药理学-电子教材:第十八章 病理学常用新技术原理及应用

图18-3食管鳞癌 E-cad膜强阳性   图18-4 神经胶质细胞GFAP胞浆胞膜阳性  图18-5肺硬化性血管瘤 TIF-1核阳性

阴性对照

（１)空白对照：用ＰＢＳ置换第一抗体；

（２)血清替代对照：用同种动物的正常血清代替第一抗体；

（３)抑制对照：用未标记的抗体先和相应的抗原结合；

（４)吸收对照：用纯化的抗原对抗体先行吸收；

阳性对照：用已知或已被实验证明为阳性的组织；

自身对照：利用组织切片内的各种不同的组织成分作对照。 

2．假阳性反应：

⑴ 非特异性反应：边缘现象、皱折和刀痕、出血和坏死等；

⑵ 内源性过氧化物酶：红细胞、炎细胞、退变坏死细胞和某些腺上皮分泌物，以及某些富含过氧化物酶的组织，如脑、肝等；

⑶ 抗体的交叉反应：抗体本身含有与人体组织发生交叉反应的成分；  

⑷ 试剂浓度过高或失效。

3．假阴性反应：

⑴ 组织固定不当或固定时间过长；

⑵ 抗体效价过低或久置失效；

⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔；

⑷ DAB或H₂O₂的浓度不当。 

五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断中的应用

（一)在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因

１．在常规病理活检中,通常有５～１０％的疑难病例不能明确诊断。

２．形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性淋巴瘤)因而难于识别，给治疗带来困难。  

３．一些转移性肿瘤常常缺乏特有的组织学特征，因而无法确定其原发病灶（如甲状腺癌和前列腺癌)。 

４．通过一些反映细胞增殖和与肿瘤恶性程度有关的标记物协助识别肿瘤的良恶性。

（二)各种不同组织及其肿瘤常见的标记物

免疫组织化学最突出的优点是能在微观世界原位地确定组织及细胞结构的化学成分，由于其方法简便且可重复性强，目前已得到广泛的应用，并正继续向着更微细、更精确的原位分子杂交和免疫电镜方向发展，向着分子病理学的领域推进。

表18-1 各种不同组织及其肿瘤常见标记物

第三节 电子显微镜技术

电子显微镜（electron microsocope)简称电镜，是以电子束为照明源，通过电子流对生物样品的透射以及电磁透镜的多级放大后的荧光屏上成像的大型精密仪器。按工作原理和用途的不同可分为透射式电镜（transmission electronmicroscope, TEM)和扫描式电镜（scanning electron microscope, SEM)二种基本类型。

一．透射式电镜

主要用于观察细胞内部的微细结构，由于电子的穿透力较弱，故用于透射电镜观察的标本必须切成50~100nm的超薄切片。换句话说，一个细胞要被切成100~200个薄片才适于在透射电镜下观察。样品在被超薄切片之前，一般要经过固定、脱水和包埋等处理，在切片之后还要经过染色等处理才能进行观察。

超薄切片术（techniques of ultrathinsection)是最基本的电镜样品制备技术，其基本过程同石蜡切片大体相似，包括取材、固定、漂洗、脱水、渗透与聚合、切片和染色等多个环节，但操作过程比石蜡切片更为细致与复杂。为了获得理想的超薄切片，操作者必须认真对待每一步骤，任何环节的疏忽都可能导致制样的失败。

合格的超薄切片样品应该达到以下基本要求：①切片的厚度应在50nm左右，不能超过100nm，以获得较高的分辨率和较高的反差；②切片应能耐受电子束的强烈照射而不发生破裂、变形；③细胞超微结构保持良好，没有明显的物质凝聚和丢失。

