病原生物学实验指导
张育华 王光西
第一篇 细菌学总论 细菌的形态学观察 内容： 一、显微镜油镜的使用和保护 二、活菌运动的观察 三、细菌的基本形态和特殊结构观察 四、细菌涂片标本的制作和革兰氏染色 实验一 显微镜油镜的使用和保护 (useandcareofoilmicroscope) 微生物体积微小，必须借助于显微镜将其放大数百倍至数万倍才能观察到。因此，显微镜是认识和研究微生物最重要和最基本的工具之一，掌握其使用方法是进行微生物研究的基本技能。在细菌的形态学检查方面，以普通光学显微镜尤其是油镜最常用。 【材料】 1、普通光学显微镜、香柏油、二甲苯、拭镜纸。 2、细菌革兰氏染色片。 【方法】 1、普通光学显微镜的基本结构(图1) 2、油镜的使用： (1)右手提住镜臂，左手扶住镜座，将显微镜平稳地放于实验台上。勿将镜臂弯曲倾斜，以免香柏油流散。 (2)转动物镜转换器，使低倍镜对准聚光器，将聚光器升到最高位置，用凹面镜对光，完全打开光圈，使视野内光线最强。 (3)将标本固定在载物台上，先在低倍镜下找到标本的适当位置，再转换为油镜头。油镜头上都有标记，通常标有90×或100×，刻有HI或oil等字样，其前端有黑色、红色或白色圆圈，透镜孔径较其它物镜小。 (4)加一滴香柏油于标本欲检部位，用眼从油镜头侧面观察，同时调节粗调节器，使油镜头缓慢下降或载物台缓缓上升，直至油镜头刚好浸于油内。然后从目镜观察，缓慢调节粗调节器，直到出现模糊物象，再用细调节器将物象调至清晰。 3、显微镜的保护 (1)使用时应小心和爱惜，勿随意拆卸。 (2)保持物镜和目镜的清洁。每次使用完油镜后，应立即用滴有少许二甲苯的拭镜纸擦净镜头，再用干净的拭镜纸擦去镜头上的二甲苯，以防镜片脱落。 (3)显微镜用毕，应降下聚光器，并将物镜转开，使之呈八字形，盖上镜罩，放入镜箱。 (4)宜将显微镜放置于干燥处，但又要防止阳光曝晒。 (5)勿用强酸、强碱、酒精、乙醚等擦拭显微镜。 【注意事项】 1、用油镜观察时，一定要注意标本的正反面，标本面应向上。 2、载玻片的厚度应适当，不宜太厚。 3、一定要等标本完全干燥后，才滴加香柏油。 4、滴加香柏油的量以1滴为宜。 5、镜头上陈旧的香柏油也可用二甲苯软化。 附：香柏油的作用原理(图2) 图1 普通光学显微镜的基本结构1、目镜 2、镜筒 3、物镜转换器 4、物镜 5、载物台6、光圈 7、聚光器 8、反光镜 9、镜座 10、粗调节器11、细调节器 12、镜臂 13、聚光器调节器
实验二 活菌运动的观察 （observationofmotilityoflivingbacteria) 鞭毛是细菌的运动器官，有鞭毛的细菌在液体培养基中作定向运动，因而有位置的移动；无鞭毛的细菌在液体培养基中，由于受到液体中其它分子不规则布朗运动的冲击，只能在原处作不规则的分子颤动，而不发生位置的移动。 【材料】 1、普通变形杆菌、葡萄球菌8~12h的肉汤培养物。 2、载玻片、盖玻片、凹玻片、凡士林、接种环、镊子、普通光学显微镜。 【方法】 一、压滴法 1、用接种环各取2～3环普通变形杆菌、葡萄球菌肉汤培养物，分别置于两张载玻片的中央。 2、用镊子挟住盖玻片，使其一边接触菌液，然后缓缓放下，勿使菌液外溢，以不产生气泡为宜。 3、将标本置于高倍镜下，观察细菌运动情况。 1、取两张凹玻片，凹窝四周涂少许凡士林。 2、各取一环普通变形杆菌、葡萄球菌肉汤培养物，分别置于两张盖玻片的中央。 3、反转凹玻片，扣于盖玻片上，使凹窝正对盖玻片中央。轻压之，使凡士林粘住盖玻片后，再反转，菌液则悬垂在凹窝中央。 4、置低倍镜下找到悬滴的边缘后，再用高倍镜观察。 【结果】 普通变形杆菌作定向运动，提示其有鞭毛；葡萄球菌作布朗运动，提示其无鞭毛。 