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| 实验二十五 酶促反应动力学实验的设计 |
【实验目的】 酶促反应动力学研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素。影响酶促反应的因素主要包括酶浓度、底物浓度、温度、pH、抑制剂和激活剂。本实验的目的即是通过设计一定的实验方案，以分析研究各种因素对酶促反应速度的影响。各实验小组可在以下实验项目中选择一项，通过检索参考文献资料，组织课堂讨论，设计完成实验方案，并通过具体实验操作以检验实验方案的可行性和正确性。 （一)温度对唾液淀粉酶活性的影响 【实验原理】 酶作为生物催化剂与一般催化剂一样呈现温度效应，酶促反应开始时，反应速度随温度升高而增快，达到最大反应速度时的温度称为某种酶的最适温度。由于绝大多数酶是有活性的蛋白质，当达到最适温度后，继续升高温度，引起蛋白质变性，酶促反应速度反而逐步下降，以至完全停止。 酶的最适温度不是一个常数，它与作用时间长短有关。测定酶活性均在酶促反应最适温度下进行。常用恒温水浴保持温度恒定。大多数动物来源的酶最适温度为37~40℃。 本设计性实验以人唾液淀粉酶为例，观察高温（沸水浴)、最适温度（37℃水浴)和低温（冰水浴)环境对酶活性的影响，并根据底物即淀粉水解的快慢来判断酶活性的高低。 淀粉经淀粉酶催化水解为葡萄糖的不同阶段，与碘试剂作用的颜色反应如下：淀粉（蓝色)→紫色糊精（紫色)→红色糊精（红色)→无色糊精（不显色)→麦芽糖（不显色)→葡萄糖（不显色)。 【实验试剂和器材】 1. 试剂 ⑴ 1/15 mol/LpH6.8磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsaline，PBS)：称取NaH2PO4·2H2O10.4 g，溶于1000 mL蒸馏水中，即为1/15 mol/L NaH2PO4液。称取Na2HPO4·12H2O23.88 g，溶于1000 mL蒸馏水中，即为1/15 mol/L Na2HPO4液。 取1/15www.lindalemus.com/job/ mol/LNaH2PO4液51 mL，加1/15 mol/L Na2HPO4液49 mL，混匀，即为1/15 mol/L pH 6.8磷酸盐缓冲液。 ⑵ 1%淀粉液。 ⑶ 0.3%稀碘液：溶解2 g KI于20 mL蒸馏水中，加入1g碘，于量筒中稀释到300 mL。 ⑷ 0.9%NaCl。 2. 器材 ⑴ 试管及试管架。 ⑵ 滴管。 ⑶ 刻度吸量管。 ⑷ 恒温水浴、冰水浴、沸水浴。 ⑸ 白瓷比色盘。 【设计提示】 1. 本实验所用的酶是唾液淀粉酶，底物是淀粉。怎样收集并稀释人唾液淀粉酶？ 2. 淀粉水解后的产物是什么？怎样才能判断淀粉的水解程度？ 3. 将设计的不同温度组、所用试剂、操作步骤等，以表格形式列出。 4. 讨论并确定最佳实验设计方案。 【实验注意事项】 1. 在磷酸盐缓冲液中，人唾液淀粉酶在pH6.8时具有最大活性。Cl-为其激活剂。 2. 观察不同温度对酶活性的影响时，温度之间的差别应较大。 （二)pH对唾液淀粉酶活性的影响 【实验原理】 酶的催化活性与环境pH有密切关系，通常各种酶只在一定pH范围内才有活性，酶活性最高时的pH称为酶的最适pH。高于或低于此pH时酶的活性逐渐降低。不同的酶最适pH也不同，如胃蛋白酶的最适pH为1.5~2.5，胰蛋白酶的最适pH为8.0。 酶的最适pH不是酶的特征性物理常数。对于同一种酶，其最适pH因缓冲液和底物的性质不同而有差异。如人唾液淀粉酶最适pH为6.8，但在磷酸盐缓冲液中，其最适pH为6.4~6.6，而在乙酸缓冲液中则为5.6。 本实验以人唾液淀粉酶为例，观察不同pH环境对酶活性的影响，并根据底物即淀粉水解的快慢来判断酶活性的高低。 【实验试剂和器材】 1. 试剂 ⑴ 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取Na2HPO4·2H2O35.61 g，溶于1000 mL蒸馏水中，即为0.2 mol/L Na2HPO4液。称取柠檬酸（C6H8O7·2H2O)21.01 g，溶于1000 mL蒸馏水中，即为0.1 mol/L柠檬酸液。 取0.2 mol/L Na2HPO4液10.30 mL，加0.1 mol/L柠檬酸液9.70 mL，混匀，即为pH5.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。 取0.2 mol/L Na2HPO4液11.37 mL，加0.1 mol/L柠檬酸液8.63 mL，混匀，即为pH5.