医学全在线
搜索更多精品课程:
热 门:外科内科学妇产科儿科眼科耳鼻咽喉皮肤性病学骨科学全科医学医学免疫学生理学病理学诊断学急诊医学传染病学医学影像药 学:药理学药物化学药物分析药物毒理学生物技术制药生药学中药学药用植物学方剂学卫生毒理学检 验:理化检验 临床检验基础护 理:外科护理妇产科护理儿科护理 社区护理五官护理护理学内科护理护理管理学中 医:中医基础理论中医学针灸学刺法灸法学口 腔:口腔内科口腔外科口腔正畸口腔修复口腔组织病理生物化学:生物化学细胞生物学病原生物学医学生物学分析化学医用化学其 它:人体解剖学卫生统计学人体寄生虫学仪器分析健康评估流行病学临床麻醉学社会心理学康复医学法医学核医学危重病学中国医史学
您现在的位置: 医学全在线 > 精品课程 > 医学微生物学 > 河北医科大学 > 正文:医学微生物学实验指导
    

医学微生物学-实验指导

医学微生物学:实验指导:◎<实验一> ◎<实验二> ◎<实验三> ◎<实验四>◎<实验五> ◎<实验六> ◎<实验七> ◎<实验八>※<实验一>实验一 油浸镜的使用和细菌形态结构的观察 革兰氏染色Use of oil immersion objective and observation of morphoiogy structures lf bacteria一、油浸镜的使用方法观察细菌时,须用放大倍数最大的物镜,即油浸
 

◎<实验一>  ◎<实验二>  ◎<实验三> ◎<实验四>

◎<实验五>  ◎<实验六>  ◎<实验七>  ◎<实验八>

 
 

 

※<实验一>

实验一  油浸镜的使用和细菌形态结构的观察 革兰氏染色

Use of oil immersion objective and observation of morphoiogy structures lf bacteria

一、油浸镜的使用方法

观察细菌时,须用放大倍数最大的物镜,即油浸镜(Oil immersion objective,简称油镜)。其原理如图一所示,当光线从标本经过空气进入镜头时,由于介质密度不同而发生光的折射(散光现象),光线不能完全进入物镜中,致使物象显现不清。若在油镜与载物玻片中间加入和玻璃折射率(n=1.52)相仿的香柏油(n=1.515),则不使通过的光线有所损失,视野亮度增强,获得清晰物象。

(一)油浸镜的使用方法

1、双手托显微镜,轻拿轻放。

2、放好后,用绸布擦试显微镜,同时检查显微镜有无问题,有问题立即向老师报告。

3、用低倍镜调整光线,看染色标本时,要求视野达到最亮的程度。

①将集光器升到最高位置,与载物台相平。

②将虹彩完全开放。

图1 油浸镜原理示意图

③天然光线用平面反射镜,人工光源用凹反射镜。使视野达到最亮的程度。

4、在标本上滴一滴香柏油,不要多加。用眼睛从侧面观察,小心转动粗调节器,使油浸镜头缓慢下降,浸入油中,到几乎或轻轻与玻片接触为止。不能过急过重,以免碰坏镜片。

5、一面从目镜观察,一面用粗调节器慢慢上升油浸镜头,当见到模糊的物象时,立即停止。再用细调节器调到物像清晰为止。然后,一边移动片子,一边观察,寻找理想的视野,仔细观察。

6、看完后,先将油浸镜头上提,然后取下标本片,再用擦镜纸拭去镜头上的香柏油。必要时,用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头,然后再用另一小块擦镜纸拭去二甲苯。

7、最后,降下集光器,竖起反射镜,下降镜筒使物镜成八字形抵于载物台绸布上,双手托持显微镜,放入显微镜箱中。

(二)注意事项

1、不得在直射阳光下操作显微镜,以免强光损坏镜片。

2、显微镜的细调节器是精密而脆弱的机件,只能做有限的旋转,因此,不得向一个方向连续旋转数周。当旋转时感到有阻力,则表明已达极限,不能再继续向上方旋转,必须立即退回,轻拿轻放,防止细调节器因震动而损坏。

3、显微镜必须保存于干燥、无尘的方,以防镜片发霉损坏。

二、细菌的基本形态、特殊构造的观察

细菌的基本形态(球菌、杆菌、螺形菌)和细菌的特殊构造(荚膜、鞭毛与芽胞等)都可以在染色之后,用油浸镜观察

(一)细菌的基本形态观察

注意观察细菌的形态、大小、排列和染色性。

1、球菌和杆菌(葡萄球菌和大肠杆菌)

革兰氏染色标本,葡萄球菌染成紫色,大肠杆菌染成红色。

2、弧菌(霍乱弧菌)

革兰氏染色标本,霍乱弧菌染成红色。

(二)细菌的特殊构造观察

1、荚膜(肺炎球菌)

Hiss氏荚膜染色法,菌体染成紫色,荚膜染成淡紫色或无色。

2、鞭毛(变形杆菌)

