统计鼠体恙螨指数,求出消长曲线。常用每旬一次,用带螨率和带螨指数计算密度,观察季节消长;在恙螨幼虫密度高的地方,挖土15cm×15cm×5cm,连同地面的植物腐烂物质,放于有水的盆中,将土及腐植质在水中搅拌,成虫或若虫浮予水面,用毛笔挑出集中。

(三)流行病学调查

1. 分离恙螨幼虫体内的恙虫病东方体  从捕获的鼠类或其他动物宿主,将恙螭幼虫挑出(耳窝部位最多),幼虫分类分组后,以一定数量的恙螨幼虫用无菌生理盐水洗净,放入研磨器;加入含青霉素1000单位/ml,,链霉素1000ug/ml,的生理盐水1ml,研磨后放4℃冰箱4h,然后注入3只小鼠(BALB/c小鼠,3周龄)的腹腔。小鼠发病。解剖后取腹膜涂片,或腹水或肿大脾作涂片,Giemsa染色后镜检,发现典型恙虫病东方体则为阳性,进一步作血清学的鉴定。

分离恙螨幼虫的恙虫病东方体传统法多用集体恙螨接种,这样每组恙螨幼虫数多少而有差异,一般每组恙螨多者。分离东方体的阳性率也高,同样PCR法50个幼虫比10个幼虫的东方体DNA阳性亦越高。鉴于每组恙螨数不同,按组计算恙螨的自然感染方面,以恙螨最低感染率,分析恙螨的自然感染率更有意义。计算用:恙螨最低感染率=阳性组数÷检查恙螨总数;另外恙螨的饱食程度与恙虫病东方体分离阳性率也有关系,试验说明:传统法和PCR技术检测恙虫病东方体饱食坳的阳性率均比未进食幼虫高。

2. 恙虫病东方体经卵传递试验  恙螨一个生活周期中只有幼虫期寄生,而且叮咬饱食后不再叮咬,所以经卵传递是恙螨作为传播媒介的必要条件;或者经精胞传递,亦是由雌虫摄取雄虫产下地面的精胞间接受精,雌虫获得有恙虫病东方体的精胞后,最终也要经卵传递至子代,因此本试验包括经精胞传递,东方体经卵传递试验是流行病学调查不可缺少的工作。

3. 人群的调查  流行区病人的诊断,采用PCR技术。

二、恙虫病东方体分离技术

恙虫病东方体分离的标本有:①实验小鼠脾、血;②野外捕获的野鼠脾、血;③野鼠体上检获的恙螨幼虫等。鼠血(肝素抗凝,新鲜)0.3~0.5mL腹腔注射。鼠脾和恙螨幼虫各按需要量分别用无菌生理盐水洗净,分别放人研磨器,加入含青霉素1 000单位/ml,链霉素1000μg/ml的生理盐水lml,研磨后的脾悬液和幼虫悬液放4℃冰箱4h,然后各注入3只小鼠(BALB/C)的腹腔。鼠血、脾悬液和幼虫悬液注射的小鼠分别置特制的铁笼内饲养和观察,经一定时间小鼠发病,解剖腹膜涂片或脾作印片,Giemsa染色,镜检,发现典型的恙虫病东方体则为阳性,进一步作血清学的鉴定。如解剖的小鼠未查到东方体,传2代均阴性结果时,才算为阴性。

临床诊断的病原体分离:动物接种以小鼠(BALB/C上鼠,2周龄)最敏感。早期病人可取全血0.3~0.5ml(肝素抗凝)注入小鼠腹腔。接种后一般2周左右发病,如松毛、眼闭和有分泌物、呼吸急促、腹膨大、活动迟缓等,应立即进行解剖,可见皮下出血、两肺充血和水肿、肝脾和淋巴结充血肿大、并有胸水和腹水。取肝、脾和腹水等作涂片。Giemsa染色,镜检。阳性可见内皮细胞内的恙虫病东方体。东方体分布在脑、肝、脾和肾等器官都较高。诊断用的小鼠分离法。阳性率最高达80%,有弱毒株经多次传代的小鼠虽有脾肿大和腹水,但无症状,也不死亡,涂片也查不到东方体,应做免疫学试验。即取传代鼠脾制成悬液,稀释成不同浓度(10-1~10-5),接种于小鼠皮下进行免疫,4周后不死的鼠用已知恙虫病东方体毒株攻击。以一定浓度腹腔内注射,均出现很强的免疫力。如弱株接种的不鼠血、脾、腹水等标本可做PCR检测,该技术简便、快速、特异和敏感。