【注意事项】 用上述两种方法观察时，均需适当降低聚光器及缩小光圈，使视野光线较暗。 实验三 细菌的基本形态和特殊结构观察 （observationofbacterialbasicshapeandspecialstructure) 各种细菌细胞在一定的环境条件下，都有其相对恒定的形态和结构。观察细菌的形态结构，有助于细菌的鉴定、感染性疾病的诊断和治疗。 细菌的基本形态有球形、杆状和螺形三种。经革兰氏染色法染色后，可在显微镜下鉴别细菌的形态、大小、排列方式和染色性。细菌的特殊结构包括荚膜、芽胞、鞭毛和菌毛，其中菌毛必须在电子显微镜下才能观察到，其余三种也需要通过各自特殊的染色，才能在油镜下查见。 【材料】 1、球菌示教片：葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、脑膜炎双球菌、淋球菌革兰氏染色片。 2、杆菌示教片：大肠杆菌革兰氏染色片。 3、螺形菌示教片：水弧菌革兰氏染色片。 4、鞭毛示教片：普通变形杆菌鞭毛染色片。 6、荚膜示教片：肺炎双球菌荚膜染色片。 【方法】 l、在油镜下观察各种形态的细菌，比较它们在颜色、大小、形态和排列方式上的差别。 2、用油镜观察细菌的各种特殊结构，注意鞭毛的数量和位置；芽胞的大小、形态和位置；荚膜的厚度、颜色。 【结果】 请将观察结果以绘图方式记录如下： 实验四 细菌涂片标本的制作和革兰氏染色 （preparationofbacterialsampleandgramstain) 细菌体积微小，为五色半透明体，若不经染色直接在显微镜下观察，仅能初略观察其大小和形态。若要识别细菌的各种结构，则必须进行染色。细菌的染色方法有多种，其中革兰氏染色是应用最广泛的细菌染色法。用这种方法可以将所有的细菌区分为革兰氏阳性。 菌和革兰氏阴性菌两类，对于鉴别细菌、研究细菌的致病性和选用抗菌药物均有重要价值。 革兰氏染色法的原理目前仍未完全阐明，大多数学者倾向于细胞壁学说。该学说认为：革兰氏阳性菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗出，细菌仍保留结晶紫初染的紫色；革兰氏阴性菌细胞壁疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被乙醇溶解，增加了细胞的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞脱色后经复红复染，着上红色。 【材料】 1、大肠杆菌、葡萄球菌18～24h培养物。 2、结晶紫染液、卢戈氏碘液、石炭酸复红稀释液、95％乙醇。 3、载玻片、接种环、生理盐水、酒精灯等。 【方法】 1、细菌涂片标本的制备：涂片干燥固定。 (1)涂片：用接种环取l～2环生理盐水置于一张洁净载玻片中央。将接种环灭菌后，刮取少许菌苔于生理盐水中碾磨成乳浊状，并涂成直径约1cm2的菌膜(若用细菌的液体培养物制片，可直接取材涂片，不用加生理盐水)。 (2)干燥：最好自然干燥。必要时也可将涂片的标本面向上，在离酒精灯火焰较远的高空处小心烘干。切勿靠火焰太近，以免将标本烤枯，细菌变形，影响结果观察。 (3)固定：手执载玻片一端，标本面向上，在酒精灯火焰外层上以钟摆速度来回通过三次，目的是杀死细菌，匣菌体与玻片粘附更牢固，染料更容易进入菌体(图4)。 2、革兰氏染色： (1)初染：滴加1～2滴结晶紫染液于标本菌膜上，1min后，用水冲洗，并倾去玻片上的余水。 (2)媒染：加卢戈氏碘液l～2滴于菌膜上，1min后，用水冲洗，并倾去玻片上的余水。 (3)脱色：加95％乙醇1～2滴于菌膜上，轻轻晃动玻片约30秒钟，然后用水冲洗，并倾去玻片上的余水。 (4)复染：加石炭酸复红稀释液1～2滴于菌膜上，用水冲洗，并倾去玻片上的余水。