医学分子生物学教案
第 8-10 次课 授课时间：2009年10月19日-11月6日
| 课程名称 | 医学分子生物学 | 年级 | 2007 | 专业、层次 | 临床医学 | |||||||
| 授课教师 | 于海清 | 职称 | 讲师 | 课型（大、小) | 大 | 学时 | 9 | |||||
| 授课题目（章、节) | 第十九章 基因操作 | |||||||||||
| 基本教材及主要参考书 | 药立波 主编. 医学分子生物学(第3版). 北京: 人民卫生出版社, 2008 冯作化 主编. 医学分子生物学. 北京: 人民卫生出版社, 2001 | |||||||||||
| 教学目的与要求： 目的：理解和掌握核酸的一般理化特性；核酸分子杂交的原理。理解和掌握PCR技术的基本原理；基因文库、cDNA文库的概念。理解和掌握基因克隆的概念；限制酶的概念；基因克隆的必要条件；基因克隆的基本步骤。理解和掌握原核表达系统的特点；真核表达系统的特点；基因转染的概念。理解和掌握直接分析基因一级结构的方法；基因定向突变的概念。理解和掌握核酸探针的概念；Southern印迹分析的基本原理；Southern印迹分析的基本过程。理解和掌握Northern印迹的概念；Northern印迹分析的基本过程；实时RT-PCR的基本原理。理解和掌握转基因技术、转基因动物和基因转染细胞的概念；转基因动物和基因转染细胞的基本过程；基因打靶的概念；RNA干扰技术的概念；RNA干扰的基本原理；RNA干扰技术的基本流程。 要求： 1. 核酸的一般理化特性；核酸分子杂交的原理。 2. PCR技术的基本原理；基因文库、cDNA文库的概念。 3. 基因克隆的概念；限制酶的概念；基因克隆的必要条件；基因克隆的基本步骤。 4. 原核表达系统的特点；真核表达系统的特点；基因转染的概念。 5. 直接分析基因一级结构的方法；基因定向突变的概念。 6. 核酸探针的概念；Southern印迹分析的基本原理；Southern印迹分析的基本过程。 7. Northern印迹的概念；Northern印迹分析的基本过程；实时RT-PCR的基本原理。 8. 转基因技术、转基因动物和基因转染细胞的概念；转基因动物和基因转染细胞的基本过程；基因打靶的概念；RNA干扰技术的概念；RNA干扰的基本原理；RNA干扰技术的基本流程。 | ||||||||||||
| 教学内容与时间安排、教学方法： 内容： 1. 核酸的理化性质。 10分钟 2. 基因的获取。 70分钟 3. 基因的克隆。 80分钟 4. 克隆基因的表达。 20分钟 5. 基因结构的分析及改造。 30分钟 6. 基因的拷贝数分析。 30分钟 7. 基因表达的分析。 40分钟 8. 基因功能的分析。 80分钟 方法：尽量使用图片简图加深感性认识，总结对比增强辨识力，动画演示有助于理解。研究进展和报告增加应用实例，布置一些内容自学，尝试课堂提问或讨论。 | ||||||||||||
| 教学重点及如何突出重点、难点及如何突破难点： 重点：核酸的一般理化特性；核酸分子杂交的原理。PCR技术的基本原理；基因文库、cDNA文库的概念。基因克隆的概念；限制酶的概念；基因克隆的必要条件；基因克隆的基本步骤。原核表达系统的特点；真核表达系统的特点；基因转染的概念。直接分析基因一级结构的方法；基因定向突变的概念。核酸探针的概念；Southern印迹分析的基本原理；Southern印迹分析的基本过程。Northern印迹的概念；Northern印迹分析的基本过程；实时RT-PCR的基本原理。转基因技术、转基因动物和基因转染细胞的概念；转基因动物和基因转染细胞的基本过程；基因打靶的概念；RNA干扰技术的概念；RNA干扰的基本原理；RNA干扰技术的基本流程。 对于重点内容，教学过程中应注意着重强调，以提醒学生注意。 难点：PCR技术的基本原理；Southern印迹分析的基本原理；Southern印迹分析的基本过程。Northern印迹分析的基本过程；实时RT-PCR的基本原理。RNA干扰的基本原理；RNA干扰技术的基本流程。 有关基因操作的技术方法，由于感性认识缺乏，理解起来较困难，应多使用图片和动画以助学生理解。 | ||||||||||||
| 教研室审阅意见： 教研室主任签名： 年 月 日 | ||||||||||||
| 基本内容 | 教学手段 | 课堂设计和时间安排 | ||||||||||
| 第十九章基因操作 （一) ――――――――――――――――― 基因工程： 又叫DNA重组技术、DNA克隆、分子克隆。特定基因（目的基因、外源DNA片段)的制备、分离、鉴定、改造及在不同生物间的转移技术。核心操作对象是DNA分子 基因操作：所有涉及DNA和RNA的操作技术 | （★－重点，☆－难点)
