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第4次课 授课时间：2006年 月 日
课程名称 | 年级 | 05级 | 专业、层次 | 临床医学等各专业本科 | ||||
授课教师 | 邬于川 | 职称 | 副教授 | 课型（大、小) | 小 | 学时 | 3 | |
授课题目 | 对流免疫电泳、动物过敏实验 | |||||||
基本教材及主要参考书 | 医学免疫学实验指导 邬于川主编 泸州医学院印刷厂2002 P18~19,P50 现代免疫学实验技术 沈关心、周汝麟主编 湖北科学技术出版社 1998 | |||||||
目的与要求： 掌握对流免疫电泳实验的原理、方法及结果分析； 掌握动物过敏实验的原理及结果分析； 熟悉试管凝集试验的结果判定方法及意义。 实施可溶性抗原的检测 | ||||||||
教学内容与时间安排： 观察上次试管凝集试验结果---10min 自作对流免疫电泳实验- --50min 动物过敏实验示教--- 20min 实施可溶性抗原检测 40min 教学方法：讲授、板书、示教 | ||||||||
教学重点及如何突出重点、难点及如何突破难点： 教学重点 对流免疫电泳实验原理及结果分析 动物过敏实验的原理及结果分www.lindalemus.com/job/析 教学难点 对流免疫电泳实验原理及结果分析 提示：将原理与实验中的具体结果结合起来分析。 | ||||||||
教研室审阅意见： 教研室主任签名： 年 月 日 | ||||||||
基本内容 | 教学手段 | 课堂设计和时间安排 |
教学进程 一 观察上次试管凝集试验结果 【结果】 ⒈ 凝集强弱，以下列记号表示： ＋＋＋＋：管内液体澄清，细菌全部凝集于管底，轻摇有大片凝集块。 ＋＋＋：管内液体轻度混浊，细菌大部分凝集于管底，凝集块较小。 ＋＋：管内液体中度混浊，细菌部分凝集于管底，凝集块更细小。 ＋：管内液体中度混浊，仅少量细菌凝集。 －：液体混浊，无凝集。若放置较长时间观察结果，未凝集的，细菌亦可沉积于管底。与凝集块沉淀物不同：前者是个小圆点，边缘光滑整齐，而后者似伞状，铺开沉淀于管底，边缘不整齐。 ⒉ 首先观察第8管（对照管)。正确结果应是管底沉淀物为圆形，边缘整齐，轻轻振摇，细菌分散呈均匀混浊。若出现了非特异的凝集，则本试验无效。 ⒊ 试验管应由第1管看起。H菌液凝集物呈疏松棉絮状，沉于管底，轻摇时易离散和升起。 ⒋ 凝集效价的判定：与相应菌液发生中等程度（＋＋)凝集的血清最高稀释度为该被检血清的凝集效价，用稀释倍数表示之。如第1管仍无凝集现象，应报“＜1∶40”，如第7管仍是“＋＋”或更强凝集，应报“＞1∶2560”。 【注意事项】 ⒈ 抗原、抗体在比例适当时，才能出现肉眼可见的反应。如果抗体的浓度过高，则无凝集物形成，此为前带现象，需要在测定结果时加以鉴别。 ⒉ 判定医.学全在线www.lindalemus.com结果时，应在暗背景下通过强光检查。 ⒊ 注意温度、PH、电解质、振摇对本试验的影响。 ⒋ 观察结果时，最好不要振摇试管，以免将凝集物摇散而影响他人观察。 二 对流免疫电泳试验 【原理】 对流免疫电泳是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术。将琼脂板置于电场中，在pH8.6的缓冲液中，大多数蛋白质抗原带负电荷向正极移动，而抗体为球蛋白，由于暴露的极性基团少，所带负电荷低，且分子量较大，移动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极移动（电渗是指在电场中液体对于一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性溶液中带负电荷，而与它接触的液体带正电荷，因此液体向负极移动，产生电渗)。