待标本干燥后，用油镜观察。 【结果】 葡萄球菌是革兰氏阳性菌，被染成紫色；大肠杆菌是革兰氏阴性菌，被染为红色。 【注意事项】 1、细菌涂片时，菌膜应薄而均匀。 2、在染色过程中，应该用细小水流冲洗，且水流不宜直接冲在菌膜上。 3、革兰氏染色的结果受多种因素影响，如细菌的培养时间、染色技术等。染色中应特别注意掌握好脱色的时间过长或过短均会影响染色结果。气温较高时，脱色时间可稍短；气温较低时，脱色时间可稍长。 【思考题】 1、掌握细菌各种特殊结构的特点有何意义? 2、细菌涂片标本的菌膜过厚，对革兰氏染色的结果有什么影响? 3、经革兰氏染色后，葡萄球菌若被染为红色，试分析其原因。 细菌的生长繁殖和代谢 内容： 一、基础培养基的制备 二、细菌的接种法和生长现象观察 三、细菌代谢产物的检查 第二篇 细菌各论实验 球菌是细菌中的一个大类，根据染色性不同分为革兰氏阳性球菌与革兰氏阴性球菌。革兰氏阳性病原性球菌主要有葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌。革兰氏阴性病原性球菌主要有脑膜炎球菌和淋球菌。 内容： 一、病原性球菌的形态特征及培养特性 二、脓汁标本病原菌的分离鉴定 三、病原性球菌几种常用的生化检查方法及致病性测定 病原性球菌 实验十六 病原性球菌的形态特征及培养特性 目的要求： 掌握病原性葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、脑住院医师膜炎球菌的形态特征、染色性及菌落特征。 【材料】 1、葡萄球菌、链球菌、脑膜炎球菌和淋球菌革兰氏染色示教片，肺炎链球菌荚膜染色示教片。 2、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌在普通平板上18-24h培养物，金黄色葡萄球菌、甲型、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌在血平板上18～24h培养物。 【方法】 1、镜下观察葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌和淋球菌，注意他们的形态、大小、染色性和排列方式，仔细观察肺炎链球菌的特殊结构(荚膜)。 2、观察几种葡萄球菌在普通平板上形成的色素颜色，观察金黄色葡萄球菌，甲型、乙型溶血性链球菌，肺炎链球菌在血平板上的生长现象，主要从菌落大小、颜色、有无溶血现象三个方面观察。 【结果】 l、形态及染色观察：见表 2、菌落观察： (1)金黄色、表皮、腐生葡萄球菌菌落均为圆形、隆起、湿润、光滑、边缘整齐、不透明的中等大小菌落，各自形成金黄色、白色、柠檬色脂溶性色素，培养基不着色，金黄色葡萄球菌菌落周围有五色透明较宽的完全溶血环。 (2)链球菌为灰白色、表面光滑、边缘整齐的细小菌落，甲型溶血性链球菌菌落周围形成草绿色半透明狭窄的溶血环，乙型溶血性链球菌菌落周围形成五色透明较宽的溶血环，丙型链球菌无溶血环。 (3)肺炎链球菌菌落圆形，光滑，中心凹陷，边缘隆起，半透明，针尖大小，菌落周围有草绿色半透明狭窄的溶血环。 表6 几种病原性球菌的菌体形态及染色性
