实验六 精斑检验
一、精斑预试验
【目的要求】
熟悉掌握紫外线照射法、酸性磷酸酶检测法的原理及方法；了解精斑预试验的其它常用方法。
【实验内容】
（一) 仪器设备及试剂
1. 仪器设备
紫外灯、水浴锅、温箱、烧杯、试管、试管架、毛细吸管、显微镜、载玻片、盖玻片。
2. 试剂
缓冲液、显色剂、碘化钾试剂、0.01%淀粉溶液、碘液。
（二)实验方法
1. 紫外线检查
将可疑精斑检材置于紫外线灯下检查，精斑在紫外线下发银白色荧光，周围较深，带紫蓝色边缘，查见后，将斑痕范围用蜡笔划出。
2. 酸性磷酸酶检出法
（1) 剪取可疑精斑检材少许（约0.1cm2大小)置于试管内，加缓冲液3-4滴。
（2) 将试管放入37℃温箱（或水浴锅)内约5-7分钟。
（3) 加显色剂3-4滴观察结果。
（4) 结果判定：阳性，浅红色至深色或红色沉淀；阴性：橙黄色。
3. 碘化钾结晶试验
剪取可疑精斑检材少许置玻片上，加1滴蒸馏水浸软，用针头将基质纤维分离，加盖玻片，从盖玻片边缘滴加试剂1-2滴；镜检。
结果：初见褐色颗粒，逐渐形成褐色或褐红色针状或菱形结晶，有时可检出精子。
二、精斑的精子检出法
【目的要求】
熟悉掌握精子检出法的原理及方法。
【实验内容】
（一)仪器设备及试剂
1. 仪器设备
试管、试管架、剪刀、玻棒、载玻片、盖玻片、显微镜
2. 试剂
生理盐水、酒精（无水、90%、80%、50%)、苏木素染液、盐酸酒精、伊红溶液、二甲苯、中性树胶。
酸性复红亚甲兰染液配制：
1%www.lindalemus.com/jianyan/酸性品红 1ml
1%亚甲兰 1ml
1%盐酸 40ml
酸性品红靛蓝胭脂红染液配制：
第一液：溶解5g硫酸铝于100ml沸蒸馏水中，加0.1g酸性品红，搅拌溶解。
第二液：将0.5g靛蓝胭脂红溶于100ml蒸馏水中，加1ml盐酸，1ml甘油混匀。
（二) 实验方法
剪取斑迹中央部分（精子多集中在斑迹的中央)，约1cm2，剪碎置试管内，滴加生理盐水，浸透检材后再多加5-6滴，置室温2h，4℃冰箱12-24h，用玻棒挤压检材，去除粗的纤维，离心20min，上清液供作抗人精液沉淀反应及测定血型用。沉渣则涂于玻片上，用甲醇固定1min，自然干燥后染色镜检，查精子。
1． 苏木素—伊红染色
﹙1﹚ 将涂片浸于95%酒精中2min；
﹙2﹚ 80%酒精2 min；
﹙3﹚ 50%酒精2 min；
﹙4﹚ 水洗2 min；
﹙5﹚ 苏木素染液5-10 min；
﹙6﹚ 玻片在水中漂洗数次；
﹙7﹚ 1%盐酸酒精分化数sec；
﹙8﹚ 流水冲洗20-30 min；
﹙9﹚ 伊红染色液1.5 min；
﹙10﹚ 水中漂洗数次；
﹙11﹚ 投入50%酒精中后即取出；
﹙12﹚ 95%酒精，10 sec；
﹙13﹚ 无水酒精5-10 sec；
﹙14﹚ 二甲苯1-2 min；
﹙15﹚ 中性树胶封固；
﹙16﹚ 镜检，精子细胞核染色体，其他部分染红色。
2． 酸性复红亚甲兰染色
涂片干燥后，滴加酸性复红亚甲兰染液染5-10，用自来水反复冲洗，用滤纸吸去水分，镜检。精子头部的后半部﹙即核﹚染成兰色，前半部不着色或浅染，体及尾部染成红色。只要见到一个典型的www.lindalemus.com/wsj/精子，即能确认为精斑。陈旧精斑，处理过分粗暴，往往只见精子头部。如果见到几个典型的精子头部也可确证精斑。
3． 酸性品红靛蓝胭脂红染色
涂片在酸性品红靛蓝胭脂红染液的第一液中染色30 sec。用1%HCl洗去第一液。再用第二染色15 sec。用95%乙醇冲洗，干后用树胶封闭，镜检。精子头部染深紫红色，颈段呈白色、尾部主段和末段染成紫兰色。