三、恙虫病东方体阳性恙螨模型的建立

(一)恙虫病东方体人工接种成虫法

1. 恙螨  经实验室纯系培养证实无东方体感染的地里纤恙螨,并连续传代饲养30代以上的成虫。培养和传代均按实验室常规方法。

2. 恙虫病东方体  纯化的Karp株,对BALB/C小鼠LD50为10-6~10-8  。

3. 东方体悬液的制备  小鼠(BALB/C)腹腔接种富含恙虫病东方体Karp株的鼠脾悬液(1:10)0.5ml,小鼠发病,活动迟缓,耸毛。眼分泌物多,濒死时解剖,每只鼠以30%蔗糖缓冲液3ml冲洗腹腔,取冲洗液离心5 000rpm/min,10min,4℃2h或室温15℃,离心10 000rpm/min,10min,取其沉淀加4倍量30%蔗糖缓冲液(含谷氨酰胺和1%牛血清白鬣白),即制成浓医学检验网缩东方体悬液,涂片,Giemsa染色.,平均每视野约20个东方体,置4℃冰箱当日接种。

4. 30%蔗糖缓冲液(pH7.0)配方  蔗糖0.218M×mw 342.30=74.6214mg;KH2PO4 0.0038M×mw l36.09=0.517mg;K2HPO4?3H 2O 0.0072M×mw 228.23 = 1.643mg;谷氨酰胺0.0049M×mw l46.15=0.716mg;蒸馏水1 000ml。若加入1%血清蛋白效果更好。过滤除菌后分装,置4℃冰箱保存备用。用于含东方体材料的洗涤,可保护东方体。

5. 接种“针”  用外径6~7mm的优质玻璃管,一端在酒精喷灯上拉成外径约1mm的细管,再将细管端在酒精灯细火焰上拉成极细的毛管尖头,用微量器定量,在细管壁上每1μl用细油性笔划记号一个。再在两刻度间分成四等份,即制成了接种“针”。在另一端装上橡胶滴头,接种时起着调控作用。

6. 恙螨接种与检测感染率  恙螨成虫置于滤纸片上,用底部装有吸人了乙醚的脱脂棉的青霉素瓶将虫罩住,等一定时问恙螨麻醉后,把瓶除去,已麻醉的成虫移置双目解剖镜下进行腹部接种,每虫接种东方体体悬液约0.1μl ,接种后的成虫置石膏炭粉管培养。接种的成虫用直、间接免疫荧光染色法和金银免疫染色法,加上透射电镜观察的检测其东方体感染率达41.2%以上;用PCR技术检测感染率高达92.3%.接种后的成虫4个月后其存活率为83.7%,成虫一年内能保持较好的生殖能力。经人工接种的恙虫病东方体Karp株,能在恙螨体内增殖长达360d以上,www.lindalemus.com并经卵传递至少4代子代。

(二)幼虫叮咬小鼠法  含恙虫病东方体的腹水0.5ml给小鼠腹腔注射,小鼠置铁笼饲养.于注射后约3周即小,鼠发病前2d,小鼠在乙醚麻醉下,挑取地里纤恙螨未食幼虫(孵出2~3d)约200只,叮咬病鼠耳,48h后挑取出饱食蚴,置炭粉管内25±1℃培养,取出饱食蚴后,即解剖病小鼠,腹膜涂片,Giemsa染色,镜检东方体。

四、免疫学技术检测恙虫病东方体

(一)直接免疫荧光染色  取一定量需检测的恙螨标本(成虫、或卵、或幼虫、或蛹)置经处理干净的玻片上,虫体在玻片的要求位置,分别在双目解剖镜下压出内容物,涂片,刎除外骨骼和卵壳,风扇吹干;室温、四氯化碳固定10min,风干;滴加荧光标记MeAb(如采用标记单克隆抗恙虫病东方体Karp株抗体…等)。置垫有湿纱布的具盖托盘内,37℃孵育30min;0.05M pH7.4 PBS浸洗三次,每次3min,蒸馏水浸泡1~2min脱水,风干,用90%甘油缓冲液封片,镜检。使用多功能大视野荧光显微镜观察。出现特异性颗粒状荧光为阳性,无特异性荧光为阴性。对照组为非感染的纯系恙螨。