户田氏鞭毛染色法,菌体和鞭毛均染成红色。

3、芽胞(伤风杆菌)

Moeller氏芽胞染色法,菌体染成兰色,芽胞染成红色。

三、革兰氏染色法

革兰氏染色法是最常用的细菌鉴别染色法。要求同学必须掌握此项基本技术操作,并理解革兰氏染色法在鉴别细菌上的重要意义。

1884年由Gram氏建立,因之得名。关于其原理还不完全清楚,曾有几种不同的解释:

1、革兰氏阳性菌细胞壁结构比较致密,肽聚糖层很厚,脂类含量低,酒精不易透入。阴性菌的细胞壁较为疏松,肽聚糖很薄、外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质,易被酒精溶解,致使细胞壁通透性增高,细胞内的结晶紫一碘复合物被酒精溶解提出而致脱色。

2、革兰氏阳性菌含有多量核糖核酸镁盐,可与结晶紫和碘结合成大分子复合物,不易脱出。而阴性菌中此物质含量甚少,故易于脱色。

3、革兰氏阳性菌等电点(pH2-3)比革兰氏阴性菌(pH4-5)为低,在同样pH的染色环境中,阳性菌所带的阴电荷比阴性菌多,故与带阳电荷的结晶紫染料结合较为牢固,不易脱色。目前认为,在以上各因素中,细胞壁结构上的差异是最重要的因素。

材料:

葡萄球菌与大肠杆菌的混合菌液。

革兰氏染色液,载物玻片等。

方法:

1、涂片:先将接种环(白金耳)用火焰灭菌,用灭菌的接种环取菌液一滴,在载物玻片上涂一个薄而均匀的涂膜,直径约为1厘米。如用纯培养菌做涂片时,应先取一滴生理盐水放于载物玻片上,再取少量纯菌,混于盐水中,然后再涂片。

2、干燥:放空气中自然干燥,或于火焰上部略加烘烤,使液体干燥。

3、固定:将玻片从火焰中央部,反复通过三次。使涂片中细菌,固着于载物玻片上,并杀死大部分细菌。

4、取结晶紫液滴于涂膜上,染1分钟,水洗。

5、用芦戈碘媒染1分钟,水洗。

6、用0.4%石碳酸复红液脱色复染半分钟,水洗。

7、印干后,用油镜观察。

结果:经革兰氏染色后,凡染成紫色的的细菌称之为革兰氏阳性菌;凡染成红色的细菌称之为革兰氏阴性菌。

5

※<实验二>

实验二  常用培养基简介 细菌接种及分布  消毒与灭菌

培养基(culture medium)是由人工方法配制而成的,专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。培养基一般pH为7.2~7.6,少数的细菌按生长要求调整pH偏酸或偏碱。

培养基按其营养组成和用途不同,分为以下几类:
  按照来源来分类,可分为天然培养基、人工合成培养基和混合培养基。

天然培养基  通常是酵母菌、牛肉、鱼等的提取物或它们所含蛋白质的水解物。营养成分全,造价低,所含成分不完全清楚。

牛肉浸汁培养基属于此类。将除去肌腱和脂肪的新鲜牛肉500克切成小块后搅碎,加入1000ml水,4℃冰箱过夜使营养成分完全浸出,浸出液煮沸半小时去脂肪,过滤得清液,补足1000ml即为牛肉浸汁。

人工合成培养基  指各种成分都清楚的化学合成培养基。可用于研究微生物的营养需求、物质代谢。

混合培养基  就是天然和人工合成的成分都有。

根据培养基的物理状态的不同分为液体、固体和半固体三大类。

液体培养基  一般混合振荡培养,有利于营养物质的充分利用和菌体内代谢废物的排出。液体培养基可用于大量繁殖细菌,但必须种入纯种细菌,不能作分离。

固体培养基  液体培养基中加入1.5~2%的琼脂粉,即凝固成固体培养基。琼脂在培养基中起赋形剂作用,不具营养意义,可以反复凝融,便于使用。常用的两种形式斜面和平板。斜面常用来菌种短期保藏和活化,平板可通过划线分离到单个菌落,得到纯培养,也可用作活菌计数。

半固体培养基  琼脂粉含量在0.3%~0.5%时,则为半固体培养基。用于观察细菌的动力和短期保存细菌。

按照营养组成和用途分类:

基础培养基  基础培养基含有多数细菌生长繁殖所需的基本营养成分。它是配制特殊培养基的基础,也可作为一般培养基用。如营养肉汤、营养琼脂、蛋白胨水等。
  营养培养基 若了解某种细菌的特殊营养要求,可配制出适合这种细菌而不适合其他细菌生长的营养培养基。基础培养基中添加合适的生长因子或微量元素等,以促使某些特殊细菌生长繁殖,例如链球菌、肺炎链球菌需在含血液或血清的培养基中生长。