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| 第一节 核酸的理化性质 核酸的一般理化特性 1. 核酸的酸碱及溶解度性质 ¨ 核酸具有磷酸基和碱基，两性大分子，偏酸性 ¨ DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5 ¨ 可与金属离子成盐，不溶于乙醇或异丙醇 2. 核酸的高分子性质 ¨ 粘度：DNA>RNA，dsDNA>ssDNA ¨ 离心场的沉降行为 3. 核酸的紫外吸收 ¨ OD260: 单核苷酸>ssDNA或RNA>dsDNA | 讨论 简图 动画 | ★☆结合图示讲解并强调：核酸的一般理化性质。 (8分钟)
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| 核酸分子杂交的原理 1. 原理 • 定义 理化因素作用下，DNA双链解开形成两条单链的过程 • 方法 过量酸、碱、加热、变性试剂（尿素、酰胺、乙醇) • 变性后理化性质的变化 OD260增高，粘度下降，比旋度下降，浮力密度升高，酸碱滴定曲线改变，生物活性丧失 2. DNA复性 DNA复性：适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象 • 退火annealing：热变性的DNA经缓慢冷却即可复性 • 退火时DNA的复性速度受温度影响，低于Tm 25℃时，DNA复性条件最佳 • 减色效应：DNA复性时，其溶液OD260降低 3. 核酸分子杂交（hybridization) ¨ 杂化双链：DNA变性后进行复性过程中，将不同种类的ssDNA或RNA分子放在同一溶液中，单链分子间存在碱基配对关系，条件适宜（温度、离子)就可以形成分子间杂化双链（heteroduplex) ¨ 类型：DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA 3. 核酸分子杂交的应用 ¨ 研究DNA分子中某一种基因的位置 ¨ 鉴定两种核酸分子间的序列相似性 ¨ 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 ¨ 基因芯片技术的基础 | 讨论 | 讲解：简单回顾生物化学的DNA的变性与复性内容，借此说明核酸分子杂交的原理。 (2分钟)
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| 第二节 基因的获取 用PCR技术获取基因 1. PCR技术（聚合酶链式反应，polymerase chain reaction) ¨ 是根据DNA半保留复制和DNA聚合酶的特性建立起 来的体外复制扩增DNA片段的技术 ¨ 可将微量目的DNA在体外扩增100万倍以上 ¨ Kary B. Mulis，1985年发明，1993年诺贝尔化学奖 ¨ 由一对分别5’端和3’端寡核苷酸片段为引物，在4种dNTPs和耐热DNA聚合酶的作用下，合成复制模板DNA，使目的DNA得到体外扩增的技术 2. PCR技术原理 • 由一对分别5’端和3’端寡核苷酸片段为引物，在4种dNTPs和耐热DNA聚合酶的作用下，合成复制模板DNA，使目的DNA得到体外扩增的技术 3. 引物的化学本质是什么？ 单链寡核苷酸DNA或RNA片段 ¢ DNA复制引物：单链RNA片段 ¢ PCR引物：单链DNA片段 4. PCR基本步骤 PCR循环三步曲： ¢ 变性（denaturation) ¢ 退火（annealing) ¢ 延伸（extension) 5. PCR反应温度设置的依据 ¢ 变性：94℃左右，氢键断裂，不影响单链构象 ¢ 退火：55℃左右，氢键形成，错配几率低 ¢ 延伸：70℃左右，氢键形成/断裂相持，酶活性温度 6. PCR反应系统组分 ¢ 模板DNA：高温变性 ¢ Taq DNA聚合酶：耐高温 ¢ dNTP：底物 ¢ 引物：DNA，人工合成 ¢ Mg2+：酶活性激活剂 7. 模板DNA： ¢ DNA、RNA都可以作为模板，如果是RNA可以先反转录成cDNA再作模板。模板DNA用量为102-105拷贝 ¢ 1μg人基因组DNA=3 × 105单拷贝 8. 