专题讲座二——蛋白多糖阻抑：涎腺肿瘤治疗的新思路
主讲人 王洁教授
涎腺肿瘤是口腔颌面部常见的一大类肿瘤，其发病率较高，发病部位较广。由于肿瘤性肌上皮细胞的存在、增殖和分化，导致了涎腺肿瘤组织形态学的多样性和复杂性，以及良、恶性肿瘤生物学行为上的差异。不同类型的涎腺肿瘤在不给临床表现、影像学特征、回答治疗和预后等方面均不相同，给临床诊断和治疗带来困难。
肿瘤性肌上皮细胞（neoplasticmyoepithelial cells, NMCs)是涎腺肿瘤中主要增生的细胞成份，NMCs具有分泌产生蛋白多糖（proteoglycan,PG)的功能，PG作为细胞外基质（Extracellularmatrix，ECM)的组成部分，在涎腺肿瘤发生、发展过程中具有重要的意义和作用。
蛋白多糖的组成和种类
蛋白多糖是一类大分子糖蛋白，由葡胺多糖（glycosaminoglycans，GAGs)链以共价键形式与核心蛋白（core protein)结合，形成多聚阴离子线性结构。核心蛋白因表达细胞不同，具有不同的结构和功能。至今已明确，大约有超过20种的核心蛋白存在。GAGs侧链主要包括：硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸肝素、肝素及透明质酸等。除透明质酸外，其余PG都经历硫酸化过程。同一核心蛋白上可以结合不同的GAGs，不同的核心蛋白和不同的GAG组合构成种类多样的PG，并赋予其各自不同的功能。
作为细胞外基质的主要成份，PG在影响实质细胞的增殖、分化、形态构成、迁移及信号转导等方面具有重要作用，并与一些生长调节物质及蛋白酶类结合并呈现出对实质细胞生长、粘附、迁移的调控作用。
涎腺肿瘤中的蛋白多糖
在涎腺肿瘤中，含有NMCs的肿瘤结构复杂、形态多样，生物特性各异，突出的表现为上皮细胞的间质化，即出现了间质样物质的大量分泌和堆积。
本研究室对涎腺多形性腺瘤、肌上皮瘤及腺样囊性癌中NMCs的示踪观察发现，正常肌上皮细胞不具有分泌PG的功能；而在涎腺肿瘤中，NMCs获得了分泌产生PG的功能，并通过胞吐作用将PG分泌至细胞外基质中，不仅与胶原纤维、弹性纤维等一起构成细胞外间质，还引起细胞间桥粒断裂，使得NMCs脱落下来，成为多形性腺瘤黏液软骨样区域中的细胞来源。
组织学观察显示，PG主要存在于涎腺腺样囊性癌的囊样腔隙和的多形性腺瘤的黏液软骨样区域中，主要种类有：硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulphate proteoglycan, HSPG)；硫酸角质素蛋白多糖（keratan sulphate proteoglycan, KSPG)和硫酸软骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPG)和透明质酸（hyaluronan，HA)。
人木糖基转移酶在蛋白多糖生物合成中的作用
目前已知的人木糖基转移酶（xylosyltransferase)有两种：人木糖基转移酶-I （xylosyltransferase：XT-I)和人木糖基转移酶-II （xylosyltransferase：XT-II)。XT-I在PG生物合成中起中心调控作用。以硫酸化蛋白多糖为例，PG生物合成过程为：1)首先合成PG核心蛋白的多肽链；2)在木糖基转移酶-XT的催化作用下将一分子木糖基从尿苷二磷酸一木糖（UDP-D-xylose)连接到核心蛋白的丝氨酸一甘氨酸序列的丝氨酸残基的羟基上，形成O一糖苷键；3)木糖由半乳糖转移酶催化连接2个半乳糖残基形成为三糖核心区；4)再由高度特异的糖基转移酶作用逐渐按顺序延长，依次加上葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖，形成四糖核心区：GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ 1-O-Ser。