电子显微镜技术使病理学对疾病的认识，从组织细胞的光镜水平深入到细胞内的超微结构水平，它可观察细胞内的细胞器、细胞骨架或大分子水平的变化，在疾病的病理诊断中，电镜主要用于肾脏的细针穿刺活检标本，来进行肾小球肾炎的分型。在肿瘤诊断中，电镜在确定肿瘤细胞的组织发生、类型和分化程度上起着重要作用(图18-6)。可根据各种肿瘤细胞的超微结构特点来协助区别分化差的癌和肉瘤、各种梭形细胞恶性肿瘤、各种恶性小圆细胞肿瘤、各种神经内分泌肿瘤及恶性黑色素瘤等。其方法包括负染色技术、冷冻蚀刻技术、电镜细胞化学技术、电镜X射线显微分析技术、电镜放射自显影技术等在疾病的研究中已得到广泛的应用。

二．扫描电镜

扫描电子显微镜就是用聚得很细的电子束流照射要检测的样品表面。由于电子束与样品的相互作用产生各种信息然后通过不同的检测器接收相应的信息，经过处理后显示出样品的各种特征。

扫描电镜具有以下特点：能够直接观察样品的表面的结构；样品制备过程简单，不用切成超薄切片；可以从各种角度对样品进行观察；景深大，图像富有立体感；图像的放大范围广，分辨率也比较高(图18-7)；电子束对样品的损伤与污染程度较小；在观察形貌的同时，还可利用从样品发出的其他信号作微区成分分析。

采用冷冻树脂割断法将细胞打开，可以观察到细胞的内部结构。用铸型技术研究空腔脏器，尤其是血管系统复杂的立体分布。还可用盐酸化学消化法观察细胞的基底面及深层细胞表面结构。

第四节 共聚焦激光扫描显微镜技术

共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanningmicroscopy)可以从组织细胞水平直接进入亚细胞水平观察，且可利用计算机及图像处理系统对组织，细胞及亚细胞结构进行断层扫描，三维立体空间结构再现，将形态学研究从平面图像水平提高到三维立体水平，图像清晰鲜艳；还可在观察培养细胞形态结构的同时，直接显示培养活体细胞内的代谢www.lindalemus.com/sanji/变化(图18-8)，可以说病理学及其它形态学研究将出现一个全新的时代。

图18-8  共聚焦激光扫描图

左 体外培养神经细胞；中 花粉颗粒三维图像;右 神经细胞DNA含量荧光强度图

第五节 生物芯片技术

生物芯片技术（biochip technique)是将大量具有生物识别功能的分子或生物样品有序地点阵排列在支持物上并与标记的检体分子同时反应或杂交，通过放射自显影、荧光扫描、化学发光或酶标显示可获得大量有用的生物信息的新技术。生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片、以及元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。可对DNA、RNA、多肽、蛋白质、细胞、组织以及其它生物成分进行高效快捷的测试和分析。

一、基因芯片

基因芯片(genechip)是指采用原位合成或显微打印方法，将大量DNA探针固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测(图18-9)。可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况，为基因诊断、药物筛选以及新基因发现提供了有力的手段。    

图18-9 cDNA基因芯片检测mRNA表达

二、蛋白芯片

蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记了特定荧光素的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到检测多种蛋白质及其功能的目的。如抗体芯片可排列数百种单克隆抗体，通过这张芯片，人们在一次实验中就能够比较几百种蛋白的表达变化。对于诊断疾病：如传染病、肿瘤、遗传病等临床工作以及信号传导、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡和神经生物学等基础研究都具有广泛的应用前景

三、组织芯片

组织芯片又称组织微列阵（tissue microarray) 是将数十个 数百个乃至上千个小的组织片整齐的排列在一起到载玻片上，形成微缩的组织切片(图18-10)。

图18-10  组织芯片

其特点有：①体积小信息含量高.可根据不同需要进行组合和设计；②即可用于形态学观察也可用于免疫组织化学染色。原位杂交, FISH 等原位组织细胞学观察和研究；③高效快速,低消耗,自身内对照和可比性强,节时、省力、少材、高效利用库存蜡块肿瘤标本的新方法。一个蜡块可连续切片200张，以供原位分析肿瘤相关基因DNA及其表达的mRNA和蛋白质，荧光原位分子杂交（FISH)，mRNA原位杂交、免疫组化三种方法可同时在一个芯片蜡块的连续组织切片中应用。