特异性引物： ¢ 长度：15-30 mer（核苷酸数) ¢ G+C含量：40%-60% ¢ 退火温度：Tm=4（G+C)+ 2（A+T) ¢ 引物序列：1对引物间不能有互补序列 ¢ 引物3’端：必须严格与模板互补 ¢ 引物5’端：可加酶、标记物、引入突变位点等 ¢ 引物浓度：0.1-1μmol/L 9. DNA聚合酶： ¢ Klenow片段：PCR早期，使用的大肠杆菌DNA聚合酶I的片段，不耐高温（93-95℃)，需不断添加酶 ¢ Taq DNA聚合酶：水生栖热菌（Thermus aquaticus) ¢ 延伸速度：72℃下，延伸速度60 nt/s ¢ 半衰期：92 ℃ >2h，95℃ 40min，97 ℃ 5min 10. PCR产物 ¨ PCR扩增终产物: 介于两条退火引物5′末端之间的双链DNA片段，指数增长2n ¨ 引物延伸产物： 比两引物限定区长的延伸产物，仅发生在以原始模板DNA为模板的扩增过程中，倍数扩增2n ¨ PCR平台效应（plateau effect): PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入静止期即平台期 ¨ PCR扩增终产物产量： • Y=A（1+E)n Y: 扩增产物的量 A: 最初靶DNA分子数 E: PCR扩增效率 n: 循环次数 E＝100％, A=1，Y=2n >>2n (引物延伸产物量) ¨ PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析 | 讨论 简图 动画 | ★☆结合图示讲解并强调：PCR技术的基本原理；PCR技术的应用。 (30分钟)
――――第1节课结束―――
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| 用反转录-PCR技术获取基因 1. 反转录-PCR技术 ¨ 以mRNA为模板，先进行逆转录得到cDNA（complementary DNA，cDNA)，再进行PCR反应 ¨ RT-PCR与PCR区别： • 模板为mRNA • 需要逆转录酶 • 产物为cDNA ¨ 逆转录酶 ① AMV（禽成髓细胞性白血病病毒) Avian myeloblastosis virus 酶活性最适温度42 ℃ ② MML中国卫生人才网V（小鼠白血病病毒) Moloney murine leukemia virus 最适温度37 ℃ 2. PCR技术的其他用途 ¨ 基因的体外突变 ¨ DNA和RNA的微量分析 ¨ DNA序列测定 ¨ 基因突变分析 3. PCR应用举例 ① 遗传病诊断：镰状细胞贫血www.lindalemus.com/rencai/ β6 Glu-Val (GAG-GUG) PCR扩增β6 DNA区域 ② 传染病诊断：HBV和HIV ③ 肿瘤分子标志诊断： bcr-abl(慢性粒细胞白血病) PML/RARα(急性早幼粒细胞白血病) ④ 个体识别：亲子鉴定与刑事侦破 ⑤ 生物考古：恐龙复活？ | 讨论 简图 动画 | 讲解： 反转录PCR技术的基本原理；PCR技术的应用。 (10分钟)
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| 从基因文库中获取基因 1. 基因文库（gene library )： 包括基因组文库（genomic library)和cDNA文库（cDNA library)，可作为模板，经PCR或分子杂交 而获得基因 2. 基因组文库： 含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体 3. cDNA文库： 含有某一组织细胞中全部mRNA逆转录得到的cDNA片段的克隆群体，具有时空特异性 4. 基因组文库的构建步骤 ①提取染色体DNA：机械法或限制性内切酶切割 ② 获得适当大小的DNA片段 ③ 插入适当克隆载体 ④ 转入受体菌扩增 ⑤ 得基因组文库 5. cDNA文库的构建步骤 ① 提取细胞总mRNA ② 反转录酶、聚合酶作用，双链cDNA ③ 插入适当克隆载体 ④ 转入受体菌扩增 ⑤ 得cDNA文库 | 讨论 简图 动画 | ★☆结合图示讲解并强调：基因文库、cDNA文库的概念。基因文库、cDNA文库的构建及获取基因的过程。 (25分钟)
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| 人工合成基因 已知目的基因的碱基序列，可用DNA合成仪直接合成此基因的各个片段，最后用其他反应将片段连接 优点： • 可修饰基因 • 可在基因两端涉及接头 • 可选择各种生物偏爱的密码子 | 讨论 | 讲解： 反转录PCR技术的基本原理；PCR技术的应用。 (5分钟)
――――第2节课结束―――