实验十七 脓汁标本病原菌的分离鉴定 从临床标本中，根据各种化脓性球菌不同的生物学特性，通过直接涂片镜检、分离培养、观察生化反应等方法，可鉴定出未知的化脓性球菌，不仅可提供化脓性感染疾病临床诊断的依据，而且可进行药物敏感试验，为临床选用有效的抗菌药物提供参考。本实验主要以葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌和淋球菌为检查对象。 目的与要求 熟悉病原性球菌的分离、鉴定方法。 【材料与方法】 l、标本采集和处理 (1)脓标本：用无菌棉签，蘸取患处深部脓液少许，置入无菌空试管内，送检。 (2)痰标本：用消毒过的容器收集病人痰液，以无菌棉签挑取病人脓稠痰块，置入无菌空试管内，送检。 (3)咽喉部标本：令病人把口张大，用压舌板压住舌根部，用无菌棉签，迅速蘸取咽喉部分泌物，置入无菌空试管内，送检。 (4)血标本：疑为化脓性球菌败血症患者，在严格无菌操作下，静脉釆血5-6ml，床旁直接加入50m1的肉汤瓶内，立即摇匀，送检。 (5)脑脊液标本：需做脑脊液细菌学检验的病人，在严格无菌操作下，做腰椎穿刺，取脑脊液置入无菌容器内，立即送检。 (6)尿道、阴道分泌物标本：对淋病可疑患者，男性可从尿道取材，取材时无菌棉签应进入尿道1-2cm，如刚排尿，应等待1小时左右。女性则可从宫颈口取分泌物，当无菌棉签插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转1～2分钟拿出。取材后应立即送检，不可放置冰箱。 2、分离与鉴定 根据检查的要求和目的，按下图所示进行分离鉴定。
【结果】 通过上述检查，得出标本中化脓性球菌的种类和细菌药物敏感试验的结果。 【注意事项】 1、上面只表明一般的检查原则，在实际检查中，还须根据临床提供的可能诊断，做定向的检查。 2、若疑为流脑或淋病患者，其标本送检时，要注意保温，所用的培养基要提前放人孵箱内预温。 3、在检查脑膜炎球菌或淋球菌时，如需做细菌培养，应选用巧克力血琼脂平板。 实验十八 病原性球菌的几种常用生化检查方法及致病性的测定 目的与要求 掌握血浆凝固酶试验(玻片法)，熟悉胆汁溶菌试验，了解抗链球菌“O”溶血素试验。 (一)血浆凝固酶试验 大多数致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使人或动物血浆发生凝固。因此，测定血浆凝固酶的有无是鉴定葡萄球菌致病性的重要依据。血浆凝固酶分为结合于菌体的结合凝固酶和分泌至菌体外的游离凝固酶，可分别由玻片法和试管法测定。 [玻片法] 【材料】 1、金黄色、表皮葡萄球菌琼脂斜面培养物。 2、兔血浆、生理盐水。 3、玻片、接种环等。 【方法】 1、将玻片分为3格，用接种环分别取2～3环生理盐水。 2、从琼脂斜面挑取金黄色葡萄球菌，分别混悬于第1格和第3格内，挑取表皮葡萄球菌，混悬于第2格。 3、在第1、2格分别加入兔血浆各一环并混匀，第3格不加兔血浆。静止片刻，观察结果。 【结果】 第3格和第2格不凝聚；第1格中金黄色葡萄球菌凝集成块，即判定为血浆凝固酶阳性。 表7 血浆凝固酶试验
【试管法】 【材料】 1、金黄色、表皮葡萄球菌琼脂斜面培养物。 2、兔血浆、生理盐水。 3、1ml刻度吸管、小试管。 【方法】 l、稀释血浆：将生理盐水与兔血浆作l:4稀释，然后分别吸取0.5ml置于2只小试管内。 2、从斜面上分别挑取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌各数环于血浆管中，制成浓厚的悬液。置37℃水浴30分钟，观察结果。 【结果】 接种金黄色葡萄球菌的管中血浆凝固，接种表皮葡萄球菌的管中血浆不凝固，前者为凝固酶试验阳性，后者为凝固酶试验阴性。 (二)胆汁溶菌试验 由于肺炎链球菌能产生自溶酶，可使细菌本身发生溶解。而自溶酶可被胆汁、胆盐或其他表面活性物质激活而进一步增加其活性，加速菌体的溶解。凭借此试验可鉴别肺炎链球菌与甲型溶血性链球菌。 l、肺炎链球菌菌液，甲型溶血性链球菌菌液。 2、10％去氧胆酸钠溶液，生理盐水。 3、水浴箱、吸管、试管等。 【方法】 1、按表排列试管，并加入各成分。 表8 胆汁溶菌试验 单位:ml
