医学生物学-网络教学:实验指导

《医学生物学》（六版教材)实验指导

供临床、预防、口腔、麻醉、影像、检验、法医专业用

前　　言

医学生物学是一切生命科学的重要基础学科。近几十年来医学生物学发展迅速，其研究成果广泛应用于基础医学和临床医学，是现代医学教育中重要的基础课程。掌握医学生物学的实验研究方法对于从事基础医学和临床医学工作是十分必要的。

随着分子生物学等学科的迅速发展和渗透，医学生物学的研究范畴不断拓宽，内容不断深化，在教学中要求不断更新，知识结构不度不断改善。生物实验主要针对本科生医学生物学实验教学的需要而编写的。编入的实验方法和实验材料力求体现多样性和多层次性。

医学生物学共编入实验7个，内容涉及显微镜技术、细胞显微结构、细胞显微测量、细胞化学成分显示、细胞分裂、系谱分析、人及小鼠染色体制备、染色体分析。对每一实验项目的室验原理、技术方法以及注意事项均有充分的阐述，并设计了实验报告，实验报告中包括注字、绘图、填空、简述、识别、选择等，以考察学对实验内容的掌握。

一．目的要求

1．掌握学习医学生物学实验课的基本知识。

2．熟悉实验室环境。学生固定坐号、显微镜号；明确实验室规则；明确显微镜各部件名称、使用和保养

3．熟练掌握光学显微镜的使用、小鼠和人的染色体标本制备技术、实验动物的解剖、人类X染色质标本的制备、细胞的显微测量，熟悉细胞化学成分显示的原理、体细胞有丝分裂和生殖细胞减数分裂在显微镜的不同、人类染色体核型分析，了解各种细胞及细胞器的形态特征。

二．注意事项

1、课前准备工作

⑴按教学进度表的实验内容预习实验指导，参看教学大纲和教材有关内容，明确实验课的目的要求和内容．

⑵携带教材、教学大纲、教学进度表、实验指导、绘图纸、刀、小尺、橡皮擦和铅笔进入实验室．

⑶按编号领取显微镜入坐．

2、实验课要求

⑴ 遵守实验室规则．

⑵根据实验指导正确使用显微镜观察实验内容．观察中应参看教学大纲和教材，积极思维，分清主次，注意局部和整体的关系、平面和立体的关系、理论和实际的关系、结构和机能的关系．

⑶在看懂并理解实验内容的基础上，进行观察、操作、解剖等．在做实验过程中随时完成本单元

《医学生物学实验报告》所规定的全部内容，绘图必须按照生物绘图的要求进行，禁止涂色。

3、课后复习工作
根据教学大纲结合讲课和实验课所学内容，对教材进一步复习，整理心得笔记，巩固所学知识．如遇问题，可在辅导时间答疑．

项目编号：030501

项目名称：光学显微镜的基本构造及使用

项目性质：观察性、必修

实验学时：4学时

实验分组人数：1人

实验内容、方法：

[ 目的要求 ]

1．熟悉普通光学显微镜的主要构造及其性能

2．掌握低倍镜及高倍镜的使用方法

3．初步掌握油镜的使用方法

4．初步学习掌握显微镜临时装片的制备

5．初步训练镜下绘图的能力

[ 实验材料 ]

1．器具 显微镜、载片、纱布、盖片、吸水纸、滴管、滴瓶、剪刀、镊子、擦镜纸、镜油、美兰染液、牙签

2．材料 字母装片、绣球叶表皮装片、洋葱表皮装片、蒸馏水、蛙血涂片、细菌涂片、洋葱

[ 光学显微镜的使用方法 ]

1．准备工作及观察要求

（1)将显微镜小心地从镜箱中取出（较长距离移动显微镜时应以右手握住镜臂，左手托住镜座)，放置在实验台上偏左侧，以镜座后端离实验台边缘约3~6cm为宜。

（2)检查显微镜的各个部件是否完整和正常，如果是镜筒直立式光镜，可使镜筒倾斜一定角度以方便观察。但倾斜角度一般应超过45°，否则显微镜重心不稳，易发生倾倒。

（3)使用显微镜观察标本时，要求双眼同睁，双手并用，逐步养成左眼观察、右眼看图，左手调焦、右手移片或绘图记录的习惯。

2．低倍镜的使用方法

（1)调光：打开实验台上的工作灯，转粗调螺旋，使镜筒略升高（或使载物台下降)，调节物镜转换器，使低倍镜转到工作状态（即对准通光孔)，当镜头完全到位时，可听到轻微的扣碰声。

打开光圈并使聚光器上升到适当位置（以聚光镜上端透镜平面稍低于载物台平面的高度为宜)，然后用左眼向着目镜内观察（注意勿闭右眼)，同时调节反光镜的方向，使视野内的光线均匀、亮度适中。

