实验七 血中一氧化碳的检测
【目的要求】
熟悉一氧化碳中毒的特征和检材的采取要点，掌握碳氧血红蛋白分析鉴定方法，及饱和碳氧血红蛋白的制取技术。
【实验内容】
一、检材的采取
一氧化碳中毒检材以取血液为最好，通常是采取心腔内血液进行检测。死体采血应用针管先将血浆和血球充分混匀后抽取。盛装检血的容器如不能及时检测，应待检血装满不要留有空间以避免一氧化碳的损失。
二、碳氧血红蛋白的鉴别试验
1、煮沸法
取血2~3毫升，置试管内，放水浴锅中加热，使发生凝固。如系一氧化碳血，呈砖红色凝固体，而正常血则呈褐色或黑褐色凝块。
此法最简便，不需任何试剂，在勘验现场即可进行，但含量在40%才可测出。
2、硫化铵法
取水10毫升，加血5滴，加硫化铵5滴，轻混合之，再加少量10%醋酸使微呈酸性，如系一氧化碳血，呈玫瑰色www.med126.com；而正常血为绿褐色。
此法灵敏，含量在10%即可检出。
3、碱液稀释法
取血1~2滴，加水稀释至15毫升，再加5滴10%氢氧化钠，同时取一正常血样作对照，与碱液混合后立即记下时间，正常血由于碱性正铁血红素的形成，立即变为草绿色或绿褐色而含10%以上一氧化碳血液需要15秒钟后才变为草绿色或绿褐色；含50%者需50秒钟后。
4、钯镜试验
碳氧血红蛋白与硫酸作用释放出一氧化碳，一氧化碳可使气体钯还原成钯镜。
取扩散血（孔威氏盒)一个，内圈内放入0.5毫升0.1%氯化钯溶液，外圈内一侧放入0.5毫升检血，另一侧放入0.5毫升10%硫酸溶液（封盖前不要让它们接触)，然后盖上盒盖，轻轻摇晃使血液与硫酸充分接触，20分种至2小时内观察试验结果，如有一氧化碳释出，可见内圈形成发亮的钯镜。
以上各鉴别试验，一定要取正常血同样做对照试验，以作对比。
三、碳氧血红蛋白的定量检验
1、焦性没食子本----鞣酸法测定一氧化碳含量
含碳氧血红蛋白血与焦性没食子酸----鞣酸溶液混合静置观察，呈樱红色。而正常血变为灰褐色。此反应较慢，但反应颜色可保持数日，利用它可做碳氧血红蛋白念量测定。
（1)实验室中饱和碳氧血红蛋白 制备；
实验装置见图2-1：
先将浓硫酸加热，而后扭开分液漏斗活塞，让甲酸（H COOH)一滴一滴与浓硫酸接触，即有一氧化碳气体冒出，经过洗气瓶，通入盛有正常血的瓶中，10毫升血（用0.05克枸椽酸钠作抗凝剂)通一氧化碳约15分钟，即可使血红白的一氧化碳饱和度达100%。避免通气过猛，以免血液内产生大量泡沫外溢。因每人Hb含量不同，最好取死者血通以CO使达饱和，可省去换算。
（2)焦性没食子酸----鞣酸性测定血中一氧化碳含量：取正常血3毫升，加水稀释至30毫升，另取上述制备之饱和一氧化碳血3毫或，加水稀释至30毫升，按下表之比例取这两种混合，得到一氧化碳由百分之0至100饱和度的血。
分别取一氧化碳不同饱和度的血各毫升，放入11支口径相等的5—10毫升的小试管内，每管加入2毫升焦性没食子本----鞣酸溶液，塞住管口，将管倒转2---3次，使溶液混匀，但勿振荡，管置冷水中冷却，倾入少量熔化的石蜡，使凝固于液面上，隔绝空气。标准管可保存1---2星期。加试药后，正常血变灰色，合一氧化碳的血变樱红色，含量愈多，颜色愈深。
取中毒者的血0.2毫升加水稀释10倍，同时加2毫升焦性没食子酸----鞣酸溶液处理30分种后，与标准管比色，以求一氧化碳饱和度。
CO饱和度（%) | CO血（毫升) | 正常血（毫升) |
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 | 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 | 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 |
图2-1 一氧化碳发生装置
2、氧化钯法测定血中一氧化碳含量
此法依据的原理为铁氰化钾能使碳氧血红蛋白释出一氧化碳。一氧化碳气体通过氯化钯反应纸，二价的钯被一氧化碳所还原，析出黑色的金属色；在反应纸上形成色斑，与标准色斑比对测定其含量。