选择培养基  在培养基中加入某种化学物质,使之抑制某些细菌生长,而有利于另一些细菌生长,从而将后者从混杂的标本中分离出来,这种培养基称为选择培养基(selective medium)。例如培养肠道致病菌的SS琼脂,其中的胆盐能抑制革兰阳性菌,枸橼酸钠和煌绿能抑制大肠埃希菌,因而使致病的沙门菌和志贺菌容易分离到。若在培养基中加入抗生素,也可起到选择作用。实际上有些选择培养基、增菌培养基之间的界限并不十分严格。
  鉴别培养基  用于培养和区分不同细菌种类的培养基称为鉴别培养基(differential medium)。利用各种细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物不同,在培养基中加入特定的作用底物和指示剂,一般不加抑菌剂,观察细菌在其中生长后对底物的作用如何,从而鉴别细菌。如常用的糖发酵管、双糖铁培养基、伊红-美蓝琼脂等。
  厌氧培养基  专供厌氧菌的分离、培养和鉴别用的培养基,称为厌氧培养基(anaerobic medium)。这种培养基营养成分丰富,含有特殊生长因子,氧化还原电势低,并加入美蓝作为氧化还原指示剂。其中心、脑浸液和肝块、肉渣含有不饱和脂肪酸,能吸收培养基中的氧;硫乙醇酸盐和半胱氨酸是较强的还原剂;维生素K1、氯化血红素可以促进某些类杆菌的生长。常用的有庖肉培养基(cooked meat medium )、硫乙醇酸盐肉汤等,并在液体培养基表面加入凡士林或液体石蜡以隔绝空气。
  细菌接种法

细菌的接种方法因各种培养基不同而异,常用的方法有平板、斜面、液体和半固体接种。

材料

1.琼脂斜面、琼脂平板、肉汤培养基。

2.枯草杆菌、大肠杆菌斜面培养物。

方法

(一)平板接种法

临床上各种检验标本,如粪便、痰、脓液中常混有多种细菌。如欲检查病人标本中是否有某种病原菌时,须先将各种细菌分离,获得纯菌培养物后才能进一步进行细菌的鉴定。琼脂平板培养基因面积大,接种后可达到分离的目的医学考研网,常称分离培养法。平板接种法有多种,以下介绍平行划线法(又称连续划线接种)及分区划线法。

1.分区划线法:如接种物中细菌极多时(如固体菌种、粪便等)则必须采用分区划线法才能得到好结果(图3-2)。

(1) 烧灼接种环,冷却后,取1环接种菌液。

(2) 打开平板盖,左手斜持平板(约45°角),并靠近火焰,以免空气中杂菌落入平板内,右手握持已沾菌液的接种环在琼脂平板一端连续平行划线(约占平板面积的1/3),为第1组线。划线时,接种环与平板成30~40°,轻轻接触平板,以腕力平行滑移接种环,注意避免将环嵌人琼脂将其划破。

(3) 转动平板约70°,接种环烧灼灭菌冷却后,从原接种处通过2~3条线,划于另一个1/4的面积为第2组线。划毕,接种环又烧灼灭菌,冷却后同法划出第3、4组线。

(4) 接种完毕,盖上皿盖,于皿底做好标记,将平板倒置(平板底面朝上),置37℃培养18~24h,观察结果。

2.平行划线法:一般当接种物中细菌不太多时(如脓汁标本、液体培养物等)可以选用平行划线法(图3-3)。

图3-2 分区划线法(左)及菌落分布示意图(右)

图3-3 平板连续划线法(左)及菌落分布示意图(右)

结果

琼脂平板表面散在分布两种菌落,为圆形、光滑、湿润、边缘整齐,其中有金黄色色素的为金黄色葡萄球菌的菌落;另一种为大肠杆菌菌落。

(二)琼脂斜面接种法

多用于纯种细菌的增菌和保存菌种。

1.用灭菌接种针取细菌培养物少许。

2.拔出培养管棉塞,管口经火焰灭菌,将沾有细菌的接种针从培养基中央刺入,沿原穿刺线拔出。

3.再将接种针自下而上在琼脂上平行划线(图3-4)。

4.接种后,管口在火焰上灭菌,塞回棉塞,接种环灭菌。

5.在试管壁近管口处做好标记,置37℃培养18~24h,观察结果。 

(三)肉汤接种法执业兽医

用于增菌。

1.灭菌接种环取细菌培养物少许。

2.以无菌操作将沾有细菌的接种环伸入肉汤管中,将环上细菌轻轻研磨于接近液面的管壁上,然后将试管稍倾斜,使肉汤碰及细菌,将细菌带入培养基中(图3-5)。

3.接种后管口灭菌,塞回棉塞,接种环灭菌,并做好标记,置37℃培养18~24h,观察结果。

(四)半固体接种法(穿刺接种法)

