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法医学-实验指导:实验八 血痕的DNA提取及STR分析

法医学:实验指导 实验八 血痕的DNA提取及STR分析:实验八 血痕的DNA提取及STR分析【目的要求】熟悉掌握Chelex法提取血痕DNA的方法,掌握PCR反应的原理和方法,以及STR分析方法;了解血痕DNA提取的常见方法。【实验内容】一、 血痕DNA提取在DNA分析技术运用于实际检案的过程中,血痕是最常见的检材之一。对血痕提取DNA,再进行PCR扩增特定基因位点,然后电泳显色检测,这是常用的法医物证检验方法。目前,用于提取血痕DNA的方法很多,不同

实验八   血痕的DNA提取及STR分析

【目的要求】

熟悉掌握Chelex法提取血痕DNA的方法,掌握PCR反应的原理和方法,以及STR分析方法;了解血痕DNA提取的常见方法。

【实验内容】

一、 血痕DNA提取

在DNA分析技术运用于实际检案的过程中,血痕是最常见的检材之一。对血痕提取DNA,再进行PCR扩增特定基因位点,然后电泳显色检测,这是常用的法医物证检验方法。目前,用于提取血痕DNA的方法很多,不同的方法有不同的优缺点,其适用的分析技术也不同。而且,法医检案的实际应用过程中经常遇。所以,在血痕DNA提取方面,我们应该了解多一点的方见不少问题,比如:微量血痕的DNA提取,血痕中含有过量的杂质等等法。因此,本次试验介绍以下几种常用的血痕DNA提取的方法,供同学们学习。分别是:Chelex-100法、酚-氯仿法、碱性裂解法、以及这些方法的改良。

﹙一﹚  Chelex-100

1. 原理

细胞中的DNA一般与蛋白质结合,提取DNA的过程就是破碎细胞,去除与DNA结合的蛋白质、多糖、脂类﹙也包括去除其他核酸﹚,最后分离、纯化所需的DNA过程。在DNA的提取方法中,我们需用到蛋白酶K、SDS。蛋白酶K的作用是消化与DNA结合的蛋白质,释放DNA。SDS的作用是破坏细胞膜、核膜,并使组蛋白等从DNA分子上解联。Chelex-100法中, chelex是一种以亚氨二乙酸为吸附因子的苯乙烯与二乙基苯的共聚物,对多价金属离子有鳌和作用,可防止DNA在煮沸加热时被降解,同时在高温低离子强度下还有催化DNA释放的作用。这样既可减少DNA的损失,又可消除扩增中的一些抑制因素,因此血痕DNA采用chelex-100法,由于其快速、实用而被广大法医物证工作者所用。

2. 仪器设备与试剂

(1) 仪器设备

离心机、进样器、1.5mlEppendorf离心管、水浴锅、振荡器。

(2) 试剂

灭菌去离子水,chelex-100

3. 方法

(1) 检材用量:对于大量血痕﹙如血纱布﹚,剪取约1×1cm2大小,不可过多否则会抑制PCR反应。如果血痕属微量血痕,可直接用进样器吸取20-40ul灭菌去离子水,然后在血痕处反复吹打,将血痕尽可能的洗下来并装入离心管中。

(2) 取适量血痕检材置1.5mlEP管中,加入1ml灭菌无菌水浸泡20min,10000rpm离心3min,用1000ul进样器小心地吸去上清液。

(3) 加5%chelex-100 200ul,于水浴锅中56℃水浴30min,振荡混匀。

(4) 沸水中煮10min,取出后立即置于冰上3min,10000rpm离心1min。上清液即为DNA提取液,可在2-6℃保存1个月,在-20℃长期保存。

【注意事项】

www.lindalemus.com/hushi/部分陈旧、或污染有多量泥沙、载体吸附力强或色素深的血痕检材,经一次chelex-100的处理,仍不能扩增成功,这可能是由于以下几个原因:

a) 血痕过于陈旧,血色素无法溶解下来,使血色素对扩增的抑制增强,导致扩增失败。

b)   血痕受泥沙或载体色素的影响,使扩增受到抑制。

c)   血痕载体吸附力强,导致DNA提取率降低。

d)   血痕量太少,超出检验灵敏度。

针对以上几种影响因素,进行一些改良处理:

a) 对难于溶解的陈旧血痕,可加入1/10体积的10%SDS,促进血色素的溶解,易于洗涤,减少血色素对扩增的抑制。

b)   对受泥沙或载体色素影响的血痕,可对首次DNA提取液进行二次提取,使模板被稀释,减少载体的干扰,进一步去除模板中的扩增抑制物。

c)   对载体吸附能力强的血痕,可增加浸泡时间,同时也可结合上述方法。

d)   对于量少而受污染的血痕,经上述处理后,再经超滤柱浓缩,使模板DNA浓度达到可检测范围。在检案过程中,检材经常是受多种因素的影响,因此可综合利用上述几种处理方法。