（2)放片：取一张玻片标本，先对着光线用肉眼观察标本的全貌和位置，再将玻片标本放置到载物台上用标本移动器上的弹簧夹固定好，注意使有盖玻片或标签的一面朝上。然后转动移片器的螺旋，使需要观察的标本部位对准物境。

（3)调焦：用眼睛从侧面注视低倍境，同时用粗调螺旋使镜头下降（或载物台上升)，直至低倍镜头距玻片标本的距离小于6mm（注意操作时必须从侧面注视镜头与玻片的距离，以避免镜头碰破玻片)。然后用左眼在目镜上观察，同时用左手慢慢转动粗调螺旋使镜头上升（或使载物台下降)直至视野中出现物像为止，再转动细调螺旋，使视野中的物像最清晰。

如果需观察的物像不在视野中央，甚至不在视野内，可用标本移动尺上下左右移动标本的位置使物像进入视野并移至中央。在调焦时如果镜头与玻片标本的距离已超过了1cm还未见到物像，应严格按上述步骤重新操作。

3．高倍镜的使用方法 使用高倍镜前一定要在低倍镜下找到物象后，把要放大的部分移动到视野中央，然后按照高倍镜的操作程序进行。

（1)转动旋转盘，从侧面注视物镜换入高倍镜，转动时速度要慢，注意听到卡扣的固定声响，才算准确换入，特别当心高倍镜是否触碰玻片，如碰及玻片证明低倍镜的焦距没有调节好，应依法重作。

（2)调节物距，用左眼自目镜观察（右眼不闭)。这时物象往往不清晰，右手慢慢转动细调节轮，转动范围不宜太大，一般只须向上转动半圈或一圈，就能清晰地看到物象，在特殊情况下，有的显微镜须向下转动细调节轮或多转几圈才能使物象清晰，这要根据自己所用显微镜的情况而定，切忌用粗调节轮代替细调节轮。

（3)更换玻片标本，应该先转动粗调节轮，提高镜头，才能取下玻片标本。切勿急于推移，以防磨损镜头。

有些显微镜在低倍镜准焦的状态下直接转换高倍镜时会发生高倍物镜碰擦玻片而不能转换到位的情况，此时不能硬转，应检查玻片是否反放、玻片是否过厚以及物镜是否松动等情况后重新操作。如果调整后仍不能转换，则属高倍镜镜头过长，此时应将载物台下降或使镜筒升高后再转换，然后在眼睛的注视下使高倍镜贴近盖玻片，再边观察目镜视野边用粗调螺旋极缓慢地使载物台下降或镜筒上升，看到物像后再用细调螺旋准焦。

4．油镜的使用方法

油镜的放大倍数比高倍镜要大，所以透镜较小，为了使透过镜头的光线集中，以使清楚地观察物体，所以使用油镜时要在玻片上加一滴镜油。

（1)使用时，加镜油一滴于标本盖片上，并将标本放在载物台上，用载片推进器固定好，先用低倍镜对好光然后转动旋转盘换用油镜。将油镜放正，这时从侧面观察并慢慢转动粗调节轮使镜筒下降，使油镜头接触油滴，并使镜头几乎与标本接触，但千万不可压住标本片，以免损坏镜头。

（2)用左眼自目镜观察并慢慢向内转动粗调节轮使镜筒上升。（注意此时只准向内不准向外转动，以免压碎装片，损坏镜头)。当视野中出现有模糊的被观察物体时，再改用细调节轮向内转动直到所观察的物体清楚为止。如果视野不亮可将光圈放大。

（3)如果再向内转动粗调节轮时镜头已离开油滴，但还未找到物体时，可以自侧面观察将镜头下降重新操作。

（4)镜油使用后，必须用擦镜纸擦去镜头上的镜油，先用擦镜纸沾点二甲苯擦拭镜头，然后再用干擦镜纸将镜头擦干，否则固定镜头的胶质能被二甲苯溶解，日久镜片则自行脱落。

（5)用以上方法观察细菌装片

[ 观察 ]

1．字母装片

2．绣球叶表皮装片的观察  在低倍镜下观察时可见多为不规则的细胞，中间有核，保卫细胞较小，常呈肾形，两个保卫细胞间的空隙即为气孔。

选择一个轮廓清晰的细胞，以细胞核为标准，反复移动玻片标本，熟练所需方位的移动，并在低、高倍镜下比较细胞壁、细胞核的放大和清晰的程度。

3．洋葱表皮装片的观察  在显微镜下可见洋葱磷叶表皮是由许多略呈长方形的细胞组成。每个细胞外均有一层很厚的粉红色的细胞壁，细胞内可见园形或椭圆形粉红色的细胞核。

4．蛙血涂片观察  蛙血涂片经瑞氏染液染色后，正常结果是红细胞质为粉红色或桔黄色，红细胞核为兰紫色，白细胞的核也为兰紫色。如果某种原因染色过酸或过碱时，红细胞和白细胞的颜色有所改变。取蛙血涂片先置于低倍镜下观察，可见有许多椭圆形的红细胞，选择分散均匀的细胞，换用高倍镜观察，可见红细胞内有椭圆形的兰紫色核，仔细观察还可找到白细胞，白细胞比红细胞少，细胞核有多种形状。它们各染成什么颜色？