用于观察细菌有无动力。

半固体接种是用接种针,无菌操作方法同前。将取有细菌的接种针从培养基的中央刺入,沿原穿刺线拔出,注意在刺入与拔出时不可晃动接种针(图3-6)。

强调:无菌操作。戴帽子、口罩,防止人吸入和污染培养基。

全班1个空气微生物分布平板

每组1个血平板做咽拭子分布

1个普通平板一半接枯草,一半接大肠,紫外线照射30min比较杀菌效果

1个普通平板分区,棉拭子沾生理盐水环境取样涂抹(洗手前后必做)

6支肉汤试管,3支接大肠,3支接枯草,分为三组。一组直接培养,一组高压灭菌,一组煮沸10分钟,标记好交上。

5

※<实验三>

实验三 结果观察、脓检(1)、突变、仪器

结果观察

细菌在培养基中的生长情况
  在液体培养基中生长情况 大多数细菌在液体培养基生长繁殖后呈现均匀混浊状态;少数链状的细菌则呈沉淀生长;枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌等专性需氧菌呈表面生长,常形成菌膜。
  在固体培养基中生长情况 将标本或培养物划线接种在固体培养基的表面,因划线的分散作用,使许多原混杂的细菌在固体培养基表面上散开,称为分离培养。一般经过18~24 h培养后,单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见的细菌集团,称为菌落。挑取一个菌落,移种到另一培养基中,生长出来的细菌均为纯种,称为纯培养。这是从临床标本中检查鉴定细菌很重要的第一步。各种细菌在固体培养基上形成的菌落,在大小、形状、颜色、气味、透明度、表面光滑或粗糙、湿润或干燥、边缘整齐与否,以及在血琼脂平板上的溶血情况等均有不同表现,这些有助于识别和鉴定细菌。

琼脂平板上,可计数菌落,推算标本中的活菌数。这种菌落计数法常用于检测自来水、饮料、污水和临床标本的活菌含量。

脓汁标本的分离

化脓性标本的检验是一个连续的实验。很多细菌感染都可以引起化脓,脓拭子分离培养、鉴定,到药物敏感试验,是一个完整的实验。今天先做:

1.  取标本。无菌操作,取引起病灶的目的菌,而不是污染菌。观察病灶,脓稀薄还是粘稠,又没有新鲜血液混入,颜色、气味如何,作为第一手资料。

2.  做涂片,革兰染色。染色结果与病灶性状相结合,判断出菌的大致范围,分离培养选择合适的培养基和方法。

3.  脓拭子在血平板上进行划线分离。

突变

Ames试验利用细菌突变的原理,使用一组突变菌株,通过检测突变株回复突变率的高低检测化学物质是否具有致突变性,致突变性与致癌性高度相关。菌株:鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型,不添加外援组氨酸则不可生长。待检化学物质溶液浸泡滤纸片,贴到含有微量组氨酸的培养基上,纸片周围形成组氨酸的浓度梯度。组氨酸浓度限量,只可支持菌的几次分裂,无法形成肉眼可见菌落,只有发生组氨酸回复突变的菌才可在平板上形成菌落。化学物质若能引起突变,则有可能使缺陷型回复,纸片周围会出现比其他位置密集的肉眼可见的单菌落。根据菌落多少进行致突变性筛选。此法检测化学物质多,所用时间少,是世界通用的致癌物检测的第一梯队实验。

灭菌仪器

热力灭菌法分干热灭菌和湿热灭菌两大类,在同一温度下,后者的效力比前者大。这是因为:①湿热中细菌菌体蛋白较易凝固;②湿热的穿透力比干热大;③湿热的蒸气有潜热存在。水由气态变为液态时放出的潜热,可迅速提高被灭菌物体的温度。
1. 干热灭菌法 干热的杀菌作用是通过脱水干燥和大分子变性。一般细菌繁殖体在干燥状态下, 80~100℃经h可被杀死;芽胞则需160~170℃经2h才死亡。
 a. 焚烧 直接点燃或在焚烧炉内焚烧。是一种彻底的灭菌方法,但仅适用于废弃物品或动物尸体等。
 b. 烧灼 直接用火焰灭菌,适用于微生物学实验室的接种环、试管口等的灭菌。
 c. 干烤 利用干烤箱灭菌,一般加热至160~170℃经2 h。适用于高温下不变质、不损坏、不蒸发的物品,例如玻璃器皿、瓷器、玻质注射器等的灭菌。
2. 高压蒸气灭菌法(湿热) 是一种最有效的灭菌方法。灭菌的温度取决于蒸气的压力。在一个大气压下,蒸气的温度是100℃。如果蒸气被限制在密闭的容器中,随着压力升高,蒸气的温度也相应升高。在103.4kPa(1.05kg/cm2)蒸气压下,温度达到121.3℃,维持15~20min,可杀灭包括细菌芽胞在内的所有微生物。高压蒸汽灭菌器(autoclave)就是根据这一原理制成的,常用于一般培养基、生理盐水、手术敷料等耐高温、耐湿物品的灭菌。