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| 第三节 基因的克隆 1. 基因克隆的概念 克隆clone： 通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体 基因克隆gene cloning： 把生物体中的一个基因通过无性繁殖转入另一个生物体内的过程。通过基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是DNA分子，所以也称其为DNA克隆，是基因操作的核心技术 2. 基因重组gene recombination 利用DNA连接酶，将不同DNA片段连接起来构成一个新DNA分子的过程，是分子生物学的核心技术 u 自然界不同生物间的基因重组经常发生 u 这启发人们在20世纪70年代建立此技术，改变生物的遗传信息 u 胰岛素、生长激素、干扰素、细胞因子及多种单克隆抗体等基因工程药物已上市 u 抗病、抗虫、品质改良的新品种、转基因大豆、棉花、玉米和油菜的面积大增 3. 限制酶的概念 （1)限制性内切酶（Endonucleosase) • 专一识别DNA序列，在识别位点将其双链切断 • 限制性内切酶（Endonucleosase)的发现：50年代初发现细菌的限制－修饰系统 • 细菌的限制与修饰分子机理： • hsd M---限制性甲基化酶 • hsd S ---控制两个系统的表达 （2)绝大多数的II类限制性内切酶在底物DNA上的识别顺序为4~8个核苷酸回文序列（Palindromic) （3)切割位点： 平头末端（ blunt end) 和 粘性末端（sticky end) 4. 基因克隆的必要条件 （1)克隆载体vector • 携带目的基因进入宿主细胞的DNA分子 • 载体来源：质粒、噬菌体、粘粒、病毒载体 • 质粒是最常用的克隆载体 （2)必要条件： 目的基因：原核、真核基因… • 克隆载体：质粒、病毒载体… • 工具酶类：内切酶、连接酶… • 宿主细胞：细菌、动物细胞… | 讨论 简图 动画 | ★ ☆结合图示讲解并强调： ★ ☆基因克隆的概念。(5分钟) ★ ☆限制酶的概念。(10分钟) ★ ☆基因克隆的必要条件。(25分钟)
――――第3节课结束―――
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| 小 结 | 核酸的理化特性。 基因的获取方法。 基因克隆的必要条件 (2分钟)
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| 复 习 思 考 题 、 作 业 题 | 1. 什么是DNA的增色效应？ 2. 如何判断核酸样品的纯度？ 3. 核酸分子杂交的原理是什么？ 4. 核酸复性与退火所依据的原则是什么？ 5. 基因获取的基本方法有哪些？ 6. 设计PCR引物需要考虑的因素有哪些？ 7. PCR引物如何与模板结合？ 8.如何设定PCR的反应温度？ 9. PCR引物如何与模板结合？ 10. PCR技术的基本过程是什么？ 11. 什么是基因克隆？ 12. 什么是限制酶？它在基因克隆操作中有何用途？ 13. 基因克隆的必要条件有哪些？
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| 下 次 课 预 习 要 点 | 1. 基因克隆的基本步骤。 2. 原核表达系统的特点；真核表达系统的特点；基因转染的概念。 3. 直接分析基因一级结构的方法；基因定向突变的概念。 4. 核酸探针的概念；Southern印迹分析的基本原理；Southern印迹分析的基本过程。
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| 实 施 情 况 及 分 析 |
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| 基本内容 | 教学手段 | 课堂设计和时间安排 | ||||||||||
| 第十九章基因操作 （二) ――――――――――――――――― | （★－重点，☆－难点)
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| 第三节 基因的克隆 1. 基因克隆的基本步骤 ① 酶切：制备目的基因和载体 ② 连接：目的基因和载体的连接 ③ 转化：重组的DNA导入受体细胞 ④ 筛选：DNA重组体的筛选和鉴定 （1)目的基因的获得：PCR、RT-PCR、基因组或cDNA文库、人工合成 （2)载体的选择 （3)目的基因与载体的连接 粘性末端、人工接头、同聚体尾、平端连接 （4) 重组DNA导入宿主细胞 • 转化（transformation) • 转导（infection) • 转染（transfection) ¢ 转化 感受态细菌主动或被动摄取外源DNA的过程 l 热激法是最常用的转化方法 l CaCl2处理，增加细胞壁通透性(0-50C) ，得感受态细菌 l 420C将细菌与重组的质粒DNA温育 （5) 重组DNA的筛选鉴定 • 遗传学方法：抗生素、蓝白斑筛选 • 核酸杂交法 • 菌落PCR法 • 免疫学方法 蓝白斑筛选过程： ¨ α互补：载体具有lacZ的调控序列和氨基端编码区，宿主细胞具有lacZ的羧基端编码区 ¨ IPTG存在时β-半乳糖苷酶将底物X-Gal转化为蓝色产物， 得到蓝色菌落 ¨ 载体的多克隆区域，克隆上插入片段导致α-肽编码区的 破坏，使β-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落 2. 克隆过程举例：结合课题项目讲解 | 讨论 简图 动画 | ★ ☆结合图示讲解并强调： 基因克隆的基本步骤。(25分钟) 基因克隆过程的应用举例。(15分钟)