因而可提高实验效率，一张组织芯片上可列阵数十至数百个样本。实验条件最大程度上保持一致，有助于减少实验误差。另外

一个组织芯片蜡块可连续切200张片，可进行许多分子标记检测。

最大限度地利用有限的标本资源，尤其是少见的病例标本，最小破损原有蜡块。

可同时检测一种肿瘤不同阶段的基因表达状况。能在一张片上同时看到一个肿瘤组织在原位、转移 、复发中的基因扩增情况。

第六节 激光显微切割技术

显微切割（micro-desection)就是在显微镜下用手工或仪器采样的方法从组织切片或细胞涂片上将所要研究的形态或表型相同的细胞从组织三维构造中分离出来，获得纯的细胞群（pure cell population)，以备进一步作分子水平的研究(图18-11)。显微切割技术的贡献就是克服了组织的细胞成分非常繁杂这一重大的缺点。

一、显微切割的方法

1．材料来源

微切割可用于福尔马林固定石蜡包埋的组织切片、冰冻切片、培养细胞和细胞涂片。但所用载玻片不准涂抹任何粘附剂，常用的组织切片是HE染色的常规石蜡切片（厚5μm)。

2．切割及细胞采集方法

微切割及细胞采集方法大体上可分为手工操作和仪器操作两大类。两者各有长短。从两个方面评价这些方法，一是准确性，即有无杂细胞污染；二是它的效率，能否在较短时间内采集到足够的细胞；当然也要考虑方法所需费用。

（1)手工操作  就是用消毒的细针或刀片搔刮组织切片（厚5~15μm)上的细胞，并将其移至Eppendorf管中。

（2)仪器操作  利用激光进行微切割和细胞采集，其特点是微切割的精度高，可进行单个或几个至数十个细胞的切割，可获得很纯的细胞群体，并适用于各种组织材料；再就是效率高，但仪器价格昂贵。具体又有4种不同的方法：①激光微光束微切割 ② 激光加压弹射③贴于膜上的原组织微切割 ④激光俘获微切割。

二、显微切割的应用

1．细胞基因突变及微卫星变异的研究

2．细胞基因拷贝数的变化和甲基化水平的检测

3．定量RT-PCR

4．比较基因组杂交

5．cDNA微阵列（芯片)

第七节 原位分子杂交技术

原位核酸分子杂交（in situ hybridization, ISH)是应用特定标记的已知核酸探针与组织或细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，杂交后的信号可以在光镜或电镜下进行观察。由于核酸分子杂交的特异性强、敏感性高、定位精确、并可半定量，因此该技术已广泛应用于生物学、医学等各个领域的研究之中(图18-12)。     图18-12肺腺癌

  β-catmRNA的表达，原位杂交

第八节 荧光原位分子杂交染色体分析技术

一、简介（introduction)

染色体原位分子杂交技术（Chromsome Analysis byFluorescence in situ Hybridization)的发展为研究染色体上DNA的序列提供了一个最直接的方法。具有经济、安全、快速、稳定，灵敏度高等优点，多彩FISH可在同一核内显示两种或多种序列，还可对间期核染色体进行研究(图18-13)；应用不同的探针可显示某一物种的全部基因，某一染色体染色片段及单拷贝序列；结合共焦激光显微镜可对间期核及染色体进行三维结构研究，精确检测杂交信号。

二、探针（probes)

1．基因组探针（genomic probe)：

人类基因组内一些高频率的重复序列，在进化上很少具有保守性。若以基因组DNA作为探针，这些存在于探针和靶细胞顺序中的高度重复序列之间会首先退火结合，越过那些保守的和单一的序列，故杂交会呈现出种特异性。利用这类探针在人鼠杂交细胞中可特异显示人的遗传物质。

2．染色体特异性序列探针（probe recognizing chromosome specificsequences)：

目前在人几乎所有染色体中已经克隆出一些重复序列，重复一百到五千次不等，各具染色体特异性。大多在某一染色体的着丝粒区或异染色质区产生致密的杂交带。从而可特异性地识别某一染色体。

