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生物化学与分子生物学-实验指导:实验十一 DNA的电泳及限制性内切酶谱分析

生物化学与分子生物学:实验指导 实验十一 DNA的电泳及限制性内切酶谱分析:实验十一 DNA的电泳及限制性内切酶谱分析【实验目的】掌握限制性核酸内切酶的作用特点;熟悉DNA限制性内切酶谱分析的基本原理及实验操作技术。【实验原理】限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE) 是由细菌自身产生的能识别双链DNA分子中的特定碱基序列,并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。它可分为三种类型:Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型,Ⅱ型酶就是通常所指的RE,能识别双链

实验十一  DNA的电泳及限制性内切酶谱分析

【实验目的】

掌握限制性核酸内切酶的作用特点;熟悉DNA限制性内切酶谱分析的基本原理及实验操作技术。

【实验原理】

限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE) 是由细菌自身产生的能识别双链DNA分子中的特定碱基序列,并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。它可分为三种类型:Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型,Ⅱ型酶就是通常所指的RE,能识别双链DNA的特异序列,并在这个序列内进行切割,它是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶,被誉为分子生物学家的手术刀。临床上某些遗传病是由于基因的缺失或插入或突变所致,可造成 RE 酶切位点的改变,故当用一定的RE切割时,其切开的片段(分子量)大小与正常人发生差异,通过琼脂糖凝胶电泳分离,可产生不同的电泳图谱,即DNA限制性图谱发生改变,据此可达到基因诊断的目的。

实验可选用价格低廉、酶切效果好的EcoRⅠ(识别位点G↓AATTC)对λDNA 进行酶切,观察RE的特定切割作用及其限制性图谱,理论上可产生分子量分别为21,226bp,7,421bp,5,804bp,5,604bp,4,878bp和3,530bp的片段。

【实验试剂和器材】

1.试剂

⑴ DNA底物:λDNA或制备的肝组织 DNA 或其它含有EcoRⅠ酶切位点的重组质粒 DNA。

⑵ 限制性内切酶EcoRⅠ及其缓冲液:购买的限制性内切酶均配有相应的缓冲液,在配套的缓冲液中,该限制性内切酶均可获得接近100%酶切活性。

⑶ 50×TAE电泳缓冲液:取Tris 24.2g,冰乙酸5.7mL,0.25mol/LEDTA (pH8.0) 20 mL,加蒸馏水至100 mL。1×TAE为配制琼脂糖凝胶及其电泳时的应用缓冲液。

⑷ 溴酚蓝指示剂溶液(6×上样缓冲液):称取溴酚蓝(bromophenol blue)100 mg,加双蒸水5mL,在室温下过夜,待溶解后再称取蔗糖25 g,加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中,摇匀后定容至 50 mL,加入NaOH 1滴,调至蓝色。

⑸ 溴化乙锭(ethidium bromide,EB,1 mg/mL):戴手套谨慎称取EB 20 mg于棕色试剂瓶中,加 20 mL双蒸水,溶解后贮于4℃备用,配制琼脂糖凝胶时每100 mL凝胶加50 μLEB。

⑹ DNA分子量标准:根据需要购买,一般浓度为0.5 μg/μL。

2.器材

⑴ 电泳仪及水平电泳槽。

⑵ 移液器及吸头。

⑶ 0.5 mL Eppendorf管(EP管)及一次性手套。

⑷ 锥形瓶、量筒、刻度吸管。

⑸ 微波炉或电炉。

⑹ 水平台。

⑺ 紫外分析仪。

⑻ 照相机及红色滤光片。

【实验步骤】

1.样品DNA酶切  将酶切缓冲液2 μL,λDNA 5 μg (可用基因组DNA或质粒DNA样品代替),EcoRⅠ5~10U加至0医.学全在线.5 mL EP管中,加双蒸水至20 μL,加盖,混匀后稍离心,37 ℃水浴反应1h。

2.制备琼脂糖凝胶  按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量(见表2-7)。

表2-7  琼脂糖凝胶浓度与分辨 DNA 大小范围的关系

凝胶中的琼脂糖含量

[%(w/v)]

线性 DNA 分子的有效分离范围

(kb)