――――第1节课结束―――
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| 第四节 克隆基因的表达 原核表达系统 1. 表达系统 ¢ 原核细胞表达系统：大肠杆菌 ¢ 真核细胞表达系统： 酵母、昆虫、中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary Cell，CHO) （1)原核表达载体 ¢ pBV220、pET等，商品化供应 ¢ 结构特点： 携带克隆基因的表达载体，在原核生物中表达所必备的表达调控序列： （2)蛋白表达方式 ¢ 非融合表达 表达产物直接是单一目的蛋白 ¢ 融合表达 表达产物不仅仅含有目的蛋白，还带有一段融合的其他标签序列，用于检测和纯化。最后应用时，可能需要切除标签部分 （3)原核表达载体的优缺点 优点： ¢ 表达系统简单，容易操作 ¢ 成本低，易于大量生产 ¢ 生长周期短 缺点： ¢ 需要翻译后修饰的蛋白，不能用此表达系统 | 讨论 简图 动画 | ★☆结合图示讲解并强调：原核表达系统的特点。 (10分钟)
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| （4)真核表达系统 ¢ 质粒载体和病毒载体 ¢ 调控表达元件最初多来源于病毒 ¢ 将重组真核载体导入真核细胞的过程称为基因转染 （5)真核细胞表达系统的优缺点 优点： ¢ 可表达需要翻译后修饰的蛋白（糖基化修饰) 高雪病（葡糖脑苷脂沉积病)：缺乏β－葡萄糖脑苷脂酶 ，吞噬糖脂的巨噬细胞使肝脾肿大 缺点： ¢ 表达系统相对复杂 ¢ 成本高 ¢ 生长周期长 | 讨论 简图 动画 | ★☆结合图示讲解并强调：真核表达系统的特点。基因转染的概念 (10分钟)
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| 第五节 基因结构的分析 基因的一级结构分析 1. 直接分析基因的一级结构 • 双脱氧末端终止法（Sanger法) • 化学裂解法（Maxam-Gilbert法) ¨ 双脱氧末端终止法原理 用4种2’，3’-双脱氧核苷酸ddNTP代替部分脱氧核苷酸dNTP作为底物，进行DNA合成反应，从而获得在不同部位终止反应的大小不同的DNA链，经高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE分离，对DNA序列进行分析 2. 间接分析基因的一级结构 方法： 限制性片段长度多态性RFLP PCR-限制性片段长度多态性PCR-RFLP 单链构象多态性分析SSCP 用途： 粗略分析未知DNA片段 分析过长的DNA片段 大量筛选DNA样本 3. RNA水平分析基因的结构 剪接异构体、剪接部位、内含子位置分析 RNA酶保护试验：只能切断单链RNA | 讨论 简图 动画 | ★ ☆结合图示讲解并强调：Sanger法DNA序列测定的基本原理。(15分钟) ★ RNA酶保护试验的基本原理。 (5分钟)
――――第2节课结束―――
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| 基因的改造 • PCR法改变基因一级结构（碱基组成的变化) • 基因序列中的特定碱基称作基因定向突变 | 讨论 简图 动画 | ★☆结合图示讲解并强调：基因定向突变的概念及基本程序。 (10分钟)
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| 第六节 基因的拷贝数分析 Southern blot基本原理： • 全基因组DNA样品制备，电泳分离，转移到固相膜支持物，与探针变性复性，利用核酸分子杂交的碱基互补配对原理，检测目的基因中的互补序列，根据探针信号的位置和次数判断基因拷贝数 • 检测对象：用DNA探针检测DNA样品 Southern blot基本过程： ¨ 模板DNA的准备：酶切，变性，电泳，转膜 ¨ 核酸探针的标记：DNA，cDNA和寡核苷酸探针 化学法和酶促法 ¨ 核酸杂交反应：探针变性，杂交，洗膜，自显影 | 讨论 简图 动画 | ★ ☆结合图示讲解并强调：核酸探针的概念；Southern印迹分析的基本原理。(15分钟) ★ Southern印迹分析的基本过程。(15分钟)
――――第3节课结束―――
