生物化学-实验指导

项目性质：研究性

实验学时：4

分组人数：1人

实验原理:

蛋白质中的酪氨酸等与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。

福林—酚法测定蛋白质的反应原理可分为两个步骤：

1.在碱性溶液中，蛋白质与铜离子发生反应：

Cu⁺⁺ + 蛋白质→ Cu-蛋白质

2.Cu-蛋白质使试剂中的磷钨酸—磷钼酸还原成为蓝色化合物，测定光吸收值就可以推算出蛋白质的含量。试剂中的碳酸钠有缓冲作用，使溶液的pH值保持在10左右，显色最深。福林—酚法的灵敏度高、蛋白质浓度测定范围是25～250μg。

但此法实际上是蛋白质中酪氨酸和色氨酸等与试剂的反应，因此它受蛋白质氨基酸组成的影响，即不同蛋白质中氨基酸组成的不同会使显色强度有所差别；此外，样品中酚类及柠檬酸的干扰而使结果偏高。低浓度的尿素（约0.5%左右)、胍（0.5%医.学全在线www.lindalemus.com左右)、硫酸钠（1%)、硝酸钠（1%)、三氯醋酸（0.5%)、乙醇（5%)、丙酮（0.5%)对显色无影响，上述物质浓度高时必须做校正曲线。

操作步骤：

1.制作标准曲线

(1) 标准蛋白的选择： 最好选择与待测样品相同或组成类似的蛋白质作为标准蛋白溶液。

(2) 标准蛋白溶液的配制：将标准蛋白经凯氏定氮法准确测定其蛋白质含量，再用无离子水配制成1.0 mg/ml的储存液。

(3) 按照表1  配成不同浓度的标准蛋白组，编上号码，以第一管为空白管，在分光光度计上测定650nm处的光密度值。

表1  不同浓度的标准蛋白组配置

(4)  以各标准溶液浓度为横坐标，各管的光密度值为纵坐标作图，作标准曲线。

标准曲线必须从零点出发，最好能成一直线，画好后，注明所用仪器的型号及编号，所用波长及测定方法，名称及制做日期。

2. 样品蛋白的测定: 取试管2只，按表2 操作。

   表2  样品蛋白的测定

    注意：各管加酚试剂必须快速，并立即摇匀，不应出现浑浊；测定蛋白质的浓度最好在15～110μg范围。

试剂：

1.试剂A：2g酒石酸钾钠及100g Na₂CO₃ 溶于500ml 1.0mol/L NaOH 中，用水稀释至1000ml。

2.试剂B：2g酒石酸钾钠及1g CuSO₄.5H₂O分别溶于少量水中,混合后加水至90ml再加1mol/L NaOH 10ml即成。

3.试剂C：市售的酚试剂按1：15稀释，最后浓度为0.15-0.18mol/L(用标准NaOH 滴定)。

称取Na₂WO₄.2H₂O及Na₂MoO₄.2H₂O 各25g溶于蒸馏水700ml中，加入85% H₃PO₄ 50ml、浓HCl 100ml，混匀后，置圆底烧瓶中加热回流10小时，加入Li₂SO₄.H₂O 150g、蒸馏水50ml及溴水（Br₂)数滴，溶液变为红黄色，置通风橱内加热沸腾15分钟蒸发Br₂，溶液呈透明的金黄色，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，过滤，置棕色瓶中保存，用标准NaOH标定其浓度，应用时用蒸馏水稀释至浓度为0.15～0.18mol/L。

溶液中的硫酸锂能防止磷钼酸沉淀，溴可以氧化试剂中的还原物质，使其不致干扰显色。4.标准蛋白溶液：称量干燥的人血清白蛋白（BSA)或丙种球蛋白10mg，用生理盐水配制成1mg/ml的标准蛋白溶液。

5.生理盐水。

思考题：

1.Lowry 法测蛋白的反应原理及试用范围？

2.测量蛋白的方法有几种？各自的优点是什么？

实验性质：验证性

实验学时：4

分组人数：1

（一)实验原理

以唾液淀粉酶为例。

1. 温度对酶活性的影响

（内容原理)

(C₆H₁₀O₅)_n  (C₆ H₁₀O₅)_n      C₁₂H₂₂O₁₁

淀粉(胶体液乳状光泽)      糊精      麦芽糖   

（1)与碘反应呈不同颜色，蓝、紫、红等，由淀粉断裂而成大小不等情况而定。

（2)不与碘呈色，淀粉空间结构被完全破坏。 

（3)与碘反应呈蓝色（直链淀粉)。  

（技术原理)