﹙二﹚  酚-氯仿法

1. 原理:

本试验采取酚、氯仿反复抽提,是与DNA结合的蛋白质解离、去除。氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。酚起萃取作用。试验中还要用到异戊醇,有助于消除抽提过程中出现的泡沫。

2. 仪器设备与试剂

(1) 仪器设备:

水浴锅、振荡器、离心机、进样器、1.5mlEP管

(2) 试剂:

灭菌去离子水、STE﹙氯化钠、Tr执业兽医is、EDTA﹚缓冲液、蛋白酶K、10%SDS、苯酚/氯仿/异戊醇混合物﹙25:24:1﹚、氯仿/异戊醇混合物﹙24:1﹚、5mol/L氯化钠、70%乙醇

3. 方法:

(1) 取适量血痕检材置于1.5ml EP管中,加入1ul无菌水浸泡20min,>10000rpm离心3min,弃去上清。

(2) 加入500ul STE液悬浮沉淀物,加入20ul10%SDS及10mg/ml蛋白酶K4ul,54℃水浴消化3h。

(3) 离心取上清液至另一EP管中,加入500ul苯酚/氯仿/异戊醇混合物,振荡到出现絮状物,>10000rpm离心3min。

(4) 转移上层水相至另一EP管中,加入/氯仿/异戊醇混合物,振荡,>10000rpm离心3min。

(5) 取上层水相,加入30ul 5mol/L氯化钠和1ul冰无水乙醇,振荡,10000rpm离心3min,去除乙醇。

(6) 取絮状物加入500ul 70%乙醇,振荡,>10000rpm离心3min。

(7) 弃去上清液,加入无菌水100uL使其溶解,4℃保存备用。

【注意事项】

酚-氯仿法是目前最常用、最可靠的方法之一,无论是血液还是血痕标本均适用,所提取的DNA纯度高,可满足各种分子生物学检测技术的需要,但该法操作较为繁琐、耗时长,影响了其在实践工作中的广泛应用。

(三)碱性裂解法

1. 原理:

   碱性裂解法是指在强碱作用下,使构成细胞的蛋白质成分谷氨酸天冬氨酸、氨酸残基等迅速发生电离,从而快速破坏蛋白质的一级结构。正因为强碱对蛋白质有强烈的变性乃至裂解作用,所以,检材在强碱性pH条件及一定温度状况下能迅速破碎细胞膜及核膜,使核酸酶变性及DNA释放。此时,DNA的一级结构是相对完整的。这个原理在细菌质粒DNA提取中运用较多。

2. 仪器设备与试剂:

(1) 仪器设备:

0.5ml EP管、水浴锅、离心机

(2) 试剂:

裂解液   0.2mol/LNaOH溶液(国产分析纯)。

中和液   0.04mmol/LTris-HCL(PH 7.5)进口分装。

3. 方法:

(1) 取适量血痕于0.5mlEP管中,加入20ul0.2mol/LNOH溶液,80℃保温5min(若为陈旧血痕,可适当增加保温时间5-10min)。

(2) 加入180ul0.04mmol/L Tris-HCL(pH7.5)。离心,4℃保存备用。

【注意事项】

血痕要求在75~80℃之间保温5min,若检材为陈旧性,尚应适当延长保温时间5~10min。碱性裂解法提取生物检材DNA只需一个离心管,一次完成DNA的提取,虽然不能提取100%纯度的DNA,但极大地避免了常规方法反复提纯必然导致的DNA在量上的损失。因此,本方法对微量检材DNA的提取有着更广泛的应用前景。

与Chelex-100提取法相比较,碱性裂解法有以下特点:耗时少,碱性裂解法提取检材一般需5min。碱性裂解法提取DNA所耗检材少,灵敏度高。碱性裂解法所需仪器及设备只是一个0.5ml小离心管,试剂只是NaOH及Tris-HCl等,这些均是普通实验室常规材料及试剂,大大节约了资金,减少了对国外试剂及仪器的依赖。同时既适合普通的银染检测,又适用于自动DNA片段分析仪进行片段分析。由于所用试剂中含有强碱,可以有效抑制Taq酶抑制剂的作用,所以对于相同的位点,可以取得跟Chelex-100相似的扩增效果。

(四)改良方法

将Chelex-100法或碱性裂解法处理的血痕,用等体积的饱和酚-氯仿(1:1)处理一次,再用冰无水乙醇沉淀,挥干后,加适量无菌水溶解。这样提取的DNA,经过PCR扩增电泳后,显示结果会更好。

二、STR基因座的PCR扩增及电泳检测

   方法同实验二

【注意事项】

对于微量血痕的DNA样本,往往需要在扩增反应体系中加入更多的DNA模板,以提高扩增成功率。有时,可能需要进行多次扩增方能成功。

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