5．  哺乳动物血涂片观察  小鼠血涂片经瑞氏染液染色后，正常结果红细胞粉红色或桔黄色，白细胞的细胞核为兰紫色，血小板小而不规则，常聚集成群，经瑞氏染液染色后，呈兰紫色。如某种原因染色过酸或过碱时，上述颜色有所变化。取小鼠血涂片先置于低倍镜上观察，可见有许多园形的红细胞（没有细胞核)，选择分散均匀的细胞，换用高倍镜观察。哺乳类的白细胞比红细胞大，都有核。核具多种形状，试能观察到几种？看完以上两种血涂片后，请问它们的红细胞有何区别？

[ 洋葱鳞叶表皮临时装片的制备 ]

先把载片与盖片洗净，用左手的拇指和食指夹持载片长轴的两端。用右手拇指与食指夹住纱布，置载片于纱布间。而后以两指沿载片两面来回带动纱布，直到擦试干净。擦时用力要均匀，以免把载片弄碎，尤其是盖片很薄易碎，同法擦试盖片。

在擦试干净的载片中央加水一滴（约一粒黄豆大小)，用镊子夹住盖片一边或用拇指和食指拿住盖片的两边，使盖片一边先接触载片和水，然后慢慢斜放盖片，避免气泡产生。如水分过多，用吸水纸从盖片的一边吸出些，如气泡太多则应重做，依法反复练习多次。

用解剖镊子撕下约2—3mm大小洋葱磷叶表皮（越薄越好)，再置于载片中央的水滴中（如产生皱褶，应轻轻展平)。盖上盖片即可观察。将做好的洋葱鳞叶表皮临时装片，置低倍镜下观察，可见洋葱鳞叶表皮是由许多略呈长方形的细胞组成的，换用高倍镜观察，每个细胞外边均有一层很厚的、由纤维素构成的细胞壁（一般在显微镜下呈双线状)，细胞核为圆形或椭圆形，常位于细胞中央或靠近细胞边缘，有时反复调节细调节轮，或许可以看到核内有一个或两个折光率较强的核仁。在细胞边缘部分可见到细微颗粒的细胞质，再选择一个细胞核位于边缘的细胞进行仔细观察，在细胞中央部分可见充满明亮细胞液的液泡。

[ 人腮上细胞临时装片]

用消毒牙签的钝端轻轻刮取自己腮内侧粘膜少许，置于载玻片中央的水滴中，用原牙签轻轻搅动使粘膜散开，依法盖上盖片，先于低倍镜下找到散列的，形态轮廓清晰的细胞，再换高倍镜仔细观察，上皮细胞扁平而不规则，内为透明的细胞质，中央有一个椭圆形细胞核，可以观察用美兰染色的标本，细胞结构更清晰。

染色法，在盖片一边滴一滴美兰液，从盖片的相对边用吸水纸将水吸出，美兰液则随之布满整个盖片而使标本着色。

[ 生物绘图方法和注意事项 ]

1．每一个学生应准备好铅笔（HB)、橡皮等绘图用具。

2．绘图严格依据实物，力求真实精确、清洁有序。

3. 绘图前应对标本进行仔细的观察，看清形态并识别其内部结构后再绘图表示。

4. 图右侧用引线注明各部名称，引线必须平直、均匀、不得互相交叉、字体工整。

5. 绘图、注字、引线一律使用黑色铅笔，不准用钢笔、圆珠笔或其他彩色铅笔。

6. 生物绘图不涂色，不投影，只能用线条和点表示。色深用密点，色浅用稀点，点要圆。

绘图：人腮上皮细胞、洋葱表皮细胞等，注明各部名称。

[ 思考题 ]

1．使用低倍镜观察标本需要那些步骤？

2．为何必须首先在低倍镜下清楚的看到物像后才能用高倍镜观察？

3．举例说明临时装片的制备

项目编号： 030502

项目名称：细胞化学成分的显示

项目性质：综合性

实验学时： 4学时

实验分组人数：1人

实验内容、方法：

[ 目的要求 ]

1、了解细胞化学实验的原理

2、熟悉细胞内DNA和RNA的显示

3、初步掌握动物解剖技术

[ 实验原理 ]

