药物分析-授课教案:第四章药物定量分析与分析方法验证

基本内容

注解（进展、辅助

手段和时间分配)

第一节 定量分析样品的前处理 

一、概述

1　药物结构与分析前处理的关系 　

1.1　有机卤素药物

 卤素直接与药物分子的碳相连者，不包括某些有机药物的卤酸盐。

 结构特点：C—X

卤素与脂链相连：三氯叔丁醇

与芳杂环相连：泛影酸

1.2　含金属有机药物

硬脂酸镁

1.3　有机金属药物

汞撒利

复习旧课（3min)

引入新课（2min)

5min

结合PPT讲解。

加以比较，提高效果。

基本内容

注解（进展、辅助

手段和时间分配)

2　不经有机破坏的分析方法

2.1　直接测定法

直接滴定法

　 如：葡萄糖酸钙的含量测定

氧化还原滴定法

　 如：富马酸亚铁的含量测定

　　　 葡萄糖酸锑钠的含量测定

2.2　经水解后测定

碱水解后测定法

CCl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH 　加热回流

(CH3)2-CO + 3NaCl + HCOONa + 2H2O

   NaCl+AgNO3→AgCl↓+NaNO3

   AgNO3+NH4SCN →AgSCN ↓+NH4NO3

酸水解后测定法

2.3　经还原分解后测定法

3　经有机破坏的分析方法

3.1　湿法破坏

HNO3-HClO4法

HNO3-H2SO4法

H2SO4-K2SO4法

其它湿法： HNO3-H2SO4-HClO4法；H2SO4-H2O2法；H2SO4-KMnO4法。

40min

通过PPT讲解具体实例。

50min

基本内容

注解（进展、辅助

手段和时间分配)

（一)常量凯氏定氮法

1. 原理

  样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。

①　用H3BO3吸收后再以硫酸标准溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出氮的含量。

②　也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。

整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定

① 消化 总反应式：

v  

  脱水作用—使有机物脱水并碳化为C、H、N。

  氧化作用—将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫。

  2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2

  二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。

此处为新增内容，结合PPT讲解。

整个过程分几步？

基本内容

注解（进展、辅助

手段和时间分配)

（2)加入硫酸钾的作用是：提高溶液沸点而加快有机物的分解（3400C→ 4000C)

K2SO4+H2SO4=2KHSO4 

   2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3

   　但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：

  （NH4)2SO4=NH3↑+(NH4)HSO4

2(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O

  　 除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。

(3)加入硫酸铜的作用

  催化作用：加速有机物的氧化分解

   C＋2CuSO4 →  Cu2SO4 ＋ SO2↑＋  CO2↑ 

   Cu2SO4 ＋ 2H2SO4 → 2CuSO4 ＋ 2H2O ＋ SO2↑

   此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色)生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。

消化完全指示：蓝绿色；

蒸馏时碱性反应完全指示：变深蓝色或产生黑色沉淀。

② 蒸馏

　　在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气

　　  (NH4)2SO4 + 2NaOH  →  2NH3  + Na2SO4  + 2H2O

③ 吸收

　　用硼酸溶液，并加入混合指示剂(甲基红－溴甲酚绿)，硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8X10-10)，与氨形成强碱弱酸盐，酒红色→蓝绿色。

　　2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

④ 滴定

　　待吸收完全后，再用硫酸滴定液（0.05mol/L)滴定,

蓝绿色→灰紫色。

   (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=（NH4)2SO4+4H3BO3

二、 微量凯氏定氮法

适用范围：此法主要用于测定含有氨基或酰胺结构的药物含量。如扑米酮等。

各试剂的作用？

基本内容

注解（进展、辅助

手段和时间分配)

仪器、试剂:

