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生物化学与分子生物学-实验指导:标准实验报告

生物化学与分子生物学:实验指导 标准实验报告:实验二十三? 血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定(综合性实验)【实验目的】本实验采用多种实验技术方法以分离、纯化和鉴定血清中的γ-球蛋白,达到训练综合运用及掌握电泳、离心、层析等基本的生物化学实验操作技术的目的。【实验原理】血清中含有多种蛋白质。不同种类的蛋白质其分子量、溶解度以及在一定条件下带电荷的情况不同,可根据这些性质的差别,分离及提纯蛋白质。1. 利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐中的溶解度的

实验二十三? 血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定

(综合性实验)

【实验目的】

本实验采用多种实验技术方法以分离、纯化和鉴定血清中的γ-球蛋白,达到训练综合运用及掌握电泳、离心、层析等基本的生物化学实验操作技术的目的。

【实验原理】

血清中含有多种蛋白质。不同种类的蛋白质其分子量、溶解度以及在一定条件下带电荷的情况不同,可根据这些性质的差别,分离及提纯蛋白质。

1. 利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐中的溶解度的差异,采用盐析法进行分离。半饱和硫酸铵可使球蛋白沉淀析出,而清蛋白仍溶解在溶液中,经过离心,沉淀部分即为含γ-球蛋白的粗制品。

2. 盐析得到的蛋白质中含有大量的中性盐,会妨碍蛋白质的进一步纯化,因此须除去。采用凝胶层析法,利用蛋白质与无机盐之间的分子量差异,达到去盐的目的。

3. 纯化的γ-球蛋白利用醋酸纤维薄膜电泳鉴定其纯度。

【操作步骤】

1. 分段盐析:

⑴ 取血清1.0 mL加入离心管中,加磷酸盐缓冲液(PBS)1.0 mL,混匀。再逐滴加入pH 7.2饱和硫酸铵液2.0 mL,边加边摇匀。静置20分钟后离心(3000 rpm×10分钟),倾去上清液(此液中主要含清蛋白)并尽量倒净,沉淀为球蛋白。

⑵ 将上述离心管中的沉淀用1.0 mLPBS搅拌溶解,再逐滴加入饱和硫酸铵液0.5 mL,混匀,静置20分钟后离心(3000 rpm×10医学全.在线分钟),倾去上清液(此液中主要含α、β-球蛋白)并尽量倒净,其沉淀为初www.lindalemus.com/kuaiji/步纯化的γ-球蛋白。如要获得更纯的γ-球蛋白,可重复此过程1次,最后用1.0mL PBS将沉淀溶解。

2. 脱盐:

⑴ 装柱:取层析柱,关紧下端出口,加蒸馏水少许,缓慢加入葡聚糖凝胶G-25悬液,待底部沉积1 cm厚的凝胶后,打开下端出口,继续加入凝胶至凝胶沉积15 cm高,并注意保持凝胶床表面平整,然后经PBS流洗平衡。

⑵ 上样与洗脱:小心控制凝胶柱下端出口开关,使柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床表面,关紧下端出口。用滴管吸取γ-球蛋白液,小心缓慢地沿层析柱内壁加到凝胶床表面上,注意不要破坏凝胶床表面的平整。打开下端出口,使样品进入凝胶床,小心加入少许PBS于柱内,待进入凝胶床后再加入少许的PBS,如此重复三次,以洗净柱内壁上的样品溶液,然后可加入多量的PBS进行洗脱,流速为5滴/分。

⑶ 收集:事先应准备好10支试管,于加样开始后立即收集洗脱液。每收集约1.0 mL换一管。

⑷ 检查:取瓷比色盘2个(一个为黑色背景,另一个为白色背景),按洗脱液的管号顺序分别取1滴滴于比色盘中,前者各加10%三氯乙酸5滴;后者各加纳氏试剂1滴。将检查结果用“-,+,+”等符号记录于表中。选取蛋白含量高且不含铵离子的样品液进行纯度鉴定。

3. 纯度鉴定:

⑴ 取于巴比妥缓冲液中充分浸湿醋酸纤维素薄膜1张,用滤纸吸去多余的水分,于无光泽面点样。

⑵ 在距膜条一端约2cm处,用X光软片蘸取全血清和纯化的γ-球蛋白样品液(第3管)分别点于膜条上。

⑶ 将巴比妥缓冲液加于电泳槽内,再将点样后的膜条放置于电泳槽槽架上。放置时膜条的无光泽面应向下,点样端置于阴极,膜条与滤纸需贴紧。

⑷ 接通电源,以150V恒压电泳约45分钟。

⑸ 通电完毕后,用镊子将膜条取出,浸于盛有氨基黑10B的染色液中,染色1分钟取出,立即浸入盛有漂洗液的培养皿中,反复漂洗数次,直到背景漂净为止。用滤纸吸干膜条,比较纯化前与纯化后电泳图谱的变化,以确定样品的纯度。

结果和计算

1. 凝胶柱分离流洗结果:

管号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

蛋白沉淀

-

+

++

-

-

-

-

-

-

-

铵离子

-

-

-

-

-

+

++

++

++

+

2. 电泳鉴定结果:

 

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纯化前血清蛋白的醋纤膜电泳

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纯化后血清蛋白的醋纤膜电泳

【结论和讨论】

1. 电泳鉴定结果显示,血清蛋白样品经分段盐析、凝胶层析等技术方法分离纯化后得到了较纯的γ-球蛋白。因此,采用上述实验方法能够从血清中纯化γ-球蛋白。

2. 第3支试管中的收集液为蛋白含量最高且不含铵离子的样品液,因此通过凝胶层析能有效去除样品中的盐离子成分。

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