(二)间接免疫荧光染色  采用羊抗IgG荧光标记抗体,用0.02%伊文思兰-PBS液稀释成1:2。

1. 免疫恙虫病东方体Karp株抗体的制备  每次取高含恙虫病东方体Karp株的鼠脾悬液(1:10)2ml,腹腔接种新西兰白兔,共5次,每次间隔一周,末次注射一周后试血,经IFA测定滴度>1:64时心脏穿刺放血。分离血清经56℃,30rain水浴灭活.分装存于-21℃,为兔抗恙虫病东方体Karp株免疫血清。本法的制片和固定同直接免疫荧光染色。兔抗恙虫病东方体用0.01M pH7.4 PBS稀释成1:64使用,羊抗兔IgG荧光抗体用,0.02%伊文思兰-PBS液稀释成1:2使用。

(三)免疫金银染色  羊抗兔IgG胶体金标记抗体(SARG)有生物制品标准产品。按IGSS间接法步骤进行。取受检恙螨(成虫或幼虫或、卵或蛹等),成虫或幼虫用乙醚麻醉致死.置玻片上,在双目解剖镜下压出内容物,涂片,刎除外骨骼,风干;室温,四氯化碳固定10min,风干,0.02M Tris-HCl缓冲液(TBS pH8.2)湿滴,1:10正常羊血清5min;1:64兔抗恙虫病东方体Karp株抗体,室温8h,1:10正常羊血清5min, SARG 1:10,室温8h;0.02M TBs浸洗三次,双蒸水洗三次,枸橼酸缓冲液浸洗5min,物理显微影30min(暗室操作),枸橼酸缓冲液浸洗5min,双蒸水洗三次,苏木素衬染2min,自来水洗,风干, 油镜观察。出现特异性棕黑色颗粒为阳性,无特异性颗粒为阴性。对照组为非感染的纯系恙螨。

五、分子生物学技术

(一)恙虫病东方体DNA的提取

1. 标本:恙螨蒸馏水浸泡2h,中间换水1次,洗净恙螨置于研磨器,加适量的TE液研磨成悬液备用。

2. 鼠血、脾和腹水组织标本:实验室恙虫病东方体感染鼠发病后或野外捕获野鼠处死解剖后,分别取鼠血、脾和腹水标本。①鼠血:一般眼球放血,采全血,用肝素抗凝(或采样是将血直接置于肝素管); 血块标本则加TE液适量研磨备用。②脾或其他组织:脾组织加蔗糖缓冲液(SPG)磨碎,取少量用于提取DNA, 其余置-80℃冻存。

3. 腹水及腹腔冲洗液:蔗糖缓冲液冲洗腹腔,吸取腹水,2000rpm,15min离心,沉淀加适量TE混悬,备用。

4. 人血标本的处理:同鼠血标本处理。  

(二)恙虫病东方体的PCR检测

聚合酶链反应技术应用于恙虫病东方体研究是恙虫病研究的一个突破,它为研究恙螨和动物宿主体内恙虫病东方体的动态变化与流行规律等研究提供有效的方法。作者等曾用免疫荧光、免疫金银等检测恙螨体内的东方体,其阳性率为41%,而用PCR技术检测恙螨体内恙虫病东方体的阳性率则在90%以上。

1. 恙虫病东方体的PCR检测

(1)Sta58引物:根据恙虫病东方体Sta58基因编码区序列合成的引物如下:

Primer 1  5’ —ACTACTGCTACAGTTATAGC—3’;

Primer 2  5’ —GAGTAAGAGCTTCTCCGTC—3’。扩增片段987bp。

(2)PCR反应体系:10×PCR buffer 5μl,dNTPs(2mM)5μl,primer 1和primer 2各1μl,Taq E (1U/μl) 2μl,Rt-DNA 5μl,ddH2O39μl,反应体积为50μl。

