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| 实验二十三 血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
【实验目的】 电泳、层析、离心及分光光度分析等技术方法常常广泛应用于生物样品中各种生物分子和分离纯化和鉴定。蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的前提和基础。本实验采用离心、层析和电泳等技术方法以分离纯化和鉴定血清中的γ-球蛋白，涉及到生物化学和相关学科的多种技术的配套应用，从而达到训练学生综合性运用及掌握这些基本生物化学与分子生物学实验操作技术的目的。本实验还涉及到质量控制和效益分析，使培养贴近实用、强化能力。 实验方案一 【实验原理】 血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16％，100 mL血清中约含1.2 g左右。不同种类的蛋白质其分子量、溶解度，以及在一定条件下带电荷的情况有所不同，可根据这些性质的差别，分离及提纯蛋白质。 首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离，沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。 用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。纯化后的γ-球蛋白可利用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定其纯度。 【实验试剂和器材】 1. 试剂 ⑴ 饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵（ammonium sulfate)850g于1000 mL蒸馏水中，在70~80℃水浴中搅拌溶解，用浓氨水调pH为7.2，室温放置过夜，瓶底析出白色结晶，上层液即为饱和硫酸铵溶液。 ⑵ 0.01 mol/L，pH 7.2磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS)：称取NaH2PO4·2H2O 1.56 g，溶于1000 mL蒸馏水中，即为0.01 mol/L NaH2PO4液。称取Na2HPO4·12H2O3.58 g，溶于1000 mL蒸馏水中，即为0.01 mol/L Na2HPO4液。 取0.01 mol/LNaH2PO4液280 mL，加0.01mol/L Na2HPO4液720 mL，混匀即为0.01 mol/L，pH 7.2磷酸盐缓冲液。 ⑶ 葡聚糖凝胶G-25（Sephadex G-25)：按每100 mL凝胶床体积需要葡聚糖凝胶G-25干胶 25g。称取所需量置于锥形瓶中。每克干胶加入蒸馏水约30 mL，用玻璃棒轻轻混匀，置于90~100℃水温中时时搅动，使气泡逸出。1h后取出，稍静置，倾去上清液细粒。也可于室温中浸泡24h，搅拌后稍静置，倾去上清液细粒，用蒸馏水洗涤2~3次，然后加0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡，备用。 ⑷ 10%三氯乙酸（acetocaustin)。 ⑸ 纳氏试剂（Nessler"s reagent)：① 贮存液：称取碘化钾(KI)7.58于250mL三角烧瓶中，用蒸馏水5mL溶解，再加入碘（I2)5.5 g溶解，加7~7.5 g Hg，用力振摇10 min(此时产生高热，须冷却)，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化汞钾液为止，过滤上清液倾入100 mL容量瓶，洗涤沉淀，洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至100 mL。② 应用液：取贮存液75mL加10％NaOH 350 mL，加水至500mL，混匀，置棕色瓶内，静置数日后取其上清液使用。 溶解115g HgI2（mercuric iodide)和80g KI（potassium iodide)于蒸馏水中，稀释至500 mL。加入500 mL6mol/L NaOH溶液，静置后吸取上清液使用。试剂宜放置于阴凉处。 ⑹ pH8.6，离子强度0.06巴比妥电极缓冲液（barbital buffer)：称取巴比妥钠（barbital sodium)12.76g，巴比妥（barbital)1.66 g，蒸馏水加热溶解后再加水至1000 mL。 ⑺ 氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B（amino black 10B)0.5 g，用甲醇50 mL，冰乙酸（glacial acetic acid)10 mL，蒸馏水40 mL溶解。 ⑻ 漂洗液：95%乙醇45 mL，加冰乙酸5 mL及蒸馏水50 mL。 2. 器材 ⑴ 电泳仪、电泳槽。 ⑵ 电动离心机、层析柱。 ⑶ 镊子、培养皿、X光软片、滤纸。 ⑷ 离心管、烧杯、量筒、滴管、小试管、吸管。 ⑸ 瓷比色盘（黑色和白色各一个)。 【实验步骤】 1. 分段盐析 ⑴ 取血清1.0 mL加入离心管中，加磷酸盐缓冲液（PBS)1.0 mL，混匀。再逐滴加入pH 7.2饱和硫酸铵液2.0 mL，边加边摇匀。静置30分钟后离心（3000 rpm×10分钟)，倾去上清液（此液中主要含清蛋白)并尽量倒净，沉淀为球蛋白。 ⑵ 将上述离心管中的沉淀用1.0 mL PBS搅拌溶解，再逐滴加入饱和硫酸铵液0.5 mL，混匀，静置30分钟后离心（3000 rpm×10分钟)，倾去上清液（此液中主要含α、β-球蛋白)并尽量倒净，其沉淀为初步纯化的γ-球蛋白。如要获得更纯的γ-球蛋白，可重复此过程1~2次，最后用1.0 mLPBS将沉淀溶解。 2. 脱盐 ⑴ 装柱：取层析柱（Φ1×20cm)，关紧下端出口，加蒸馏水少许，缓慢加入葡聚糖凝胶G-25悬液，待底部沉积1~2 cm厚的凝胶后，打开下端出口，继续加入凝胶至凝胶沉积10~15 cm高，注意凝胶床表面应平整。凝胶柱经PBS流洗平衡后即可使用。 ⑵ 上样与洗脱：小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床表面，关紧下端出口。用滴管吸取γ-球蛋白液，小心缓慢地沿层析柱内壁加到凝胶床表面上，注意不要破坏凝胶床表面的平整。打开下端出口，使样品进入凝胶床，小心加入少许PBS于柱内，待进入凝胶床后再加入少许的PBS，如此重复三次，以洗净柱内壁上的样品溶液，然后可加入多量的P卫生资格考试网BS进行洗脱，流速为4~5滴/分。 ⑶ 收集：事先应准备好10支试管，于加样开始后立即收集洗脱液。每收集约1.0 mL换一管。 ⑷ 检查：取瓷比色盘2个（一个为黑色背景，另一个为白色背景)，按洗脱液的管号顺序分别取1滴滴于比色盘中，前者各加10%三氯乙酸5滴，出现白色混浊或沉淀者即有蛋白质存在；后者各加纳氏试剂1滴，出现颜色反应者存在NH4+。将检查结果用“-，+，++”等符号记录于下表中。选取蛋白含量高且不含铵离子的样品液进行纯度鉴定。
3. 纯度鉴定 ⑴ 取2×8 cm大小的醋酸纤维素薄膜2张，于巴比妥缓冲液中充分浸湿。将浸透的膜条镊出后用滤纸吸去多余的水分，于无光泽面点样。 ⑵ 在距膜条一端约1.5 cm处，用X光软片蘸取全血清和纯化的γ-球蛋白样品液分别点于两张膜条上。如样品液较稀，可多点几次。 ⑶ 将巴比妥缓冲液加于电泳槽内，再将点样后的膜条放置于电泳槽槽架上，槽架上用四层滤纸作桥垫。放置时膜条的无光泽面应向下，点样端置于阴极，膜条与滤纸需贴紧。 ⑷ 接通电源，以150V恒压电泳约45分钟。 ⑸ 通电完毕后，用镊子将膜条取出，浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染色1~2分钟取出，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直到背景漂净为止。用滤纸吸干膜条，比较纯化前与纯化后电泳图谱的变化，以确定样品的纯度。 【实验注意事项】 1. 装柱是层析操作中最重要的一步。为使柱床装得均匀，务必做到凝胶悬液不稀不厚，一般浓度为l:l，进样及洗脱时切勿使床面暴露在空气中，不然柱床会出现气泡或分层现象。加样时必须均匀，切勿搅动床面，否则均会影响分离效果。 2. 葡聚糖凝胶使用后如短期不再用，为防止凝胶发霉可加防腐剂如0.02％叠氮钠，保存于4℃冰箱内。若长期不用，应脱水干燥保存，即将膨胀凝胶用水洗净。用多孔漏斗抽干后，逐次更换由稀到浓的乙醇溶液浸泡若干时间，最后一次用95％乙醇溶液浸泡脱水，然后用多孔漏斗抽干后，于60~80℃烘干贮存。 实验方案二 【实验原理】 首先利用硫酸铵分段盐析法将血清中的γ-球蛋白与清蛋白及α、β-球蛋白分离，再用葡聚糖凝胶过滤法除盐。脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。 α-球蛋白、β-球蛋白的pI<6.0；γ-球蛋白的pI为7.2左右。因此在pH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的γ-球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。因此随洗脱液流出的只有γ-球蛋白，从而使γ-球蛋白粗制品被纯化。其反应式如下：