500mL凯氏烧瓶、凯氏定氮装置

  消化用：①浓硫酸 ②硫酸钾　③硫酸铜

　蒸馏用：④40%氢氧化钠溶液

　滴定用：

　⑥H2SO4（0.05mol/L)标准溶液

　⑦0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液混合指示剂

3.2　干法破坏

3.2.1　钠熔法：加无水碳酸钠高温炽灼，进行有机破坏。本法适用于湿法不易破坏完全的有机药物。

3.2.2　氧瓶燃烧法：是一种破坏最完全的方法，适用于有机卤素药物的有机破坏…。

原理：将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定。

(1)仪器装置

氧瓶燃烧法是一种破坏最完全的方法。

样品如何制备，操作方法如何？

基本内容

注解（进展、辅助

手段和时间分配)

(2)吸收液的选择

待测元素的种类 所选用的分析方法

(4)操作法

第二节  定量分析方法特点

一、容量分析法

1.1　容量法的特点

 简便、快速、准确，适于化学合成原料药分析。

1.2　容量分析的计算问题

滴定度(T)

  每ml的滴定液（mol/L)相当于被测定物质的量（mg)。

浓度校正因子（F)

滴定度（T)的计算：

百分含量的计算：

（1)直接滴定法

50min

结合具体实例讲解计算问题，为后续课程的计算打下基础。

基本内容

注解（进展、辅助

手段和时间分配)

　　  W：取样量　　　 V：消耗滴定液体积

　　  T’：实际的滴定度　T：规定开云app安装不了怎么办 的滴定度

（2)间接滴定法

1)生成物滴定法：葡萄糖酸锑钠的含量测定。

2)剩余量滴定法（回滴定法)：如：例：司可巴比妥钠的含量测定。

二、　光谱法

（一)紫外－可见分光光度法

1．特点：波长200nm～760nm

①灵敏度高，可达10-4g/ml～10-7g/ml；②准确度高，相对误差2%～5%；③仪器价廉，操作简便，易普及；④应用广泛。

2．朗伯－比耳定律

A=ELC　　　　 　　　　

3．仪器校正和检定

由于温度变化对机械部分影响，仪器的波长经常会略有变动。应定期全面校正及测定前校正测定波长。汞灯较强谱线或氘灯的486.02nm与656.10nm谱线进行校正。

  吸收度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。

  杂散光的检查。

4．对溶剂的要求

5．测定法

　（1)对照品比较法

　（2)吸收系数法

　（3)计算分光光度法

通过例题对测定方法加以练习。

基本内容

注解（进展、辅助

手段和时间分配)

（二)荧光分析法

1．特点　某些物质受紫外光或可见光照射后能发射出比激发光波长较长的荧光。

（1)灵敏度高，10－10g/ml～10－12g/ml。

（2)在低浓度溶液中进行。

（3)必须做空白试验。

（4)对易被光分解的样品，可选择一种激发光和发射光波长与之近似而对光稳定的物质配成适当浓度的溶液，作为基准溶液。用基准溶液代替对照品溶液校正仪器的灵敏度。

（5)采用荧光衍生试剂，常使无荧光或弱荧光物质得到强荧光性产物，扩大了荧光分析法的范围。

（6)取样少，方法快速。

三、色谱分析法

（一)高效液相色谱法

1．对仪器的一般要求

2．系统适用性试验

（1)色谱柱的理论板数(n)

（2)分离度

（3)重复性

（4)拖尾因子

3．测定法

（1)内标法加校正因子测定供试品中主成分含量

（2)外标法测定供试品中主成分含量

　　①标准曲线法；

②外标一点法。

（二)气相色谱法

1．对仪器的一般要求

2．系统适用性试验

3．测定法

基本内容

注解（进展、辅助

手段和时间分配)

第三节  药物质量标准分析方法验证

方法验证的目的

   为保证分析结果的可靠性需对分析方法进行质量控制、进行认证（validation)和评价。“分析方法验证”的目的是证明采用的方法适应于相应的检测要求。

  不同的检测要求和不同的分析方法有其相应的验证标准和方法。  

适用范围

药品质量标准起草。

在药物生产方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，所变更的方法。

体内分析方法的建立。

验证内容

1　准确度　（Accuracy)