5

※<实验四>

实验四 脓检(2)、菌落、血浆凝固酶、药敏试验

上次的实验我们做了革兰染色和平板接种划线分离。菌落是细菌分类的鉴定指标,不同菌有不同特点,上次已经讲过,这次仍然要用这些指标分析你分离到的单菌落。大小(大菌落、小菌落、中等菌落)、形状(圆形、不规则形)、颜色、气味、透明度(不透明、半透明、透明)、表面光滑或粗糙、湿润或干燥、凹凸情况、边缘整齐与否,有没有色素产生(脂溶性、水溶性)、以及在血琼脂平板上的溶血情况(α-环、β-环、γ-环)。

在血琼脂平板培养基上生长繁殖后,溶血现象分为3类:
① α-环:菌落周围有1~2mm宽的草绿色溶血环,溶血环中的红细胞并未完全溶解。  ② β-环::菌落周围形成一个2~4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环。溶血环中的红细胞完全溶解。

③ γ-环:菌落周围无溶血环。

引起化脓性感染的球菌,都是G球菌,主要有5种。

a.  葡萄球菌  形成圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明的菌落。直径在2mm左右。致病性葡萄球菌常产金黄色脂溶性色素和形成β-溶血环。

b.  链球菌  形成圆形、灰白色、表面光滑、边缘整齐、直径0.5~0.75mm的细小菌落。甲链,致病力弱,α-溶血环;乙链,致病力强,β-溶血环;丙链,一般无致病性,γ-溶血环。

c.  肺炎球菌  形成细小、灰白色、圆形略扁、半透明,有草绿色α-溶血环。与甲型溶血性链球菌很相似。

根据菌落形态和两次革兰染色结果可以初步确定为何菌。

致病性葡萄球菌的鉴定主要根据产生凝固酶和耐热核酸酶试验。阳性具有致病性。最常用血浆凝固酶试验。

凝固酶是能使人或血浆发生凝固的酶类物质。致病株大多数能产生,故凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。
a. 试管法:测定游离凝固酶,被人或兔血浆中的协同因子激活为凝血酶样物质后,使液态的纤维蛋白原变成固态的纤维蛋白,从而血浆凝固。兔血浆1:4稀释,加入葡萄球菌,1~4小时后,是否凝固判断阳性,阴性。准确,时间相对较长。

b. 玻片法:测定结合凝固酶。实质是在该菌株的表面有纤维蛋白原受体,当菌混悬于人或兔血浆时,纤维蛋白原与菌受体交联而使细菌凝聚。玻片两端各滴一滴生理盐水,用接种环取分离到的葡萄球菌在两侧的生理盐水中研磨成混悬液。试验侧加一滴1:4兔血浆,对照侧加一滴生理盐水。晃动玻片观察现象,如果对照组不凝而试验组出现颗粒状凝集则说明结果为阳性;如果两侧都不凝为阴性;两次都凝则结果无意义。

   甲链和肺炎球菌菌落外观很像,需要用试验区分,以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和奥普托辛试验最为常用。必要时可作小鼠毒力试验加以鉴别。在上述试验中,肺炎链球菌均应阳性,而甲型溶血性链球菌为阴性。

a.  胆汁溶菌试验  肺炎球菌有自溶酶,胆汁激活作用下细菌崩解。加胆汁或10%去氧胆酸钠至菌液,置室温或37℃,在5~10min出现细菌溶解、培养液变清者为肺炎链球菌。甲型溶血性链球菌的胆汁溶菌试验为阴性。

b.  菊糖发酵试验  分别接种菊糖发酵培养基,培养后,肺炎球菌分解菊糖产酸,培养基由紫色变黄色,甲链培养基不变色。

c.  Optochin敏感试验 方法似药敏。将待试菌涂布于血琼脂平板表面;取直径6mm无菌滤纸圆片在1:2000 optochin溶液中浸湿,置于平板涂菌处。37℃ 48h后观察抑菌圈大小,肺炎链球菌的抑制圈直径常在20mm以上,甲型溶血性链球菌(约98%)小于12mm。

根据脓汁两次革兰染色结果和鉴定试验,一般可判定为何种菌致病,诊断后进行治疗。链球菌耐药菌株少,鉴定后直接根据经验选药物即可;葡萄球菌要做标准化的药敏试验,常用纸片法,选择效价高又便宜的药。

药敏试验

标准化的药敏纸片,纸片上药物定量,不同药含量不同,给出抑菌环直径大小与药物敏感性的参考值。标准M-H培养基定量每个平板,控制厚度,。液体过夜培养后菌浓调整到一定范围,棉签蘸取涂满平板,不少于三个方向涂布涂满涂均匀。贴上药敏纸片,每两个药敏纸片间隔20mm,距边缘10mm。药敏纸片周围形成浓度梯度,由药敏纸片向周围浓度逐渐降低。药物效果越好,抑菌环直径越大;效果越差,抑菌环直径越小。

5

※<实验五>

实验五 药敏结果、肠菌特性、生化反应、血清学反应

上次的平板经过16~18温育培养,大家把自己的药敏结果找到,量量抑菌环直径大小,与标准值比较,找出其敏感药物。综合三次实验结果,写出完整的实验报告,从分离鉴定到生化反应、药敏试验,完整的系统的实验报告。