用上述方法分离得到γ-球蛋白是否纯净单一，可将纯化前后的γ-球蛋白进行电泳比较而鉴定之。 【实验试剂和器材】 1. 试剂 ⑴ 饱和硫酸铵溶液。 ⑵ 0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)：A液：称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O) 2.730 g溶于蒸馏水中，加蒸馏水稀释至1000 mL。B液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.269 g，溶于蒸馏水中，加蒸馏水稀释至1000 mL。取A液77.5 mL，加于B液22.5 mL，混匀后即成。 ⑶ 葡聚糖凝胶（Sephadex G-25)： 按“实验方案一”溶胀后加0.0175 mol/L pH 6.3磷酸盐缓冲液平衡。 ⑷ DEAE-32(二乙基氨基乙基-32)纤维素：按100 mL柱床体积需DEAE纤维素14 g称取，每克加0.5mol/L盐酸溶液15mL，搅拌。放置30min(盐酸处理时间不可太长，否则DEAE纤维素变质)。加约l0倍量的蒸馏水搅拌，放置片刻，待纤维素下沉后，倾弃含细微悬浮物的上层液。如此反复数次。静置30min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液pH>4为止。加等体积l mol/L氢氧化钠溶液，使最终浓度约为0.5 mol/L氢氧化钠，搅拌后放置30min，以虹吸除去上层液体。同上用蒸馏水反复洗至pH<www.lindalemus.com/wszg/;7为止。虹吸去除上层液体，然后加入0.0175 mol/L pH 6.3磷酸盐缓冲液平衡，备用。 ⑸ 20%磺基水杨酸溶液。 ⑹ 纳氏试剂应用液。 ⑺ 0.9％氯化钠溶液。 ⑻ 醋酸纤维素薄膜电泳有关试剂。 2. 器材 ⑴ 电泳仪、电泳槽。 ⑵ 电动离心机、层析柱2支。 ⑶ 自动部份收集器 ⑷ 镊子、培养皿、X光软片、滤纸。 ⑸ 离心管、烧杯、量筒、滴管、小试管、吸管。 ⑹ 瓷比色盘（黑色和白色各一个)。 【实验步骤】 1. 盐析 ⑴ 取正常人血清2.0 mL于小试管中，加0.9％氯化钠溶液2.0 mL，边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液4.0 mL，混匀后于室温中放置10min，3000 r/min离心10 min。 ⑵ 小心倾去含有清蛋白的上清液，重复洗涤一次，于沉淀中加入0.0175 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)0.5~1.0 mL使之溶解。此液即为粗提的γ-球蛋白溶液。 2. 脱盐 ⑴ 装柱：洗净的层析柱保持垂直位置，关闭出口，柱内留下约2.0 mL洗脱液。一次性将葡聚糖凝胶G-25从塑料接口加入层析柱内，打开柱底部出口，调节流速0.3 mL/min。凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部，最后使凝胶床达20厘米高，床面上保持有洗脱液，操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”。在凝胶表面可盖一园形滤纸，以免加入液体时冲起胶粒。 ⑵ 上样与洗脱：可以在凝胶表面上加圆形尼龙滤布或滤纸使表面平整，小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面，关紧下端出口，用长滴管吸取盐析球蛋白溶液，小心缓慢加到凝胶床表面。打开下端出口，将流速控制在0.25 mL/min使样品进入凝胶床内。关闭出口，小心加入少量0.0175 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁。打开下端出口，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次，以洗净内壁上的样品溶液。然后可加入适量缓冲液开始洗脱。 加样开始应立即收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵，流速为0.5 mL/min，用自动部份收集器收集，每管1mL。 ⑶ 洗脱液中NH4+与蛋白质的检查：取瓷比色盘2个（一个为黑色背景，另一个为白色背景)，按洗脱液的管号顺序分别取1滴滴于比色盘中，前者各加20％磺基水杨酸溶液2滴，出现白色混浊或沉淀者即有蛋白质存在；后者各加纳氏试剂1滴，出现颜色反应者存在NH4+。将检查结果用“-，+，++”等符号记录于下表中。选取蛋白含量高且不含铵离子的样品液进行纯度鉴定。