这一四糖区的形成是所有PG形成过程中必须的相同过程；5)N-去乙酰化和N-硫酸www.med126.com化。随着GAGs的合成，N-乙酰葡萄糖胺（G1cNAc)的N-乙酞基由N-硫酸基取代。这个N-去乙酰化和N-硫酸化的反应均由磺基转移酶催化。这种特异性硫酸化不但赋予GAGs高密度的负电荷，而且也使GAGs具有能与其他的细胞外基质分子和生长因子相互作用的能力；6)在糖醛酸C5-异构酶作用下，葡萄糖醛酸C-5异构为艾杜糖醛酸。因此，XT-I是人体PG生物合成中的关键性起始酶。
2000年由Christian Götting等第一次分离出XT-II。经过研究证实，XT-II具有与XT-I 55%相同的的氨基酸序列，是与XT-I结构相似而特性不同的木糖基转移酶，二者都能够启动木糖连接类氨基葡聚糖的生物合成，而且同样具有参与PG生物合成的功能。
蛋白多糖在涎腺肌上皮肿瘤发生中的作用
通过生化试验、组织病理学分析及电镜研究均显示，涎腺多形性腺瘤和涎腺腺样囊性癌、肌上皮瘤结构中含有不同种类的PG（GAGs)，并且GAGs主要由NMCs分泌产生。因此，不同种类GAGs的合成分泌造成肿瘤细胞的组织形态的多样性[7, 8]。
研究报道，在涎腺多形性腺瘤中既存在小分子PG，如decornin和biglycan （HSPG一种)、lumican （硫酸皮肤素的一种，富含小分子亮氨酸)，也存在大分子PG，如versican和 aggrecan （均属CSPG)。有研究表明，它们对于涎腺多形性腺瘤的黏液软骨分化作用关键，均参与多形性腺瘤和腺样囊性癌等结构中间质样区域的构成；并且它们的表达水平与涎腺多形性腺瘤和腺样囊性癌的分化程度密切相关。
PG种类和构成比例在涎腺肿瘤中变化，对肿瘤的影响不尽相同。CSPG和HA类PG似乎在涎腺多形性腺瘤的黏液软骨化中起重要作用；而HSPG则在涎腺腺样囊性癌中表现较强的影响。
在最初形成的小囊样腔隙的腺样囊性癌中，肿瘤细胞表达高水平HSPG mRNA，而拥有较大囊样腔隙的腺样囊性癌中HSPG 的mRNA水平极低。这种变化可能是小囊样腔隙相互融合扩大成大囊样腔隙的筛状结构过程中，需要PG供给细胞能量并介导小囊样腔隙间细胞的粘附，因此，PG被认为是诱导腺样囊性癌筛孔状结构构成，并提供肿瘤细胞增殖的物质基础。
另外，在使用富含基底膜物质（IV型胶原、HSPG)的培养液中培养的腺样囊性癌ACC-2细胞可形成筛孔样囊腔结构。在黏液软骨样区丰富的涎腺多形性腺瘤肿瘤区域当中，肿瘤细胞增殖较快。有学者认为，PG富含液体成份、具有良好的组织通透性，代谢性能快，在缺乏血供的黏液软骨www.lindalemus.com/kuaiji/样区域和筛孔结构中，PG是肿瘤细胞主要的营养来源，为肿瘤细胞的生物学行为提供微环境。在富含PG的肌上皮细胞瘤中，CSPG表达约占ECM的78%，这种软骨样基质可以吸附大量阳离子生长因子，以及蛋白酶抑制物，其作用也表现为促进瘤体生长增殖。
蛋白多糖为涎腺肿瘤的复发、侵袭和转移提供营养
ECM与涎腺肿瘤的转移关系密切，ECM中基底膜是一种无细胞成分的均质状物质，主要包括：PG、IV型胶原、弹性纤维等，基底膜分子（IV型胶原、HSPG)对于涎腺肿瘤细胞和间质细胞的增殖影响极大，并且在肿瘤的侵袭过程中参与组织重建。
临床资料显示：涎腺腺样囊性癌组织学结构和转移特性与PG密切相关。富含PG的筛状型腺样囊性癌的转移侵袭能力较低，远处转移发生率明显低于PG匮乏的实性型腺样囊性癌，PG似乎是肿瘤的抑制因素；但筛状型腺样囊性癌易复发的特性以及涎腺多形性腺瘤术后的种植和复发，又与PG密切相关。
在应用免疫电镜和原位杂交技术对五种涎腺腺样囊性癌ACC细胞株的检测中均发现，腺样囊性癌ACC细胞产生470kDa核心蛋白的HSPG，它与IV型胶原等ECM共同影响腺样囊性癌ACC细胞的转移活性。