这样抗原抗体相向运动，在比例适当处形成乳白色沉淀线。由于电场的作用，限制了抗原、抗体的自由扩散，而使其定向移动，因而增加了试验的灵敏度，并缩短了反应时间。此试验常用于检测甲胎蛋白（AFP)、乙肝病毒表面抗原（HBSAg)。 【材料】 1．HBSAg阳性血清、待检血清、抗HBSAg血清。 2．用打孔器按模型打成双排孔，孔径3mm，孔间距4mm，行间距4mm。 3．加样：用毛细吸管在双排孔的一侧加入抗HBSAg血清，另一侧分别加入HBSAg阳性血清和待检血清，注意抗原抗体的位置要一致。加样时以加满小孔为度，注意不能让液体溢出。 － ＋ Ag Ab Ag Ab 4、电泳：将加好样的琼脂板放置电泳槽上，抗原孔置负极端，抗体孔置正极端。琼脂板两端分别用双层滤纸片与电泳槽中的pH8.6的巴比妥钠缓冲液相连，接通电源，调节电流为2—4mA/cm板宽或电压为4—6V/cm板长，电泳45—60分钟。 5、电泳毕，关掉电源，取出琼脂板，观察在相应抗原抗体孔间有无白色沉淀线出现。 【结果】 阳性对照孔与抗血清孔间出现清晰白色沉淀线。若待检血清与抗血清孔间出现沉淀线为阳性，反之无沉淀线为阴性。若沉淀线不够清晰，可在37℃下放置数小时，以增强沉淀线清晰度。 【注意事项】 1． 对流免疫电泳试验的灵敏度较双向免疫扩散试验高，但由于电泳时缓冲液的离子强度、pH值、端电压和电泳时间等因素的影响，有时可能出现假阳性反应。 2． 抗原与抗体量应相接近，如抗原量过多，可造成假阴性结果，须通过稀释抗原加以解决。 三 动物（豚鼠)过敏试验
【原理】 豚鼠过敏试验属Ⅰ型变态反应，与人类的青霉素和异种血清蛋白引起的过敏性休克相似，通过了解动物实验性过敏性休克的方法及结果观察，有助于加深和理解Ⅰ型超敏反应的主要特点，发病机制及临床表现。其基本原理是先给豚鼠注射异种蛋白，经过一段时间，动物产生IgE等亲细胞型抗体，吸附于体内组织中的肥大细胞及血液中的嗜硷性粒细胞，使机体对该变应原（异种蛋白)处于致敏状态。当第二次给处于致敏状态的动物注射相同变应原时，变应原与肥大细胞和嗜硷性粒细胞表面的IgE结合，引起肥大细胞和嗜硷性粒细胞膜构型改变，细胞脱颗粒，释放多种活性介质，作用于相应效应器官，引起各种过敏症及过敏性休克 【材料】 1．动物：体重150克左右的幼小豚鼠2只。 2．变应原：鸡蛋白。 3．注射器、针头、酒精棉球 【方法】 1． 致敏注射：取健康豚鼠2只，分别编为1号、2号。 ①于1号豚鼠腹腔注射1:10卵白蛋白1ml ②2号豚鼠不注射 2．发敏注射：经14~21天致敏后，2只豚鼠分别同时心内注射1:10稀释卵白蛋白1-2ml，观察各豚鼠行为表现有何差异。 【结果】 1、1号豚鼠很快出现烦燥不安，耸毛、抓鼻、打喷嚏、痉挛性跳跃、大小便失禁等症状，重者数分钟内由于呼吸肌痉挛窒息而死亡。 2、2号豚鼠无任何症状发生。 检测可溶性抗原 做清洁 | 讲授、示教 ―――― 讲授 板书 示教 讲授 板书 示教 ――――― 讲授 板书 示教 | 约10min ―――― 约70min 约30min 约5min ―――――― 约35min ― 40min 约5min |
小 结 | 1、对流免疫电泳的原理 2、对流免疫电泳的方法 3、对流免疫电泳的应用 4、动物过敏试验的原理 |
复 习 思 考 题 、 作 业 题 | 思考题 1 对流免疫电泳的优点和缺点？ 2 Ⅰ型超敏反应的发生机制及相关临床表现？ |
下 次 课 预 习 要 点 | 教学录像内容： 一．免疫应答 二．淋巴细胞分离技术 三．艾滋病防治常识 |
实 施 情 况 及 分 析 |