0.3

5~60

0.6

1~20

0.7

0.8~10

0.9

0.5~7

1.2

0.4~6

1.5

0.2~3

2.0

0.1~2

称取 0.8g 琼脂糖倒入锥形瓶中,加入 1×TAE 缓冲液 100 mL,置微波炉或水浴加热至完全熔化,取出摇匀,稍冷却后加50 μL EB染色液,摇匀。

3.灌胶

⑴ 取洁净的电泳内槽(又称托盘),用橡皮膏或透明胶带将内槽的两端边缘封好(一定要封严,不能留缝隙)。

⑵ 将内槽放置于一水平台面上,并插好所需齿数和厚度的样品梳子。

⑶ 将冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液,缓慢倒入内槽,直至所需厚度,注意不要形成气泡,特别是梳子下,如有气泡可用牙签挑破。

⑷ 待胶冷却凝固后,小心取出梳子,撕去橡皮膏或透明胶带,将带凝胶的内槽放入电泳槽中,注意凝胶点样端要靠近负极。

⑸ 加入1×TAE缓冲液至电泳槽,缓冲液刚好没过凝胶表面即可。

4.加样  剪取适当大小的蜡膜(Parafilm膜),取 6×上样缓冲液1 μL点于膜上数点。取5 μL酶切后的样品,0.5~1 μg未酶切质粒DNA,DNA分子量标准分别与上样缓冲液混匀,将其分别加入凝胶的点样孔内(记录点样顺序及点样量)。

5.电泳  接通电泳槽与电泳仪的电源(检查正、负极,DNA片段是从负极向正极移动)。DNA 的迁移率与电压成正比,电压不超过5V/cm凝胶长度。当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿1~ 2cm处,切断电源,停止电泳。

6.观察结果  取出内槽,在紫外分析仪的玻璃平板上小心推出凝胶,通过防护屏或戴防护眼镜观察紫外灯透射的结果,DNA条带处应显出桔红色荧光条带,可观察到酶切与未酶切后的DNA条带的泳动位置。

7.摄影  在镜头前加一块红色滤光片,利用透射紫外光作光源,光圈 2.8,曝光0.5~2s,调准焦距,可拍摄质量较好的凝胶照片,有条件时则使用DNA一次成像仪。

【实验注意事项】

1.本实验可先进行酶切反应,在等待酶切过程的时间间隙灌好琼脂糖凝胶。

2.进行DNA酶切时,要在其最适温度下(大多数为37℃)进行。最好是用每一种酶的专用缓冲液,以达到最佳酶切效果。如遇两种酶进行酶切,应先用低盐缓冲液,后用高盐缓冲液,或一种酶切结束后加TE至 400 μL,再进行酚/氯仿抽提、乙醇沉淀,重新建立第二个酶切反应体系。

3.限制性内切酶一定要在低温(-20℃)下贮存,因含50%甘油,在此温度下一般不会冻结,如发生冻结则表明冰箱温度低于-20℃。新购的大包装限制酶,应先进行分装。每次取用时,应将限制酶移至冰盒内,用完后立即放回-20℃冰箱;每次吸取酶时,应使用新的灭菌吸头,以避免污染。

4.进行大量酶切时,先要确定限制酶的浓度。一般1U限制酶于37℃条件下作用底物DNA 1h以上可切割1μg DNA。一般说来,要用2~3倍的酶量才能保证完全消化,对基因组DNA尤其如此。

5.酶切基因组DNA是否完全,可通过紫外观察结果来判断。如看到DNA片段呈均匀递减的一条区带,加样孔处无大量DNA堆积,则表示酶切完全。

6.对多个样品基因组DNA分别酶切电泳摄影,绘制出多个样品的DNA限制性内切酶图谱,即可分析做出基因诊断。

7.为便于电泳后直接可观察结果,溴化乙锭(ethidium bromide,EB)可在琼脂糖加热熔化时加入。注意:EB是DNA的诱变剂,亦是极强的致癌www.lindalemus.com/jianyan/物,配制和使用过程中要小心,操作时一定要戴手套,用过的手套要及时将其翻过来,让污染有EB的面朝里,有EB的废液和器皿要分别处理好。

【思考题】

1. 结果观察为什么一定要在紫外分析仪下观察?

2. 琼脂糖凝胶中为什么要加溴化乙锭?能否不加?

 

 

 

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