【结果】 1号管由混浊变清亮，表明细菌被溶解，即为胆汁溶菌试验阳性。其余各管无变化，为阴性。 【注意事项】 1、去氧胆酸钠在酸性环境下易沉淀，故菌液应是弱碱性。 2、粗糙型或死的肺炎链球菌，可以不表现出胆溶现象。 3、胆盐溶菌过程，是加速自然溶菌的过程，胆盐本身没有直接的溶菌作用。 4、此试验为定性试验，故所用菌液以肉眼可见混浊即可。 (三)抗链球菌溶血素“O”试验 乙型溶血性链球菌产生的溶血素“O”(strepto1ysino,SLO)，为含有～SH基的蛋白质，在还原状态其溶血性活跃，遇氧时，～SH基被氧化为～S～S～基，失去溶血活性。由于SLO有很强的免疫原性，多数人感染该菌后，血清中出现较高水平的抗O抗体，并可至病愈后数月至数年才消失。因此，测定患者血清中抗O抗体的效价，常作为风湿热及其活动性的辅助诊断。 在体外，以还原溶血素为抗原与待检血清混合后观察结果，如血清中有相应抗体，则可中和溶血素使其失去溶血活性，再加红细胞时不溶血，呈现抗“O”阳性反应，反之，则为阴性。 【材料】 1、被检血清(加热56℃30分钟灭活，用生理盐水稀释为1:200)、链球菌溶血素、还原剂、生理盐水、2％兔红细胞。 2、小试管、吸管、水浴箱等。 【方法】 1、配制还原溶血素：取链球菌溶血素片剂及还原剂各一片，置小试管中，加生理盐水1ml，用玻璃棒搅碎，放室温15分钟使溶血素还原，最后补充生理盐水7ml，制成还原溶血素“O”。 2、取5支小试管，分别编号，按表进行操作。 表9 抗“O”实验操作表 单位：ml
【结果】 观察结果时，应轻轻取出试管(勿摇动)，对光检查有无溶血现象(溶血者上清液呈透明红色，不溶血者混浊)。完全不溶血的血清最高稀释度即为抗链球菌溶血素“O”的效价。一般正常人血清效价在I：250以内，大于l：400有诊断意义，表明机体近期感染过溶血性链球菌。风湿热、肾小球肾炎等链球菌感染性疾病，效价逐步增高提示为活动期，反之则为缓解期。 【思考题】 1、说明几种病原性球菌的菌体形态及特征。 2、为什么对葡萄球菌的细菌学检测要做致病性鉴定?有哪些方法?最常用的是哪种方法?
第三篇 其它微生物及病毒实验 螺旋体的检查 内容： 一、钩端螺旋体暗视野显微镜观察 二、钩端螺旋体凝集溶解试验 三、梅毒螺旋体镀银染色片观察 四、梅毒血清学～～RPR试验 五、口腔标本涂片刚果红染色检查奋森氏螺旋体 目的要求 熟悉几种主要原性螺旋体的形态特征及染色性。 螺旋体是一类细长、柔软、弯曲呈螺旋状、运动活泼、革兰氏阴性的原核细胞型微生物。螺旋体种类很多，对人致病的主要有钩端螺旋体、梅毒螺旋体和回归热螺旋体。 实验三十三 钩端螺旋体形态观察 (一)钩端螺旋体活标本暗视野观察 【材料】钩端螺旋体培养物、载玻片、盖玻片、暗视野显微镜、暗视野显微镜灯源、酒精灯、接种环。 【方法】取钩体培养液滴于载玻片上，覆以盖玻片。在暗视野显微镜聚光器上加l滴香柏油，使载玻片背面与香柏油接触，低倍镜下调节反光镜，使光集中在聚光器上。调清楚视野后，再换高倍镜观察。可在黑色背景中清楚地看到闪烁光亮的螺旋体，运动活泼，同时具有特殊运动方式，如同原虫一样的蠕动、弯曲成角、旋转运动、一端或两端弯曲呈钩状。 附：暗视野显微镜原理 暗视野显微镜是将普通显微镜的聚光器换成一个暗视野聚光器，该聚光器中央有一个黑色挡光板，光线不能直接进入物镜头，而只能从挡光板周边缝隙折射到载玻片上。当光线通过载玻片上的标本时，由于标本与周围物体折光率不同而引起光的折射，使一部分光线进入物镜头，从而可在黑色的背 (二)固定标本片（宜薄)，Fontana氏镀银染色法观察： (1)钩体标本涂片(宜薄)，自然干燥(不用火焰固定)。 (2)滴加固定液(冰醋酸1ml，甲醛2ml，蒸馏水10m1，作用1～2min)。 (3)用无水乙醇洗涤。 (4)滴加媒染液(鞣酸5g，石炭酸1g，蒸馏水100m1)2～3滴，加温至发生蒸汽，染30sec，水洗： (5)滴加氨银溶液(5％硝酸银液，逐滴加入10％氨液，至所产生的棕色沉淀物经轻轻摇动溶解为止)，并加热使产生蒸汽，染30sec，水洗。干后用加拿大树校胶片，镜检。 【结果】 背景为淡棕色，钩体染成棕褐色，一端或两端有钩，但螺旋不清楚。 实验三十四 凝集溶解试验 凝集溶解试验是一种血清学反应，用来测定病人血清的抗体或用已知血清鉴定所分离到的钩端螺旋体型别。但不同于细菌凝集反应，钩端螺旋体遇到相应抗体可发生产凝集，但抗体浓度大时则可溶菌，故称为凝集溶解反应。 1、在有机玻璃凹孔板上，按表顺序加入各成分量后摇匀，置37℃2h。 表12 凝集溶解试验
2、2h后，从各孔中分别吸取1滴于载玻片上，覆以盖玻片，在商视野显微镜下观察。 3、结果判定 “++++”：几乎全部钩体发生凝集，偶见极少数正常钩体存在。 “+++”：75％以上钩体凝集，凝集者呈蜘蛛状，见少数游离。 “++”：50％以上钩体凝集呈现蜘蛛状，约有半数不凝集。 “+”：25％以上钩体凝集呈现小蜘蛛状，大多数游离运动活泼。 “～”：钩体正常分散存在。 无凝集现象生理盐水对照：全部钩体正常，运动活动，分散存在。 凝溶试验通常以出现“++”的最高稀释度为该血清最终效价，效价1：400以上才有诊断意义。 实验三十五 梅毒螺旋体形态观察 （一)梅毒螺旋镀银染色片示教，油镜下的背景为淡黄褐色，螺旋体呈棕褐色至棕黑色。 (二)梅毒血清试验～～RPR试验 RPR试验，即快速血浆反应素卡片实验(rapidplasmareagincardtest)，是一种正相间接凝集反应。将患者厕清与吸附于活性炭的心磷脂～胆固醇的类脂质抗原混合，出现不同程度的黑色素凝集颗粒或絮片为阳性。 【方法】 定性试验：取待检血清50pL，加至卡片上，并扩大到整个圆圈。每份血清上滴加RPR抗原]滴(约50цL)，旋转摇动8min，立即用肉眼观察结果。 定量试验：定性试验阳性者，可在RPR卡片上将血清作1:2-1:64稀释后，按定性方法操作进行定量试验。 结果判定： 定性：阴性标本反应液中不出现黑色素凝集颗粒。阳性标本反应液中可见明显黑色素效集颗粒或絮片。 定量：以肉眼为观察标准，根据颗粒或絮片的大小，记录“+”～”++++”或“～”： “++++”：明显块状沉淀，溶液明亮。 “+++”：呈现大颗粒，溶液明亮。 “++”：呈现小颗粒，溶液明亮。 “+”：仅显细小颗粒，溶液混浊。 “±”：仅呈轻微絮状，液体混浊，为可疑反应。 “～”：清晰无颗粒。 抗原对照应呈现乳光，完全液化。
第四篇 寄生虫学实验 实验四十六 溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica) 目的要求： 1、掌握溶组织内阿米巴的各期形态特点。 2、掌握碘液染色法检查溶组织内阿米巴包囊的方法。 3、认识非致病阿米巴与溶组织内阿米巴的区别特点。 实验内容： 一、自学标本： 1、活的阿米巴滋养体：用生理盐水直接涂片法作涂片，立即用低倍镜寻找。查见不规则能运动的滋养体，然后换高倍镜，仔细观察其阿米巴运动，伪足的特点。 2、溶组织内阿米巴包囊：以碘染色后，低倍镜寻找，高倍镜观察构造，包囊为黄绿色的圆形小体，囊壁，核膜与核仁均着色，糖原块呈棕黄色，因折光的原因可发亮或暗色，包囊的拟染色体不着色。注意观察溶组织内阿米巴包囊的大小、形状、颜色、核和糖原块等构造。 二、示教标本：铁苏木素染色标本，以油镜观察阿米巴的形态构造，要观察到 所有的构造，可一边仔细调节细螺旋，一边观察。 1、溶组织内阿米巴大滋养体：注意大小，内、外质区别明显，内质中可见被吞噬的红细胞，体积较小，被染成黑色。