2. 恙虫病东方体NPCR检测

根据恙虫病东方体Sta56基因编码区序列设计合成群引物如下:

Rt34  5’—TTGCTAGTCCAATGTCTGC—3"

Rt55  5’—CCCTGCTGCTGTGCTTGCTGCG—3"

Rt10  5’—CCGAATTCATGCCTGAGCCTACTATAATGCC—3"

Rt11  5’—CGGGATCCTTAGACAGATGCACTATTAGGC—3"

3. 核酸杂交检测PCR产物

用核酸杂交法检测PCR产物具有比电泳检测PCR产物,单纯核酸杂交法更高的敏感性和特异性,据实验室敏感性和特异性的比较,PCR结合核酸杂交法比NPCR法敏感10倍,比Sta58引物PCR敏感100倍,比核酸杂交敏感1000倍,但需时较长,不适合于做临床诊断。但一次可处理较多标本,可用于恙虫病流行病学研究。

4. NPCR检测恙虫病东方体流行株型

根据恙虫病东方体主要表面蛋白Sta56基因编码区序列设计合成恙虫病东方体型特异引物序列如下:

Karp株(KP):  5’--GCTTCGAAACAATATGGGATTTATAACC--3’

Gilliam株(G):  5’--CTTTATATCACTATATATCTT-3’

Kato株(KT):  5’--GAATATTTAATAGCAATGGA--3’

Kawasaki株(KW):  5’--ATGCTGCTATTGATACAGCC--3’

Kuroki株(KR):  5’--CACCGGATTTACCATCATAT--3"

经实验室检测证实,Karp株、Gillism株、Kato株、Kuroki株和Kawasaki株特异性引物对仅扩增各相应的分离株,对其它株则无扩增。 KP和引物Rt10扩增后产物为230bp多核苷酸;G和引物Rt10扩增后产物为407bp多核苷酸; KT和引物Rt10扩增后产物为242bp多核苷酸; KW和引物Rt11扩增后产物为523bp多核苷酸; KR和引物Rt10扩增后产物为220bp多核苷酸。 

六、恙螨的培养和传代

恙螨的实验室培养是从事媒介恙螨和恙虫病病原体及传病机制等科研工作的基础,恙螨培养需要适宜的培养基, 温度、湿度以及食物和宿主,目前一般采用石膏碳粉管培养法。

1. 培养所需的材料  石膏、碳粉、无底厚玻璃圆筒(高6.5cm,外径3cm)、光照培养箱、解剖镜、蚤卵、小鼠等

2. 石膏碳粉培养管的制作  在无底厚玻璃圆筒的一端倒入已调好的石膏浆,厚度约为0.3~0.5mm,凝固后倾入已加少些水的混合碳粉石膏粉(碳粉石膏粉的比例为3:1或9:1),将碳粉石膏粉压实制成0.5~1.0mm的厚度,再在玻璃筒的另一端紧塞以适当大小的包裹绸布的胶塞即可。为防培养基生长霉菌,在制培养管前碳粉石膏粉需高温消毒;或在碳粉石膏粉中加入0.01%硫酸汞,亦可达到防止霉菌生长。

3. 培养所需的温度和湿度  恙螨生活史各阶段在发育生长过程中,喜在温暖、潮湿,可在13℃~35℃生长发育,适宜温度为18℃~28℃,最适宜温度为23℃~28℃。湿度为80%~100%;中山医科大学寄生虫学教研室恙虫病媒介室在长期的培养恙螨的实验室温度为25±1℃,湿度为80%~100%。

4. 培养所需的动物宿主  恙螨的生活史包括七个时期,卵、次卵、幼虫、若蛹、若虫、成蛹和成虫。其中幼虫期必须行寄生生活才能进入到下一阶段的发育。因此,在实验室培养时,需要动物宿主供恙螨度过寄生阶段。恙螨对宿主的选择不是很严格,包括哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类及节肢动物等。同一种的恙螨幼虫可寄生在多种动物宿主体上。在实验室进行恙螨培养时,小白鼠是首选的动物宿主,常选用3周龄、无东方体感染纯系健康的BALB/C小鼠。