合并球蛋白含量高的各管，混匀。除留少量作电泳鉴定外，其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。 3. 纯化 用DEAE纤维素装柱约8~10 cm高度，并用0.0175 mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱、分管收集。用20%磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况(装柱、上样、洗脱，收集及蛋白质检查等操作步骤同上)。 4. 浓缩 经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的γ-球蛋白液往往浓度较低。为便于鉴定，常需浓缩。收集较浓的纯化的γ-球蛋白溶液2 m1，按每mL加0.2~ 0.25 g Sephadex G-25干胶，摇动2~3min，3000 r/min离心5min。上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液。 5. 鉴定 取醋酸纤维素薄膜2条，分别将血清、脱盐后的球蛋白、DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的γ-球蛋白液等样品点上。然后参阅“实验方案一”进行电泳分离、染色。比较电泳结果。 【实验注意事项】 1. 凝胶及DEAE纤维处理期间，必须小心用倾泻法除去细小颗粒。这样可使凝胶及纤维素颗粒大小均匀，流速稳定，分离效果好。 2. 层析柱柱床应装均匀，进样及洗脱时切勿使床面暴露在空气中，加样时必须均匀，切勿搅动床面，否则均会影响分离效果。 3. 本法是利用γ-球蛋白的等电点与α-、β-球蛋白不同，用离子交换层析法进行分离的。因此层析过程中用的缓冲液pH要求精确。 4. 离子交换剂的再生和保存：离子交换剂的价格较贵，每次用后只需再生处理便能反复使用多次。处理方法是：交替用酸、碱处理，最后用水洗至接近中性。阳离子交换剂最后为Na+型，阴离子以Cl－型是最稳定型，故阴离子交换剂处理顺序为碱-水-酸-水。由于上述交换剂都是糖链结构。容易水解破坏，因此须避免强酸、强碱长时间浸泡和高温处理，一般纤维素浸泡时间为3~4h。 离子交换剂容易长霉引起变质，不用时，需洗涤干净，加防腐剂置冰箱内保存。常用0.02％叠氮钠防腐。叠氮钠遇酸放出有毒气体，也是剧毒与易爆的危险品，使用时要加倍小心。 5. 除用凝胶层析法去除无机盐类外，最常用的去盐法就是透析。细的透析袋效率高，所需时间短。将透析袋一端折叠，用橡皮筋结扎，试验是否逸漏，然后倒入待透析的蛋白质溶液。勿装太满，将袋的上端也结扎好，即可进行透析。开始可用流动的自来水，待大部分盐被透析出后，再改为生理盐水、缓冲液或蒸馏水。透析最好在较低的温度下，并在磁力搅拌器上进行。此法简单，易操作，仪器及试剂要求不高，但不如凝胶层析法效率高。 6. 浓缩γ-球蛋白粗提液除上述方法外还可用透析袋浓缩。将待浓缩的蛋白质溶液放入较细的透析袋中，置入搪瓷盘内。透析袋周围可撒上聚乙二醇6000(PEG6000)，或聚乙烯吡咯酮，或蔗糖。以上物质在使用后(吸了大量水)都可以通过加温及吹风而回收；将装有蛋白质溶液的透析袋悬挂起来，用电风扇高速吹风(10℃以下)，也可达到浓缩目的，以上两法虽不如 SephadexG-25干胶快，但价格较便宜，方法也不烦琐。 【思考题】 1. 血清蛋白质分为哪几类？ 2. 如何计算血清白/球蛋白比率？其临床意义有哪些？ 3. 怎样去除样品中的低分子盐类？ 4. 蛋白质分子为什么可以在溶液中稳定存在？盐析沉淀蛋白质的原理是什么？ 5. 血清γ-球蛋白的分离纯化采用了哪些分离纯化方法？这些方法的原理分别是什么？ 6. 层析操作过程中有哪些注意事项？
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