滋养体有核一个，圆形、呈车轮状，核膜内缘有一层细而排列整齐的染色质粒。核仁一个，小点状，居中。 2、溶组织内阿米巴包囊：注意大小、形状，核的数目和构造，拟染色医学全.在线www.lindalemus.com体形状，有无糖原块。 3、与其它非致病阿米巴的形态鉴别，如结肠内阿米巴包囊。 三、技术操作 碘液染色法 (1)滴一滴碘液于载玻片上，以竹签蘸取粪便少许，混合涂布于碘液中(或在碘液附近滴一滴粪便沉淀液)然后以盖玻片的棱角调匀，以此盖玻片盖于液体上。 (2)作好的片子放于低倍镜下仔细寻找包囊，找到后，再换高倍镜观察结构。 注意事项： 1、请勿用油镜观察碘液染色的片子。 2、在观察碘液染色标本时，载物台要放平，光线稍强，并须耐心寻找，尤其较小的包囊更须细心。 3、将涂用的竹签和用后的玻片，放在指定的地方。 作业： 绘图：碘染色的溶组织内阿米巴包囊，注明结构。 思考题： 1、对溶组织内阿米巴急性患者和带虫者的粪便各采取何方法检查病原体? 2、检查阿米巴滋养体时应注意什么问题? 实验四十七 杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani) 目的要求： 1、掌握杜氏利什曼原虫无鞭毛体的形态特征。 3、观察本虫前鞭毛体的形态及传播利什曼病的中华白蛉。 实验内容： 一、自学标本：无鞭毛体(利杜体)：患者骨髓穿刺液染色涂片或人工感染的田鼠肝、脾印片，经吉氏或瑞氏染液染色制片。因为原虫甚小，故直接在油镜下寻找，并观察其结构。注意大小(和红细胞比较)，细胞颜色，核和动基体的位置变化很大，有时只能看到核，而看不到动基体，有时核偏于一侧或一端，而动基体居于中央。 注意事项：被侵袭的网状内皮细胞由于膨胀过大，在涂片时往往破裂，而利杜体散于血浆中。要与血小板相区别，利杜体较大，细胞质包有较规则的膜，而血小板较小一般不超过2微米，常呈星形或多角形，成群分布。 二、示教标本 1、前鞭毛体：显微镜下观察，注意大小，形状，鞭毛，动基体的位置以及多数虫体集合而呈菊花形的排列。 2、中华白蛉Phlebotomus Chinensis：约为蚊子的1／3大小，驼背状，全身密生细毛，灰黄色(详见教材白蛉部分)。 作业： 以彩色笔绘图，无鞭毛体(利杜体)，标明结构。 思考题： 诊断利什曼病应从那些器官组织取材?怎样识别涂片中的无鞭毛体? 实验四十八 蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia) 目的要求： 观察蓝氏贾第鞭毛虫的滋养体和包囊。 实验内容： 一、自学标本： 包囊：碘液染色(方法见阿米巴实验技术操作)，低倍镜找到后，高倍镜下观察其大小，活意形状，轴柱，鞭毛及核的数目等。 二、示教标本： 1、滋养体(吉氏染色，油镜观察)：注意大小，形态，核和鞭毛数目等构造。 2、包囊(铁苏木素染色，油镜观察)：注意大小，形状，轴柱，鞭毛及核的数目。 作业：绘蓝氏贾第鞭毛虫包囊图(碘染)，并标明结构。 思考题： 蓝氏贾第鞭毛虫滋养体和包囊的形态特征有哪些? 实验四十九 阴道毛滴虫（Trichomonas Vaginalis) 目的要求：认识阴道毛滴虫滋养体的形态及活动特点。 实验内容： 一、自学标本： 阴道毛滴虫滋养体(吉氏染色或铁苏木素染色标本)：油镜下观察，可见虫体的构造。 二、示教标本 1、活的阴道毛滴虫滋养体：高倍镜下观察，在悬滴液内可以看到梨状的透明虫体，运动较活泼，前鞭毛不时地在摆动。注意其运动情况，因在临床检验多观察此种活标本。 2、阴道毛滴虫滋养体，吉氏染色或铁苏木素染色标本。 作业： 绘阴道毛滴虫滋养体图，并标明结构 思考题： 1滴虫性阴道炎的发病原因是什么? 2检查阴道毛滴虫的方法有哪几种?