操作方法，装置如图2-2。其中包括三个大试管（15×2厘米)，一套凸缘双联吸收管（内径1厘米)及一个抽水吸引器（“E”字母代表)。
图2-2 氯化铯法测定一氧化碳装置
A管装5毫升氯化钯溶液，以除去空气中的一氧化碳。B管装2毫升供检验的血，加4毫升铁氰化钾溶液，再加2滴辛醇以防止抽气时血液起泡，并加20毫升乳酸溶液。C管装玻璃珠至4厘米高，加5毫升5%醋酸铅溶液，以除去血液因腐败而含的硫化氢。取一圆形滤纸，大小与吸收管（D)外径一致，浸入氯化钯溶液浸湿，夹于另两张干净滤纸问吸去多余的溶液，否则气体不易通过。谨慎地将滤纸夹入吸收管中。用橡皮圈紧密固定，切勿漏气。
吸收管与抽水吸引器（E)连接，打开进气管处螺旋S，由抽水吸引器缓缓抽吸，可见气泡通过，抽15分钟后停止。如无抽水吸引器，可用一个具有下口的体积为2升的大瓶代替，内盛满水，打开下口，调节水的流速度使15分钟流出400毫升，即行停止亦可。自吸收管间取出滤纸，放蒸馏水充分冲洗，以除去未被还原的氯化钯。纸上色斑与标准色斑比对，确定其含量。
标准色斑的制备：如前面所述制备一氧化碳饱和度为0、10、20……100的11个标准样品，以氯化钯法制备11个标准色斑，水洗。干燥后，夹于玻璃板中。保存于阴暗处，避免阳光直接照射，可数月不变色。
做标准色斑有的血所含血红蛋白如与供测定的血所含血红蛋白相等，所得饱和度百分数即无须校正，否则予以校正。
例如，做标准用血含血红蛋白为90%，供测定的血红蛋白为60%，比色所得色斑相当于标准色斑30%一氧化碳饱和度。校正后供测定的血的一氧化碳饱和度应为：
90
30×————45%
60
3、紫外吸收光谱法测定血中一氧化碳含量
一氧化碳测定亦可用微量扩散法。扩散后，槽内氯化钯液可用来测光密度以推算一氧化碳含量。
操作方法：
（1)在微量扩散槽沿上涂抹薄层硅润滑没（防止漏气)。
（2)在微量扩散槽中央加3毫升0.005N氯化钯溶液。
（3)在外槽一侧滴加1毫升3.5N硫酸，将盖盖上只留一侧边缝准备滴加被检血液。
（4)加0.5毫升血，立即将盖封闭严密，利用旋转倾斜使外槽的硫酸和血液混合，开始扩散。
（5)室温扩散2小时后，取出内槽氯化钯液，移到50毫升容量瓶中，并用0.1N盐酸3毫升洗涤3次，洗液均并入容量瓶中，用0 .1N盐酸稀释至刻度，混匀后，用1厘米厚石英杯9毫微米光密度，将0.1盐酸作参比液。测得的光密度为剩余未被一氧化碳化原的氯化钯溶液的光密度，将它与标准氯化钯溶液的光密度对比，从而推算一氧化碳的含量。
标化和计算：
（1)分别将0.5、1.0、2.0、2.5和3.0毫升0.005N氯化钯用0.1N盐酸稀释至50毫升，充分混匀。
（2)同上用1厘米厚石英杯测各个不同浓度的氯化把溶液在2：3毫微粉的光密度。
（3)氯化钯的用量与血中一氧化碳体积的相关值可见下表。
氯化钯的体积 （毫升/50毫升) | 一氧化碳的体积 （毫升/100毫升) |
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 | 0 5.6 11.2 16.8 22.4 28.0 |
(4)测定原检材的血红蛋白合量，然后按下试计算：
CO的体积×100
————————————————= CO血红蛋白饱和度（%)
血红蛋白（克/100毫升)×1.35
此法系数变动范围为±5.2%
如血液腐败，其中大量硫化物能干扰本反应，可用醋酸沿溶液代替3.6N硫酸作为释放剂，以除去硫化物的干扰。
附：试剂
1、1%氯化钯溶液：0.5克氯化钯加0.5毫升浓盐酸，加水稀释至50毫升。
2、焦性没食子酸----鞣酸溶液：焦性没依酸和鞣酸各0.5克，溶于50毫升水中（以临用时新配制为宜)。
3、铁氰化钾溶液：3.2 克铁氰化钾及0.8克皂角甙（皂素Sapon医学全.在线www.lindalemus.comin)溶于100毫升水内。
4、乳酸溶液：100这种升水含乳酸（比重1.20)0.8毫升。
5、0.005N氯化钯溶液：0.44克氯化钯溶于500毫升0.1N盐酸中，过夜，用0.1N盐酸稀释至1升。1毫升0.005N氯化钯相当于0.056毫升一氧化碳。
6、醋酸铅醋酸溶液：10毫升冰醋酸溶于100毫升水，加醋酸铅至饱和为度。