5. 实验室常规恙螨培养和传代  野鼠体上检获的恙螨饱食幼虫或孳生地捕获的成虫或若虫,或实验室恙螨未食幼虫叮咬小鼠后检获的饱食幼虫,置碳粉石膏粉培养管培养,密度以每管不超过30个恙螨为好。恙螨移入培养管后,沿管壁滴加入水分,或管竖在盛有清水(水深约0.5cm)的搪瓷盆或玻璃皿中,使石膏层和碳粉层潮湿,保持管内湿度80%~100%。将培养管置于25±1℃的光照培养箱中培养,一般隔天往石膏碳粉管中加水一次以保持湿度。同时定时移去管塞,在显微镜或解剖镜下观察培养的恙螨,清除培养管中霉菌等污物,并饲以新鲜蚤卵。

食物是培养恙螨的关键。恙螨的食性较复杂,对食物有一定的选择性。多数恙螨喜欢动物性食物,尤其是小节肢动物卵和早期幼虫,包括同种和异种的恙螨卵和蛹。国外曾报告用蚊卵饲养印度囊棒恙螨获得成功。中山医科大学寄生虫学教研室恙虫病媒室在培养地里纤恙螨过程中,发现地里纤恙螨在饥饿时可吸食蚊卵或其他昆虫卵,但效果并不理想。用蚊卵喂食的恙螨,一般发育迟缓,寿命较短,产卵极少且成活率低,有的甚至不产卵;用新鲜蚤卵喂饲的地里纤恙螨则生长发育良好,产卵孵出的幼虫健康,成活率高且幼虫数量多。故实验室均喜选用新鲜蚤卵作为培养恙螨的食物。

在实验室培养过程中,恙螨在成蛹羽化变成成虫约1周后,雌虫就开始产卵。由于恙螨的幼虫必须要在宿主体上寄生吸食才能继续发育,因此,当发现培养管中恙螨卵孵化出幼虫时,需要把幼虫用解剖针移至盛水的培养碟,以备叮咬宿主。目前实验室均用自动叮咬宿主吸食法使幼虫吸食。一般先将选择的宿主动物(小白鼠)用乙醚麻醉,用解剖针将预先准备的浮于水面上的恙螨未食蚴移置鼠耳壳内,同时用放大镜或解剖镜观察,如有幼虫爬出小鼠耳壳外,需重新将其挑入耳窝,等幼虫全部叮咬稳后,稍等片刻便把小白鼠放回铁丝鼠笼,再将该笼置于带水的搪瓷盆上,一般48h后,恙螨幼虫已吸饱,麻醉小鼠,检获饱食幼虫。置石膏碳粉管培养。

6. 纯系恙螨的培养和传代  由于科研工作的需要,有时要求恙螨是单一品系的培养。单一品系的恙螨必须通过纯系恙螨培养才能获得。纯系培养是从一对雌雄成虫开始,连续传代培养多代后获得纯系品种。

恙螨培养至成蛹后,每个成蛹单独分管培养,等羽化为成虫,鉴别性别后,进行配对。每一培养管放置1对雌雄成虫培养,培养方法按常规。雌虫产卵孵出幼虫后,使未食幼虫叮咬纯系健康的BALB/C小鼠,48h后幼虫饱食,麻醉小鼠挑出饱食蚴,置干净的石膏碳粉管继续培养,经若蛹、若虫、成蛹和成虫,产卵孵出幼虫,再行叮咬传代培养,不断重复传代,至25代以上就可以获得大量的纯系恙螨,供科研工作调用。

七、恙螨标本的采集

(一)动物宿主体上采集恙螨幼虫  野外捕获的恙螨动物宿主,有时捕获时动物如已死,在这种情况下,为防止恙螨幼虫的逃逸,可用白纸分开包着,注明采集地点、日期后,置于白布袋或塑料袋内,扎紧袋口,带回实验室检查。如野外捕获的动物宿主未死,用乙醚麻醉或用铁钳处死后,进行检查收集恙螨;一般用眼科镊或解剖针将宿主全身遍查以后,再检查不同的部位,如耳壳、眼缘、鼻腔、乳头、肛孔、外生殖器或翅上等,特别是小哺乳动物的耳壳内。如见有白色或桔黄色的,集聚成堆(或团)的恙螨幼虫,用眼科尖镊、解剖针或金属耳括挑取。如叮咬着的恙螨幼虫未饱食,则不易取下;或恙螨幼虫数量多,又来不及检取时,也可将恙螨连同叮咬部位,一起剪切下来,置于小玻璃碟内,再将这碟放置于装有一浅水的搪瓷盘内,过l~2d,多数恙螨幼虫就自行落下,漂浮于水面,再用毛笔或解剖针挑取。