转移能力不同的腺样囊性癌ACC细胞株有不同PG的表达。卫晋雄曾比较腺样囊性癌ACC-M与其母系细胞ACC-2中HSPG指出：具有较高转移活性的腺样囊性癌ACC-M细胞的HSPG表达明显高于ACC-2，并且ACC-M细胞中的HSPG合成速度与沉积于细胞外基质的能力均明显高于ACC-2细胞。在对ACC-2细胞研究中发现，ACC-2细胞在富含蛋白多糖的基质中培养，其粘附、扩散、生长功能均增强。
随着研究的不断深入，利用PG进行肿瘤治疗的实验研究也取得一定进展，
本研究室最近研究发现，通过RNA干扰技术抑制涎腺腺样囊性癌高转移细胞株ACC-M的XT-I基因的表达，阻断其PG的合成与分泌后，ACC-M细胞的增殖、迁移及转移能力均明显降低，表明通过阻抑NMCs的PG合成与分泌，能够有效阻抑涎腺腺样囊性癌的增殖、迁移及转移的生物学行为，为涎腺肿瘤的临床治疗提供新思路和新策略。
蛋白多糖在涎腺腺样囊性癌嗜神经生长过程中的作用
以往的研究表明，涎腺腺样囊性癌发生淋巴转移较少见，但极易出现神经侵袭。肿瘤侵袭神经可以表现为包裹神经，破坏神经束膜，侵袭神经纤维束，或沿神经纤维束生长，甚至可以出现沿神经束膜的跳越式转移。因此神经浸润也被认为是腺样囊性癌远处转移的一条途径。
目前对涎腺腺样囊性癌嗜神经生长机理的研究，尚无确切定论。其研究内容主要集中在肿瘤细胞出现雪旺细胞分化、神经营养因子及其受体、神经细胞粘附分子，其它蛋白如细胞间粘附分子-5、整合素（integrin)、细胞外基质、基质金属蛋白酶及其抑制剂等方面。但这些机理仍不足以解释肿瘤的嗜神经现象。
通过对涎腺肿瘤中PG研究发现，PG为肿瘤生长提供相对疏松、营养丰富的环境，利于肿瘤细胞穿过致密的结缔组织，向神经方向迁移，可能成为其嗜神经生长的有利条件。另外，PG在其它有神经侵袭现象的肿瘤中也出现了高表达，如前列腺癌含有大量的透明质酸以及硫酸软骨素等。这些都提示PG可能在肿瘤的嗜神经生长过程中发挥重要的作用。
在生理情况下，主要存在于神经系统细胞外基质中的凝集素蛋白聚糖（lecticans)家族包括neurocan、brevican、aggrecan和versican，可以与神经系统中的肌腱蛋白（tenascin-R)等大分子物质结合，通过表面透明质酸结合域和C型凝集素介导富含透明质酸的细胞外基质的在神经周围聚集。这些分子物质可能使神经成为涎腺腺样囊性癌侵袭的靶目标。而且大量的PG还可以为肿瘤细胞提供充足的营养物质，可以使其肿瘤细胞在结构致密的周围神经纤维束内不断增殖、浸润，从而促进肿瘤的嗜神经生长。
蛋白多糖与涎腺肿瘤种植性生长的关系
转移是恶性肿瘤的独特生物学特征，严重影响肿瘤的预后。种植性生长作为恶性肿瘤的转移方式之一，主要见于胸腹腔等体腔内器官的恶性肿瘤，侵及器官表面时，瘤细胞可以脱落，像播种一样种植在体腔其它器官表面，形成多个转移性肿瘤。这种播散方式称为种植性转移。
一般认为肿瘤的恶性程度越高，越容易种植、复发。以往的临床研究发现，涎腺良、恶性肿瘤，形态结构复杂多样，如涎腺多形性腺瘤，虽然其形态学表现为良性肿瘤，因含有大量PG的黏液软骨样区域，肿瘤在手术后极易出现种植和复发。在以往的研究中，发现筛状型涎腺腺样囊性癌易复发的特性以及多形性腺瘤术后的种植和复发，与PG密切相关。
在其它系统的肿瘤研究过程中，有研究报道，硫酸肝素类及硫酸软骨素类PG参与介导了腹膜癌肉瘤（PC880)、卵巢癌（ES-2)及骨髓瘤细胞的粘附与种植，Versican也参与调控前列腺癌细胞与细胞外基质间的粘附，而促进其肿瘤细胞的种植性生长。
由此可见，PG对涎腺肿瘤的发生、发展以及预后都有着不可忽视的重要作用。我们通过阻抑涎腺肿瘤性肌上皮细胞NMCs的PG合成分泌，有效抑制了涎腺腺样囊性癌的增殖、浸润、迁移和远处转移等侵袭能力，表明PG阻抑，对于涎腺肿瘤有明显的阻抑作用，可望成为涎腺肿瘤治疗的一种新途径，为涎腺肿瘤的临床治疗开创新思路，提供新策略。