3．染色体文库探针（chromosomelabraries probe)：

染色体文库收集人类单条染色体的DNA作为探针，又称整体染色体探针。单条染色体的获得一般有两种方法：来自仅携有某一条人类染色体的体细胞杂交株，或经流式细胞分类仪从染色体悬液中分离

4．单一序列探针（single-copysequences probe)： 

  FISH有一弱点，就是要求探针足够大，探针越小，杂交位点检出率就越低。欲利用FISH检测存在基因组内的单一序列基因，最有效的方法是应用含大插入片段的克隆载体，如全Cosmids（载约40kb的插入片段)，更大的YAC载体（载100-800kb插入片段)。若掌握好，小到2kb的质粒探针亦可用FISH方法定位，但效率较低。

三、FISH技术系列

1．24色mFISH核型分析技术

24色mFISH是近年建立的一种新技术。其原理是使用5种荧光染料按比例标记探针，杂交后形成24条染色体各自呈现特异的荧光色彩以供核型分析(图18-14)。为研究人员提供了更丰富详尽的细胞遗传学信息，包括确定标记染色体的来源、检测微小的染色体易位和检测复杂的染色体易位，尤其为肿瘤细胞染色体分析提供了全新、高效的方法 。

2．原位杂交显带技术(in situ hybridizationbanding,ISHB)

为了准确定位原位杂交部位所处染色体及其区带，染色体必须显带。但无论是先杂交后显带，还是先显带后杂交，杂交与显带过程会互相影响效果。后来人们注意到，人类短间隔插入重复序列中的一种Alu家族，Alu片段约300bp长，在基因组中重复约九十万次，平均间隔3-4kb就插入一个。有人利用部分Alu序列作为引物，用PCR方法扩增Alu之间的DNA，称Alu-PCR法。但Alu序列在基因组内分布不是随机的，有些区域比较密集，有些区域较稀疏。只有前者才有PCR产物。人们用Alu-PCR产物作为探针与人类染色体标本杂交，结果得到类似R带的荧光带型。故人们在进行基因定位时，只需将目的探针与Alu-PCR探针同时应用，用不同颜色的荧光标记，就可同时显示杂交信号和染色体带型。

3．FISH基因定位（FISH mapping)

基因定位时，不但需要确定某段靶序列在染色体上的位置，尚需确定两个或两个以上靶序列在线性DNA分子的排列次序和距离，才能绘出基因图。一般用同位素杂交：先确定每一靶序列在中期染色体上的位置，然后根据它们到端粒的距离确定出线形排列次序。而用FISH方法，两种或两种以上的探针能同时与中期染色体杂交，只要根据两种颜色杂交位点的相互位置，就能直接确定次序。但中期染色体是线形DNA分子经过折叠和包装后形成的，若两个靶序列相距很近，例如间距小于1Mbp，受包装过程的影www.med126.com响，它们在线形DNA分子上的排列与在中期染色体上的排列不一定相同，甚至可能完全相反。学者们发现，靶序列之间在间期核的平均相对距离与它们在线形DNA分子上的距离呈正相关。利用间期核FISH分析不但能排除染色体包装的影响，还能提高测距的分辨率(图18-15)。

4.FISH的应用

(1)基因定位与基因制图（genemapping) 原理前面已叙述。FISH已经极大地加速了人类基因定位和基因制图的进程。

(2)基因诊断(genediagnosis) 精确、直观、明了

(3)间期细胞遗传学（interphasecytogenetics)

(4)FISH在肿瘤生物学中的应用 

①肿瘤细胞遗传学（onco-cytogenetics)；②基因定位：FISH可用于分离出的癌基因与抑癌基因初步定位；③病毒基因插入基因组部分的检测：虽然逆转录病毒以激活原癌基因为主，也有像腺病毒、HPV、SV40等病毒以蛋白产物与抑癌基因蛋白产物相互作用而诱导细胞转化。但病毒基因特别是DNA病毒多有病毒基因成分插入到人基因组。利用FISH可以检测到病毒整合到人基因组中的情况，对深入研究病毒致癌机理，以及检测、防治肿瘤均具有重要意义；④基因的扩增与缺失：原癌基因的激活与抑癌基因的失活是目前肿瘤研究的热点。已知原癌基因的激活方式有：突变、基因扩增、易位、病毒序列插入。抑癌基因的失活方式有：点突变、基因缺失。FISH为研究基因的扩增和缺失提供了新的方法，能将基因扩增和染色体重复分开。