(二)自然界采集恙螨幼虫、若虫和成虫

1. 动物诱捕法  用活的小白鼠装入小铁丝笼,置于草地或其他要调查的地方,一般是下午7时放,次晨7时收回,小鼠放24h后检查鼠身上是否又恙螨幼虫叮咬。

2. 漂浮法  取地面表层取泥土约500cm3,倾入盛有约2/3容量的清水玻璃缸内,用铁勺搅拌,静止片刻,恙螨和其他昆虫将漂浮在水面上,收集漂在水面上的恙螨生活史各期虫体。  

3. 黑色小板或黑色胶板诱法  准备漆成黑色的黑色小板、黑色胶板或是黑色x线胶片,面积为10cm×10cm。将小黑板等放置所调查的地方, 一定时间(如10min)后,检取聚集在板上的恙螨幼虫。

4. 碟诱法  把白色碟子置于要调查的地方,隔夜收回,检查收集爬入碟子上的恙螨幼虫。

5. 光诱法  用一定面积的一张厚纸,中开一窗(一定面积),加盖透明纸,铺于要检查的地方,过一定时间,检取聚积在窗孔的恙螨。

八、恙螨标本保存

一般实验室常用玻片法制成玻片标本保存。现场常用液浸法,即将采得的恙螨幼虫,立即放入70%酒精的指管内,管里放一标签,用软笔在签上注明采集号、采集地点、日期、宿主、采集者,再装满酒精,用脱脂棉塞紧,放入盛有酒精的玻璃瓶中,保存。

亦可将采得的标本投入氯醛胶中,或用氯醛胶封固制片,保存。片上贴标签。据王菊生等的经验,用此法保存的标本,以后制片的效果更好。

捕获的各种动物,可剥制作成整体标本,保存,待后鉴定。

所有采集情况都应详尽记录,记录应包括采集编号、宿主号、宿主、采集地点、采集地环境、恙螨种类和寄生部位及数量以致保存方法等。

九、恙螨标本制作

1. 玻片标本制作

(1)非染色标本制作  将保存在70%酒精内的恙螨幼虫幼虫置于小四方玻碟的蒸馏水中洗涤数分钟。自蒸馏水粘取一个恙螨幼虫,放于载玻片正中的一滴氯醛胶内;在解剖镜下,恙螨的位置调正,使其背面朝上,体与玻片垂直;然后轻轻盖上小盖片(大小为22mm×22mm或18mm×18mm)。最好是一张载玻片上只封一个恙螨。如同种恙螨标本较多,在一张载玻片上封2个或更多的标本时,应使标本一半背面朝上,一半腹面朝上,并整齐的排成一行或两行,以便于观察。将制好的标本平放在标本盘上,再置于35℃~40℃的温箱内,直到制片胶完全干固。在玻片标本干燥的过程中,应注意观察,如标本的胶部分干了,即用解剖针自盖片侧面添胶。在标本封胶完全烘干后,于盖片的周缘,加添丙酮赛璐珞液、加拿大胶或蜡(2份)与松香(7份)混合剂,便于长期保存。在显微镜下,鉴定虫种,并在玻片的两侧贴上标签(标签包括中文名、学名、宿主、采集地点、编号、日期、采集者)。

(2)染色标本制作  将保存在70 9/6酒精或氯醛胶内的幼虫取出,放于蒸馏水中5~10min。移至1%酸性复性acid fuchsin内染色6~12h;在蒸馏水中冲洗;用氯醛胶封固;

3. 暂时性处理标本  恙螨幼虫放于载玻片上,加l滴酒精酚混合剂(无水酒精5单位,酚95单位)或冰醋酸,盖上盖玻片。观察后,仍可转入酒精内或用氯醛胶制片,保存。

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