实验五十 疟原虫(Plasmodium spp) 目的要求： 掌握间日疟原虫和恶性疟原虫在人体红细胞内的各期形态。 掌握薄血膜的推片，染色(用吉氏或瑞氏染液染色)操作 实验内容： 一、自学标本： 间日疟原虫薄血片(吉氏染色)：观察方法：将有血膜的一面朝上，置于低倍镜下，在血膜末梢红细胞分布均匀处加镜油一滴，使油镜头浸入油中；调节光亮度取得较强的光线；慢慢旋转螺旋细调节，看清红细胞后，按顺序观察。在红细胞内找疟原虫，一般在环状体期以后，被寄生的红细胞开始逐渐涨大，褪色，而且出现红色薛氏小点。 (1)环状体：注意大小，细胞质与核的特点。 (2)大滋养体：注意虫体增大，细胞质和核的变化，有否疟色素。 (3)未成熟裂殖体：注意虫体变化，细胞质特点，核的数目，疟色素分布。 (4)成熟裂殖体：注意核分裂数目，细胞质是否已随之分裂，裂殖子排列情况，疟色素分布情况。 注意事项： 1、疟原虫甚小，且在红细胞内，受感染红细胞的比例也少，一般被间日疟原虫侵袭的红细胞不超过1%，故需耐心地查找。 2、在油镜下寻找与观察虫体形态时，滴油不可过多，以免损坏镜头与标本。 3、注意染料渣质与疟原虫的区别：疟原虫必须具备红色的核质部分和蓝色的细胞质部分，除环状体外还可见疟色素，染料渣则无上述特点。 4、注意大滋养体与配子体的区别。 5、淋巴细胞与疟原虫的区别：淋巴细胞的细胞核大多数是圆形，核大，有显著的网状结构，而浅蓝色的胞质很少，无疟色素。 二、示教标本 1、薄血膜中间日疟原虫红细胞内各期(环状体、大滋养体、成熟或未成熟裂殖体、雌或雄配子体)(油镜)。 2、薄血膜中恶性疟原虫红细胞内的环状体、雌或雄配子体(油镜)。 3、子孢子 三、操作 薄血膜的制作及染色 1、取血 小鼠：将伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)保种的小白鼠的尾部末端剪去，将血滴置于载玻片一端。 2、推片和染色 1)取边缘平滑的另一载玻片作推片，以左手持载玻片的两端，右手持推片中段两侧，将推片一端的边缘置于血滴上，使血液沿推片端边缘展开。 2)使两玻片呈30—45度角，将推片向另一端推动，推成均匀的薄血膜。血量适度、推的方向一致、用力均匀是推片成功的关键。放置待干后，用蜡笔在血膜两端划线以防染液外溢。 3)用吸管吸取瑞氏(Wright)染液，滴5—10滴于血膜上，使其覆盖全部血膜。 4)经30秒钟后，滴加等量的缓冲液，使之与染液混匀。 静置染色5—10分钟后(注意不使染液干燥)，用清水轻轻将染液冲去。冲洗前切勿先倾去染液，以免染料颗粒沉着。 5)血片斜置，待干后用油镜观察。 3、观察效果 好的标本在油镜下观察可见到红细胞平铺，无重迭现象。白细胞核呈紫蓝色，血膜上无染料残渣沉着，表明染色良好。本次实验经染色的鼠血薄血膜中鼠疟虫数量多，被寄生的红细胞明显胀大，常见红细胞内有多个疟原虫寄生，疟原虫细胞质呈蓝色，核为红色。 4、注意事项 1)载玻片应洁净无油污，以免血膜上产生空泡样的空白区。 2)推片的边缘要平整光滑，推力要均匀，中途不能停顿，以免血膜厚薄不匀。 3)涂成的血膜让其自然干燥，切勿加热或曝晒，以免影响染色效果。 4)加缓冲液时要充分混匀，染色后用流水缓慢冲去染液，避免染料残渣沉着在血膜上。厚血膜制作：详见教材实验技术篇附：厚薄血膜的优缺点： 用薄血膜观察疟原虫，可保持完整的红细胞，有助于鉴别虫种，但疟原虫数量较少，需细心寻找。厚血膜取血量多，虫体集中，检出率高，但溶血后的红细胞失去完整形态，只剩下疟原虫和疟色素，无经验者不易识别。故为了取长补短，在流行病学调查时，一般采用在同一张玻片上作厚薄两种血膜。 作业： 以彩色笔绘间日疟原虫红内期的各期形态图，并注明结构。 思考题： 1、疟原虫的基本构造有哪些?红内期有哪些形态? 2、间日疟原虫红内期各期的形态特征有哪些? 3、怎样做好厚、薄血膜?两种血膜查疟原虫各有哪些优缺点?用瑞氏或吉氏染色法各应注意什么事情?为什么? 5 ...
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