     判断  间接判断  

碘   是否水解；水解程度     淀粉酶的活性大小  

   淀粉与碘反应后的颜色

2. pH对酶活性的影响  唾液淀粉的最适pH为6.9。

用碘判断底物淀粉消失的快慢，间接判断酶活性高低。

3. 激动剂、抑制剂对酶活性的影响。

非必需激动剂：Cl^-离子

  唾液淀粉酶

强烈抑制剂：Cu²⁺离子

 （二)操作

1. 收集唾液

脱脂棉过滤，   2 ml（0℃-4℃水浴5分钟待用)   5~10倍  滤液  其余37℃水浴保存  

2. 温度对酶活性的影响

分组：见表6-36。

表6-36  温度对酶活性的影响加样

   1 2   3  4  备注

第1步   20滴 20滴  20滴 20滴   10g/L淀粉

第2步   0℃-4℃水浴5min 37℃水浴5min   冷温处理

第3步   预冷唾液10滴   预冷唾液10滴  唾液10滴   煮沸唾液10滴 唾液

第4步  搅匀0℃-4℃水浴5min   搅匀3 7℃水浴5min  冷温处理

第5步   2滴    37℃水浴10min 2滴   2滴  2滴   碘液 

加唾液后应混匀各管，加碘液后摇匀，观察并解释结果。

3. pH对酶活性影响

（1)分组：见表6-37。

   表6-37  pH对酶活性影响加样

管号

1 2   3

磷酸盐缓冲液   pH5.0 2 ml  pH6.8 2 ml pH8.0 2 ml

10 g/L淀粉液   2 ml  2 ml   2 ml

稀释唾液   10滴  10滴  10滴

（2)比色：取瓷比色盘一个，预先在各池中分别加滴稀碘液。

每隔1分钟从第3管中吸取溶液1滴，加到已加有碘液的比色盘小池中，直至此管溶液与碘呈棕色向各试管加碘液2滴，摇匀观察。

4. 激动剂、抑制剂对酶活性的影响

（1)分组（试管)：见表6-38。

表6-38  激动剂、抑制剂对酶活性的影响加样

（2)比色：取瓷比色盘1个，预先加入一排碘液，各池1~2滴。

 每隔1分钟从第3管吸取保温液1滴测碘反应，直至与碘呈棕色，向各试管加碘液2滴，摇匀观察。

（三)实验材料

（1)10g/L淀粉液。

（2)碘液：称取I₂ 1g，KI 2g，同溶于100 ml蒸馏水中，贮于棕色瓶。

（3)10g/L NaCl。

（4)10 g/L CuSO₄。

（5)10 g/L Na₂SO₄。

（6)磷酸盐缓冲液

1)pH 5.0，0.2mol/L磷酸氢二钠在pH计下以0.2mol/L盐酸调节至pH5.0。

2)pH 6.8，1/15 mol/L磷酸氢二钠49.6ml加入1/15 mol/L磷酸二氢钾50.4ml。

3)pH 8.0，1/15 mol/L磷酸氢二钠94.7ml加入1/15 mol/L磷酸二氢钾5.3 ml。

（四)思考题

系统归纳温度、pH及激动剂、抑制剂对酶活性的影响。

实验性质：验证性

实验学时：4

实验分组人数：1

实验原理

从不同组织、细胞中获得高质量的DNA是进行各种研究的先决条件。DNA以核蛋白形式存在于细胞核中，制备DNA的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净、又要尽可能保持DNA分子的完整。为了获得大分子量的DNA，一般采用蛋白酶K和去污剂温和处理法。

在提取DNA的反应体系中，SDS将细胞膜、核膜破坏，并将组蛋白等从DNA分子上拉开，SDS及EDTA抑制细胞中DNA酶的活性，蛋白酶K将所有蛋白降解成小肽和氨基酸，随后用酚--氯仿抽提,将蛋白质和DNA分离,得到较纯的DNA分子。

操作

1.取动物新鲜组织约50mg，用预冷的生理盐水洗去表面残血，剪碎，加入450μl STE裂解液和50μl 10%SDS至终浓度为0.5%，匀浆后再加入10mg/ml的蛋白酶K5μl至终浓度为100μg/ml， 置55℃水浴箱保温3小时。

2.取500μl反应液加入等体积Tris·Cl(pH8.0)饱和酚，颠倒混匀10 min，4000rpm离心5min。

3.取上层粘稠水相，加入酚：氯仿∶异戊醇(25：24∶1)液至1ml，颠倒混匀10min，4000rpm离心5min。

4.取上层水相，加氯仿∶异戊醇(24∶1)液至1ml，颠倒混匀5min，4000rpm离心5min。

5．取上层水相，加1／10体积pH5.2的3M NaAC,加入预冷的无水乙醇至1ml，缓慢摇动混匀，可见乳白色丝状DNA沉淀出现，12000rpm离心15min。

6.弃上清，向沉淀中加75%乙醇500μl漂洗，12000rpm离心3min。

7.弃上清，沉淀室温干燥，加入100μlTE溶解。

实验试剂

1．STE裂解液：

 5ml 1M Nacl

0.5ml   1M Tris-cl   (PH8.0)

0.1ml   0.5M EDTA  (PH8.0)

加水定容至 50 ml。

2、10%SDS

3．10mg/ml蛋白酶K

4．Tris-HCl(pH8.0)饱和酚

5．酚：氯仿：异戊醇 (25：24：1)液

6．氯仿：异戊醇 (24：1)

7．3M NaAC（pH5.2)溶液

8．冷无水乙醇

9．75%乙醇

10．TE： 10mM Tris-HCl(pH7.6), 1mM EDTA(pH8.0)

注意事项

1．.获得高分子质量DNA的关键之一是防止DNase降解。标本必须新鲜。在提取前，细胞应保持完整，核和溶酶体等细胞器应没有明显破坏。提取DNA用的离心管等器皿及试剂应提前消毒，操作时要尽可能在10℃以下。在提取DNA的过程中还应尽量避免DNA的机械剪切作用，因此在抽提过程中应尽可能避免剧烈振荡。

2．除组织外，外周血白细胞、胎儿羊水细胞、胎盘以及培养细胞也是大量提取DNA的最适宜来源。

思考题

1. DNA提取过程中为什么不能剧烈震荡。

2. 如何进行细胞的破碎。