1.1　定义

测定结果与真实值或参考值接近的程度。

1.2　表示　　

	装 订 线

1.3　含量测定方法的准确度

1.3.1　原料药

有已知纯度的对照品或样品，可直接采用建立的方法测定样品计算回收率。

若无已知纯度的对照品或样品，必须用所建立的方法测得结果与己建立准确度的另一种方法测定的结果进行比较。

1.3.2　制剂

用含有已知量被测物的模拟处方进行测定。

如不能得到制剂的全部组分，可用加样回收率衡量准确度。

与标准方法比较。

1.4　数据要求

在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价。报告加入量的回收率（%)或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差或可信限。

2　精密度（Precision)

2.1　定义

 　同一均匀样品，经多次取样测定所得结果

之间的接近程度。

2.2　表示方法

30min

不同的检测要求和不同的分析方法有其相应的验证标准和方法。特别是有实习过程中，每个学生都 要有自己的课题，其中要接触到相关内容。

基本内容

注解（进展、辅助

手段和时间分配)

2.3重复性、中间精密度及重现性

2.3.1重复性（repeatability)

    相同的条件，由同一人员用同一仪器测定所得结果的精密度。

日内精密度 (within day precision)

日间精密度(day to day precision)

中间精密度（intermediate precision)：同－实验室,不同时间由不

同人员用不同仪器测定所得结果的精密度。

重现性（Reproducibility)：不同实验室，由不同人员测定所得结

果的精密度。 

3　专属性（Specificity)

选择性（selectivity)是指在样品介质中有其他组分共存时该方法对供试物准确而专属的测定能力。

3.1　鉴别反应

　　　结构相似或组分中的有关化合物，均应呈负反应。

3.2　含量测定和杂质测定

杂质对照品可获得  　模拟样品　

杂质或降解产物不能获得

　   同其它方法比较或用加速破坏法

4.检测限（Limit of detection, LOD)

4.1　定义

试样中被测物能被检测出的最低浓度或量。

4.2　方法

非仪器分析目视法

信噪比法

　 S/N=3(2)

5 定量限（Limit of quantitation LOQ)

5.1 定义

样品中被测物能被定量的最低量。

非仪器分析方法

仪器分析方法

S/N＝10：1

6　线性（Linearity)

6.1 定义

 　在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。

　  最小二乘法求回归方程

　  相关系数大于0.999（n≥5)

基本内容

注解（进展、辅助

手段和时间分配)

7　范围（Range)

7.1 定义

　　测试方法适用的高低限浓度或量的区间

7.2　原料药和制剂的含量测定

　　范围应为测试浓度的80%～120%。

7.3　制剂含量均匀度检查

　　范围应为测试浓度的70%～130%。

8　耐用性（Robustness)

　　在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。

效能指标的使用要求：

o   非定量分析方法　如鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求。

o   杂质的限量检查除专属性、检测限、耐用性外，其它都不要求。杂质的定量测定除检测限外，其它都要求。

o   含量测定及含量均匀度、溶出度或释放度的测定除检测限、定量限外，其它都要求。

一、常用样品的种类、采集和贮藏

(一)血样

(二)唾液

(三)尿液

二、生物样品分析前处理技术

(一)蛋白质的去除

(二)缀合物的水解

(三)有机破坏

(四)分离、纯化与浓集

(五)化学衍生化法

三、定量分析方法的验证

(一)特异性

(二)标准曲线与线性范围

(三)精密度与准确度

(四)定量下限

(五)样品的稳定性

(六)提取回收率

(七)质控样品

(八)质量控制

(九)测定结果

10min

问题讨论(5min)；

作业和习题布置2(min)；

归纳总结(3min)。

小 结

本章主要内容为：1.定量分析样品的前处理；2.定量分析方法的特点；3.药品分析方法的验证；4. 生物样品分析方法的基本要求。

复习思考题

或

作 业 题

1.试述氧瓶燃烧法的原理、特点、应用范围、吸收液的作用及选择原则。

2.干法破坏是如何进行的？

3.生物样品的前处理主要考虑哪几个方面的问题？

教 学 效 果

与 分 析

多媒体教学和板书相结合，并结合一定的实例，加深学生对知识点的认识和了解。特别是通过问题讨论，让大家对所学知识进行回顾、讨论，建立一个互动的教学氛围。效果较好，为下节课的继续学习打下基础。