今天是肠道致病菌的检查。

取标本一般取粪便,有些病号取其他样本,中段尿、血液、脓液、脑脊液等。伤寒初期要取血,尿液和粪便2周以后才可以检出,也可取小皮疹。

取粪便直接分离培养,取血液、骨髓接种肉汤增菌。尿液离心后取渣再分离培养。标本接种于肠道鉴别或选择培养基(SS培养基、伊红-美蓝培养基或中国蓝培养基)上,37℃孵育18-24小时。挑取无色半透明可疑菌落,进行初步鉴定,接种双糖培养基。

双糖培养基  下层含葡萄糖的半固体,上层含乳糖的固体,加上酸性复红做指示剂。先穿刺接种再表面划线,观察动力,葡萄糖、乳糖利用能力,是否产气。(颜色变红则可以利用糖,上下层之间出现气柱则发酵乳糖产气,下层有扩散生长则有动力。)

单糖发酵管  液体培养基中只含有一种糖,溴甲酚紫作指示剂,大试管内倒置小试管。接种后培养,可以利用糖的产酸,培养基颜色由紫色变黄色,若产气小试管顶部推出一端气柱。观察产气比双糖培养基敏感的多。至少做五种糖:葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇

VP试验  大肠埃希菌和产气杆菌均能发酵葡萄糖,产酸产气,两者不能区别。但产气杆菌能使丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇,后者在碱性溶液中被氧化生成二乙酰,二乙酰与含胍基化合物反应生成红色化合物,是为VP试验阳性。大肠埃希菌不能生成乙酰甲基甲醇,故VP试验阴性,
  甲基红试验  产气杆菌分解葡萄糖产生丙酮酸,后者经脱羧后生成中性的乙酰甲基甲醇,故培养液pH>5.4,甲基红指示剂呈桔黄色,是为甲基红试验阴性。大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸,培养液pH ≤4.5,甲基红指示剂呈红色,则为甲基红试验阳性。
  枸橼酸盐利用试验  当某些细菌(如产气杆菌)利用铵盐作为唯一氮源,并利用枸橼酸盐作为唯一碳源时,可在枸橼酸盐培养基上生长,分解枸橼酸盐生成碳酸盐,并分解铵盐生成氨,使培养基变为碱性,是为该试验阳性。大肠埃希菌不能利用枸橼酸盐为唯一碳源,故在该培养基上不能生长,是为枸橼酸盐试验阴性。
  吲哚试验  有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌、霍乱弧菌等能分解培养基中的色氨酸生成吲哚(靛基质),经与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用,生成玫瑰吲哚而呈红色,是为吲哚试验阳性。
  尿素酶试验  变形杆菌有尿素酶,能分解培养基中的尿素产生氨,使培养基变碱,以酚红为指示剂检测为红色,是为尿素酶试验阳性。
  细菌的生化反应用于鉴别细菌,尤其对形态、革兰染色反应和培养特性相同或相似的细菌更为重要。吲哚(I)、甲基红(M)、VP(V)、枸橼酸盐利用(C)四种试验常用于鉴定肠道杆菌,合称为IMViC试验。例如大肠埃希菌对这四种试验的结果是“――++”,产气杆菌则为“――++”。

血清学试验  若初步鉴定为沙门氏菌,则可用沙门氏A-F群多价血清进行凝集反应确证。发生凝集,则是沙门氏菌。不发生凝集,60℃加热30min后破坏掉Vi抗原再次做沙门氏A-F群多价血清凝集反应,发生凝集是沙门氏菌;不发生凝集则是沙门氏菌A-F以外的菌;若凝集,则可以用特异性血清进行分型。

5

※<实验六>

实验六 肥达反应、炭疽、肉毒、白喉形态、菌落

肥达反应是诊断伤寒、副伤寒的反应。反应要进行一段时间才能看结果,所以我们先讲怎么做,做上再接着讲原理。

1.  取试管作标记,每排7支,共4排。

2.  加生理盐水0.5ml/管。

3.  加血清作系列稀释,各排第一管加1:10的待检血清0.5ml,倍比稀释至第6管,第7管作对照。

4.  加抗原,每排加一种已知抗原菌液0.5ml/管,混匀,放50℃水浴1h,观察结果。

5.  室温过夜,观察结果。

抗原菌液四排:TH(伤寒杆菌鞭毛型)、TO(伤寒杆菌菌体型)、AH(甲型副伤寒杆菌鞭毛型)、BH(乙型副伤寒杆菌鞭毛型)。

观察结果,鞭毛抗原形成絮状疏松沉淀,浮搁在管底,轻轻振动就可以浮起,易散开。菌体抗原结合时间长,颗粒状凝集紧贴管底,轻摇试管不易散开。计算出现明显凝集的试管的最高稀释度即为效价,进行结果分析。