第九节 比较基因组杂交技术

比较基因组杂交技术(comparative genomehybridization,CGH)。

图18-16   食管癌细胞系CGH图

其基本原理是用不同的荧光染料分别标记正常人基因组DNA与肿瘤细胞DNA，然后与正常人中期染色体杂交，通过检测染色体上两种荧光（红、绿)的相对强度比率，两组DNA相异部分会显出颜色偏移，可计算出DNA的缺失与放大，从而了解肿瘤组织DNA拷贝数的改变，并能同时在染色体上定位(图18-16)。这样的方法使我们只要从新鲜组织或石蜡包埋肿瘤组织中提取少量DNA，就可进行全基因组检测。应用CGH技术检测癌变过程中的不同阶段，肿瘤进展的不同时期及不同类型肿瘤的非随机性染色体改变，有助于从分子细胞遗传学角度了解肿瘤的发生发展，对发现肿瘤遗传学标记，初步查寻肿瘤相关基因的位置均具有重要意义。其对检测原癌基因扩增较为灵敏，但对检测基因缺失敏感性则相对较弱。

第十节 流式细胞技术

流式细胞术（flow cytometry, FCM)是一种单细胞定量分析和分选的新技术，可对单个细胞逐个地进行高速准确的定量分析和分类。

流式细胞仪的主要工作原理是让荧光染色细胞在稳定的液流推动装置作用下通过直径为50~100m的小孔并排列成单行，每个细胞依次而且恒速通过激光束的照射区，细胞受激光照射后发生散射光和荧光。通过检测散射光可知细胞的体积，检测荧光可知细胞DNA或RNA的含量。细胞样品被检测后即形成一连串均匀的液滴，其形成速度约每秒3万个，而细胞通过小孔（喷嘴)的速度在每秒2000个以下。由此计算，平均每15个液滴中有一个液滴包有细胞，而其它液滴无细胞。由于液滴中的细胞是已被测定的细胞，因而，如其特性与被选定要进行分选的细胞特性相符，则仪器在含有这个细胞的液滴形成时就使其带有特定的电荷；否则，液滴不带电荷。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，依据自身所带电荷性质发生向左或向右偏转，落入各自的收集容器中。不带电荷的水滴就进入中间废液容器，从而实现细胞分选的目的。

因此流式细胞计可同时检测单个细胞DNA、RNA、细胞体积等参数，进行细胞周期与细胞凋亡的研究；并可分析细胞表面或细胞内的各种抗原、蛋白、酶、细胞因子和粘附分子以及基因表达产物；还可在无菌条件下，以高速对活细胞进行分类收集，其纯度达90~99%。此外还可应用于酶活性、细胞内和细胞膜受体、表面电荷、细胞内pH、细胞和线粒体膜电位、细胞浆和膜结合的钙离子、膜的完整性、流动性、通透性或微粘度等功能研究。

第十一节 组织培养与细胞培养技术

组织与细胞培养(tissue and cell culture)是将活体内部分组织细胞取出后在人工条件下使其生长，繁殖和传代。在体外对细胞进行生命活动、细胞癌变等问题研究。还可施加实验因子进行形态、生化、免疫、分子生物学观察，已广泛应用于病理学的各个研究领域。

原代培养：由体内直接取出组织或细胞进行培养。优点：离体时间短，遗传性和体内组织相似。宜作细胞形态、机能和分化研究。

传代培养：把细胞自原代培养的培养瓶中分离、稀释而移至另一新的培养瓶中的操作程序即为传代或再培养。以便持续培养，得到大量同种细胞，或建成细胞株，维持细胞种延续(图18-17)。