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。 取0.2 mol/L Na2HPO4液12.63 mL，加0.1 mol/L柠檬酸液7.37 mL，混匀，即为pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。 取0.2 mol/L Na2HPO4液13.85 mL，加0.1 mol/L柠檬酸液6.15 mL，混匀，即为pH6.4磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。 取0.2 mol/L 中国卫生人才网Na2HPO4液15.45 mL，加0.1 mol/L柠檬酸液4.55 mL，混匀，即为pH6.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。 取0.2 mol/L Na2HPO4液18.17 mL，加0.1 mol/L柠檬酸液1.83 mL，混匀，即为pH7.4磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。 取0.2 mol/L Na2HPO4液19.45 mL，加0.1 mol/L柠檬酸液0.55 mL，混匀，即为pH8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。 ⑵ 1%淀粉液。 ⑶ 0.3%稀碘液：溶解2 g KI于20 mL蒸馏水中，加入1 g碘，于量筒中稀释到300 mL。 ⑷ 0.9%NaCl。 2. 器材 ⑴ 试管及试管架。 ⑵ 滴管。 ⑶ 刻度吸量管。 ⑷ 恒温水浴。 ⑸ 白瓷比色盘、秒表。 【设计提示】 1. 本实验所用的酶是唾液淀粉酶，底物是淀粉。怎样收集并稀释人唾液淀粉酶？ 2. 淀粉水解后的产物是什么？怎样才能判断淀粉的水解程度？ 3. 将设计的不同pH组、所用试剂、操作步骤等，以表格形式列出。 4. 讨论并确定最佳实验设计方案。 【实验注意事项】 1. 在磷酸盐缓冲液中，人唾液淀粉酶在pH6.8时具有最大活性。Cl-为其激活剂。 2. 观察不同pH对酶活性的影响时，pH之间的差别应较大。
（三)琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 【实验原理】 在化学结构上与底物类似的抑制剂，能与底物竞争和酶分子的活性中心结合，抑制酶的活性。抑制的程度随抑制剂与底物两者浓度的对比而定。如果底物浓度不变，酶活性的抑制程度随抑制剂的浓度增加而增加。反之，如果抑制剂的浓度不变，则酶活性随底物浓度的增加而逐渐恢复，这种类型的抑制称为竞争性抑制。 本设计性实验的目的是观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制。琥珀酸脱氢酶的活性，在隔绝空气的条件下，可从加入的甲烯蓝（methelene blue)的褪色情况来判断。
【实验试剂和器材】 1. 试剂 ⑴ 1/15 mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液：称取9.078 g KH2PO4溶于蒸馏水中，1000 mL容量瓶中稀释到刻度，为1/15 mol/L KH2PO4溶液。称取23.87 g Na2HPO4·12H2O溶于蒸馏水中，于1000 mL容量瓶中稀释到刻度，为1/15 mol/L Na2HPO4溶液。 取1/15 mol/L KH2PO4溶液175 mL，1/15 mol/L Na2HPO4溶液825 mL，混合，即为1/15 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液。 ⑵ 0.2mol/L琥珀酸。 ⑶ 0.02mol/L琥珀酸。 ⑷ 0.2mol/L丙二酸。 ⑸ 0.02mol/L丙二酸。 ⑹ 0.02%甲烯蓝（methelene blue)。 2. 器材 ⑴ 试管及试管架。 ⑵ 滴管、漏斗、纱布。 ⑶ 刻度吸量管。 ⑷ 高速组织捣碎机。 ⑸ 烧杯、研钵。 ⑹ 恒温水浴箱。 【设计提示】 1. 本实验以大鼠骨骼肌为实验材料以提取琥珀酸脱氢酶，底物是琥珀酸，竞争性抑制剂是丙二酸。 2. 怎样才能判断琥珀酸脱氢酶活性的高低？ 3. 将设计的不同浓度比组、所用试剂、操作步骤等，以表格形式列出。 4. 讨论并确定最佳实验设计方案。 【实验注意事项】 1. 琥珀酸脱氢酶在pH7.4的磷酸盐缓冲系统中有较高活性。 2. 设计时应使琥珀酸与丙二酸的浓度比有较大的差异。
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