肥达试验是用已知伤寒沙门菌菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原,以及引起副伤寒的甲型副伤寒、肖氏沙门菌希氏沙门菌H抗原的诊断菌液与受检血清作试管或微孔板凝集试验,测定受检血清中有无相应抗体及其效价的试验。
  肥达试验结果的解释必须结合临床表现、病程、病史,以及地区流行病学情况。
1. 正常值 人们因沙门菌隐性感染或预防接种,血清中可含有一定量的有关抗体,且其效价随地区而有差异。一般是伤寒沙门菌O凝集效价≥1:80,H凝集效价≥1:160,引起副伤寒的沙门菌H凝集效价≥1:80时才有诊断价值。
2. 动态观察 有时单次效价增高不能定论,可在病程中逐周复查。若效价逐次递增或恢复期效价比初次≥4倍者始有意义。
3. O与H抗体的诊断意义 患伤寒或副伤寒后,O与H在体内的消长情况不同。IgM类O抗体出现较早,持续约半年,消退后不易受非伤寒沙门菌等病原体的非特异刺激而重现。IgG类H抗体则出现较晚,持续时间长达数年,消失后易受非特异性病原刺激而能短暂地重新出现。因此,O、H凝集效价均超过正常值,则肠热症的可能性大;如两者均低,患病可能性小;若O不高H高,有可能是预防接种或非特异性回忆反应;如O高H不高,则可能是感染早期或与伤寒沙门菌O抗原有交叉反应的其他沙门菌(如肠炎沙门菌)感染。
4. 其他 有少数病例,在整个病程中,肥达试验始终在正常范围内。其原因可能由于早期使用抗生素治疗,或患者免疫功能低下等所致。
  炭疽芽孢杆菌  革兰阳性,两端平截、粗大,链状竹节样排列,芽胞在有氧条件下形成,呈椭圆形,位于菌体中央,对鉴别有意义。菌落灰白色,粗糙,大,边缘不整齐,在低倍镜下观察边缘呈卷发状。

肉毒梭菌  革兰阳性,粗短杆菌,次端生芽胞呈椭圆形,粗于菌体,位于次极端,使细胞呈汤匙状或网球拍状。

白喉棒状杆菌  菌体细长微弯,一端或两端膨大呈棒状。细菌常排列呈V、L等文字形。革兰染色阳性。用美蓝短时间染色菌体着色不均匀,出现有深染的颗粒,称为异染颗粒。颗粒的主要成分是核糖核酸和多磷酸盐,在鉴定时有重要意义。

5

※<实验七>

实验七 分枝菌培养抗酸染色、鸡胚接种其他微生物

齐-尼抗酸染色

制片和革兰染色一样,接种环沾卡介苗在玻片上划直径1cm左右的圆。

1.  制片:取牙垢→涂膜→自然干燥→火焰固定

2.  石炭酸复红加热蒸染5分,去滤纸片,水洗→3%盐酸酒精脱色1~2分,水洗→美蓝复染30秒~1分,水洗→吸干、镜检

注意:a. 加热蒸染,涂片以后,盖上滤纸片在涂膜部位,用夹子夹好,加上染液石炭酸复红,酒精灯上加热蒸染5分钟。加热过程中不要蒸干了,要补加染液,不要太烫时加,玻片会裂。控制好距离酒精灯火焰高度,及时添加染液。

  b. 脱色时间根据片子厚薄而定,看着没有浓重红色冒出即可。

结果:结核、麻风杆菌类抗酸菌可以抵抗3%盐酸酒精脱色,不能脱去红色,美蓝复染后仍为红色,称抗酸染色阳性。其他菌和物质脱色时脱成无色再用美蓝复染成蓝色,抗酸染色阴性。

怀疑是肺结核的可以直接做痰涂片。抗酸染色的痰涂片上,粘液成分和其他菌蛋白是蓝色,只有结核杆菌是红色。若看到蓝色背景上的红色细长杆菌,则多是结核杆菌。为了提高阳性检出率,可以先用3%盐酸、6%硫酸或4%NaOH 处理15min,降解粘性成分。

培养要把培养基pH调低,最适pH6.5-6.8,培养基要求营养丰富,一般常用罗氏培养基,含蛋黄、甘油马铃薯、无机盐和孔绿等。用大粗试管玻璃纸包扎紧了进行培养,生长缓慢,18小时分裂一次,2-4周可长出干燥颗粒状菌落,呈菜花状或馒头渣状,表面粗糙,边缘不整齐,不透明。

鸡胚接种

病毒分离早期的常用方法,我国汤飞凡最早用鸡胚接种衣原体。

鸡受精卵经过一定时间培养后会形成鸡胚。羊膜腔、卵黄囊、尿囊、绒毛尿囊膜都可以接种,不同病毒选用部位不同。

本次试验选用新城疫鸡瘟病毒,进行尿囊接种。检卵器检卵,标出气室(透光度强亮度大的部位),鸡胚(最暗的部位)。鸡胚放蛋托上,碘酒在气室消毒,酒精脱碘,锥子烧灼后在气室中间或边缘打孔,无菌注射器取病毒液0.1~0.2ml,垂直进针,穿过气室后注入。蜡油封上孔。下次用这次结果,注意无菌操作。