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| 小 结 | 基因克隆的基本步骤。 原核表达系统的特点；真核表达系统的特点；基因转染的概念。 直接分析基因一级结构的方法；基因定向突变的概念。 核酸探针的概念；Southern印迹分析的基本原理和基本过程。 (2分钟)
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| 复 习 思 考 题 、 作 业 题 | 1. 基因克隆的基本步骤包括哪些？ 2. 常用的基因克隆载体有哪些？ 3. 怎样进行目的基因与载体DNA的重组操作？ 4. 将重组DNA导入宿主细胞中进行扩增的方法有哪些？ 5. 怎样筛选和鉴定目的基因？ 6. 如何实现克隆基因在原核或真核生物中表达？ 7. 影响克隆基因表达的因素有哪些？ 8. 什么是穿梭载体？ 9. 什么是基因转染和基因转染细胞？ 10. 原核表达系统和真核表达系统的优缺点是什么？ 11. 双脱氧末端终止法直接分析DNA一级结构的基本原理是什么？ 12. RNA水平分析基因结构的基本原理是什么？ 13. 什么是RNA酶保护试验？ 14. 什么是核酸探针？怎样进行核酸探针的标记？ 15. Southern印迹分析的基本过程是怎样的？ 16. 常用的基因拷贝数的分析方法有哪些？
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| 下 次 课 预 习 要 点 | 1. Northern印迹的概念；Northern印迹分析的基本过程；实时RT-PCR的基本原理。 2. 转基因技术、转基因动物和基因转染细胞的概念。 3. 转基因动物和基因转染细胞的基本过程；基因打靶的概念。 4. RNA干扰技术的概念；RNA干扰的基本原理；RNA干扰技术的基本流程。
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| 实 施 情 况 及 分 析 |
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| 基本内容 | 教学手段 | 课堂设计和时间安排
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| 第十九章基因操作 （三) ――――――――――――――――― | （★－重点，☆－难点)
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| 第七节 基因表达的分析 Northern印迹定性分析基因的表达 ¢ 检测对象：利用DNA探针检测RNA样品 ¢ 基本原理：DNA探针与RNA样品变性复性，核酸分子杂交的碱基互补配对原理 ¢ 关键技术：RNA样品的制备、电泳分离 ¢ 基本步骤：与Southern blot类似 ¢ 防止RNA降解：RNA酶抑制剂DEPC 处理 ¢ 应用：定性和相对定量分析RNA | 讨论 简图 动画 | ★ ☆结合图示讲解并强调： Northern印迹的概念；Northern印迹分析的基本过程。(15分钟)
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| RT-PCR定量分析基因的表达 | 讨论 简图 动画 | ★ ☆结合图示讲解并强调： RT-PCR定量分析基因表达的基本过程。(10分钟)
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| 实时RT-PCR定量分析基因的表达 | 讨论 简图 动画 | ★ ☆结合图示讲解并强调： 实时RT-PCR定量分析基因表达的基本过程。(15分钟)
――――第1节课结束―――
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| 第八节 基因功能的分析 转基因技术用于基因功能的研究 ¨ 转基因技术：将外源基因转移到受体细胞的染色体上，使其在受体细胞中表达并发挥其功能的基因操作方法 1. 转基因动物模型用于基因功能的研究 2. 