病毒培养常用三种方法

1. 细胞培养 目前最常用的方法是细胞培养,选择适当的原代培养细胞(敏感性高)及传代细胞系(便于在实验室保存)作病毒分离培养。接种标本后,细胞可出现病变或也可并不出现病变而需用血细胞吸附等方法检测是否有病毒增殖,并进一步还需用特殊的抗体鉴定病毒的种类。

2. 鸡胚接种 在流感病毒的分离培养中,最敏感而特异的方法是鸡胚接种,并用血凝和血凝抑制试验以鉴定病毒。此外,细胞培养也可应用。分离流感病毒在发现新变异株中具有重要价值。

3.  动物试验 接种动物分离病毒的方法目前已很少应用,但对狂犬病病毒及乙型脑炎病毒的分离与鉴定中还需应用动物接种,并结合用特异抗体作中和试验或作免疫荧光染色以鉴定病毒种类。

观察标本

   白色念珠菌  真菌,大、紫色、球菌

   钩端螺旋体  银染,黄色背景下深棕黑色细线状,一端或两端有钩

   结核杆菌痰涂片  红色细长杆菌

5

※<实验八>

实验八 鸡胚收剖、血凝、鼠脑接种、真菌培养

鸡胚收剖

上次做了鸡胚接种,这次做鸡胚收剖。把鸡胚放蛋托上,先消毒蛋壳气室处,用剪子或镊子敲开个口,剪掉气室,揭去第一层卵膜,剪开绒毛尿囊膜,用吸管收集尿囊液。

血凝试验

某些病毒具有血凝素,可以使人或动物的红细胞凝集,可以通过血凝试验确定有无具有血凝素的病毒存在,其效价高低。

1.  血凝板上第1个孔加0.4ml生理盐水,其余9孔加0.25ml生理盐水。

2.  收剖鸡胚取尿囊液0.1ml加入第1孔,倍比稀释至第9孔,第10孔作对照。

3.  加1%新鲜鸡血球液,每孔0.25ml,混匀后,室温静置1h观察结果。

结果判定  第10孔对照血球自然沉降到孔底,成光滑圆点状,整个系统可用。以对照孔依次向前看,根据凝集现象记录结果。血凝效价以最先出现的++为准。计算效价出现的稀释度。

血凝试验只能检查是否有具有血凝素的病毒存在,要确定是哪一种病毒,还要做血凝抑制试验。

血凝抑制试验

样本液先加入特异性抗体作用一段时间,如果是相应的抗原抗体结合则封闭住血凝素位点,加入血球有血凝抑制现象。对照组设三组:病毒对照,抗体对照,缓冲液对照。三个对照组均正常结果才有意义。

鼠脑接种

实验动物接种途径很多,脑、腹腔、皮肤、皮下均可。本次实验学习鼠脑接种。

老鼠,消毒眼耳连线中点,注射器取病毒液(染液代替)向其扎入,有镂空感时即进入颅骨,注射即可。

注入接种完就拉颈处死,进行鼠脑收剖。

枕后部皮肤横剪开,再纵剪,脑袋皮肤剥开,剪开颅骨,看看你的病毒液注射到哪个部位了,注射到的地方会被染蓝。

真菌培养

真菌营养要求不高,菌落形态有两种。

1.  酵母型菌落 是单细胞真菌的菌落形式,菌落光滑湿润,柔软而致密。形态与一般细菌菌落相似,如隐球菌。有部分单细胞真菌在出芽繁殖后,芽管延长不与母细胞脱离,形成假菌丝。假菌丝由菌落向下生长,伸入培养基中,这种菌落称为酵母样菌落,如假丝酵母菌。

2.  丝状菌落 是多细胞真菌的菌落形式,由许多疏松的菌丝体构成。菌落成棉絮状、绒毛状或粉末状,菌落正背两面呈现不同的颜色。丝状菌落的形态、结构和颜色常作为鉴定真菌的参考。真菌有从中心向四周等距离生长形成圆形菌落的倾向,所以临床体癣股癣叠瓦癣等皮损表现为环形或多环形。

真菌培养常用大培养柯氏瓶点种接种。

若要区分酵母型和酵母样菌落,可作小培养。载玻片上用蜡粘上钢圈,加入一半培养基,,点种后盖上无菌盖玻片,培养后镜检观察。

观察。

大分生孢子  体积较大,由多个细胞组成,常呈梭状、棍棒状或梨状,中间有分隔。其大小、细胞数和颜色是鉴定的重要依据。

小分生孢子  较小,1个孢子只有1个细胞,如小米粒状。不是鉴定依据。



 


...
医学全在线 版权所有© CopyRight 2006-2046,
皖ICP备06007007号
百度大联盟认证绿色会员可信网站 中网验证
Baidu