基因转染细胞模型用于基因功能的研究 ¨ 转基因动物：应用转基因技术培育的携带外源基因的动物 ¨ 基本过程： -转基因载体的构建 -转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞 -转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫 -转基因动物的鉴定 ¨ 基因转染细胞： -细胞水平上经过转基因操作获得的细胞模型 ¨ 基本过程： -转基因载体的构建 -转基因载体转染受体细胞 -转基因细胞的鉴定，获得表达外源基因的细胞株 ¨ 瞬时转染 transient transfection 不对转染细胞进行筛选，一般外源基因的表达及其对细胞的影响在48小时至72小时达到高峰，以后由于未接受基因转染细胞的大量扩增，转染细胞很快成为非优势生长而消失 ¨ 稳定转染 stable transfection 即对转染细胞在压力选择（如加入抗生素)下培养，不含有导入基因的细胞在选择中死亡，获得了基因的细胞生存下来并成为稳定表达外源基因的克隆细胞株 ¨ 可诱导表达 inducible expression 选择含诱导型启动子的表达载体，使外源基因在细胞内保持关闭状态，只有加入诱导剂后基因才开始表达，解决细胞毒性问题 | 讨论 简图 动画 | ★☆结合图示讲解并强调：转基因技术、转基因动物和基因转染细胞的概念。瞬时转染与稳定转染 (20分钟) 转基因动物和基因转染细胞的基本过程。 (20分钟)
――――第2节课结束―――
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| 基因打靶技术用于基因功能的研究 1. 基因打靶：通过同源重组定向地从细胞染色 体上移除或移入特定基因的过程 ¨ 基因敲除KO：定向移除特定基因 ¨ 基因敲入KI：定向移入特定基因 2. 基因敲除: 体外重组（载体构建)与体内重组（同源重组)相结合的典型例子 ¨ 基因敲除小鼠：是最常用的基因敲除动物 ¨ 基本步骤： -载体构建 -基因转染 -植入小鼠子宫 -筛选获得基因敲除动物 | 讨论 简图 动画 | ★☆结合图示讲解并强调：基因打靶的概念。基因敲除技术的基本原理。 (15分钟)
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| RNA干扰技术用于基因功能的研究 1. RNA 干涉(RNA interference，RNAi) 指由短双链RNA诱导的同源RNA降解的过程 2. RNAi技术： ¨ 指人工建立的利用体外合成或在细胞内表达的短双链RNA（21-23 nt)抑制细胞内特定基因表达的技术 ¨ 是机体的正常防御机制 3. RNAi技术的基本原理： ¨ 短双链RNA （siRNA)，结合激活胞内无活性或低活性的 Dicer酶复合物（核酸内切酶和解旋酶等组成)， 形成RNA 诱导的沉默复合物（RISC),特异地切割 细胞内的异常双链RNA，产生短双链RNA （siRNA)，通过此放大效应清除靶RNA ¨ 短双链RNA（siRNA)发挥着特异性识别和定位的重要作用 4. RNAi技术的基本流程： ¨ 流程： • 确定干扰靶点： AA（N19)TT、AA（N21) • 设计siRNA序列：3’端UU或dTdT单链 • 化学法合成siRNA或构建siRNA表达载体 • siRNA的导入：目标RNA的含量检测 ¨ 应用： • 筛选药物靶点：特异性和候选序列？ • 发展基于RNAi原理的药物：口服？ | 讨论 简图 动画 | ★ ☆结合图示和研究进展讲解并强调：RNA干扰技术的概念(5分钟) ★ RNA干扰的基本原理；(15分钟) ★ RNA干扰技术的基本流程。 (5分钟)
――――第3节课结束―――
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| 小 结 | Northern印迹分析的基本过程；实时RT-PCR的基本原理。 转基因技术、转基因动物和基因转染细胞。 转基因动物和基因转染细胞的基本过程。 RNA干扰的基本原理；RNA干扰技术的基本流程。 (5分钟)
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| 复 习 思 考 题 、 作 业 题 | 1. 常用的RNA定性和定量分析方法有哪些？ 2. 实时PCR具有哪些特点？ 3. 蛋白质水平上定性和定量分析基因表达的方法有哪些？ 4. 什么是转基因技术？什么是转基因动物？什么是基因转染细胞？ 5. 转基因的基本过程是怎样的？ 6. 哪些技术方法可应用于转基因动物的鉴定？ 7. 转基因动物在医药、农业和生物学领域有哪些方面的应用？ 8. 什么是稳定转染细胞？ 9. 怎样构建打靶载体？ 10. 基因敲除的基本流程是怎样的？ 11. RNA干扰基本原理是什么？
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| 下 次 课 预 习 要 点 | 1. 基因诊断的基本概念。 2. 用于连锁分析的遗传标志；基因缺失或插入的诊断；点突变的诊断。
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| 实 施 情 况 及 分 析 |
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启动子