细胞内DNA和RNA的显示

原理：细胞经甲基绿一哌罗宁混合染液染色后，其DNA和RNA可被染上不同颜色。一般认为这是由于两种核酸的聚合程度不同所致。在两种染液混染时，两者发生竟争，DNA（高聚分子)能被甲基绿染成绿色，RNA（低聚分子)则被派罗宁染成红色。由于此反应特点，就立即使细胞中两种核酸从颜色方面区别出来。

[ 实验材料 ]

1、器具：显微镜、载片、盖片、纱布、吸水纸、培养皿、甲基绿——哌罗宁混合染色液、、吸管、染色缸、70%乙醇、Ringer氏液、纯丙酮、剪刀、镊子、蒸馏水、1/3000中性红染液、美兰、镜油、擦镜纸。

2、材料：蟾蜍

3、试剂：甲基绿——哌罗宁混合液；Ringer氏液；1/3000中性红染液；明胶显影液；50%硝酸银液。

4、试剂的配制：

（1)甲基绿——哌罗宁染液：

①  0.2mol/L醋酸缓冲液（PH4.8)

配方：冰醋（乙)酸1.2ml，加蒸留水至100ml。醋酸钠（NaAc,3H₂O)2.72g，溶于100ml蒸馏水中，使用时两液按2:3比例混合。

②  2%甲基绿染液

配方：去杂质甲基绿粉（Mehyl green)2.0g 0.2mol/L醋酸缓冲液（PH 4.8)100ml.

甲基绿粉往往混有杂质甲基紫，会影响染色效果，所以必须预先除去。方法：将甲基绿粉溶于蒸馏水中，放在分液漏斗里，加入足量的氯仿用力振摇，然后静置，去除含甲基紫氯仿，再加入氯仿，如此反复数次，直到氯仿中无甲基紫颜色为止，最后放入40℃温箱干燥备用。

③1%哌罗宁染液：哌罗宁（吡罗红G,pyronin G)1.0g0.2mol/L醋酸缓冲液（PH4.8)100ml。

④临用时将2%甲基氯液和1%哌罗宁液5：2混合即成。

（2)Ringer液

配方： 氯化钠 8.5g、 氯化钾 0.14g、 氯化钙 0.12g、磷酸氢二钠0。01g、重碳酸钠0.20g、葡萄糖2.0g、水100ml

（3)1/3000中性红染液：

称取0.1g中性红溶于300ml蒸馏水中。

（4)明胶显影液：

配方：明胶粉0.2g、三蒸水10ml、甲酸 0.1lml

在加甲酸时要不停的摇动，使之完全溶解。

50%硝酸银液

配方：硝酸银 4.0g、三蒸水8ml

以上染液用临配，保持新鲜，染色效果好。

（5)硝酸银甲酸混合液

称取硝酸银500mg，放入0.1%甲酸溶液6ml中使之充分溶解，并在20分钟内使用。

（0．1%甲酸溶液，取0.lml甲酸至100ml蒸馏水中)

[ 内容与方法 ]

1．细胞内DNA和RNA的显示

蟾蜍血涂片的制备：

将蟾蜍或青蛙杀死，剪开体腔，从心脏取血，拿一张载玻片，将血液在载片的右端，另用一张边缘光滑的载片，以其端边缘置于血液左缘，然后稍向右退，血液就它充满在两玻片的余角中，再以40_­°角向左方推动，即涂成血液薄膜。如图3-21所示：

取一张蟾蜍血涂片，在70%醇中固定5-10分钟，晾干后，滴甲基绿一哌罗宁混合染液于涂片上，染色20分钟，蒸馏水冲洗用吸水纸吸去上多余水分。但血膜处不可吸得过干。然后纯丙酮中浸一下进行分色。

（3)观察

在高倍镜下仔细观察红细胞核和细胞质各被染上什么颜色？如能看到核仁应被染成什么颜色？这种染色差异说明什么？

2．蟾蜍透明软骨活细胞及动物细胞液泡的观察。

解剖蟾蜍，剪胸剑突软骨边缘最簿的部分一小块，放入载玻片中央的1/3000中性红染

液中，染色5—10分钟，然后用吸管吸去中性红染液，滴加Ringer氏液，盖上盖玻片，镜检可见，软骨细胞为椭圆形，细胞核及核仁清晰可见。在细胞核的上方有许多被成玫瑰红色的小液泡。

3．骨胳肌标本的制备和观察：

剪开蟾蜍腿部皮肤，剪下一小块肌肉束（3mm)，放于载玻片用镊子和解剖针沿着肌肉束的方向剥离肌肉束，获得如头发丝粗细的肌纤维，滴少许Ringer氏液，盖上盖玻片，置于低倍镜下观察，可见每个细胞上有许多细胞核位于细胞边缘，紧贴细胞膜的内侧，换高倍镜观察，可见细胞上有许多横纹。

（2)制备蟾蜍脊髓压片观察脊髓前角运动神经细胞

在蟾蜍口裂处剪去头部，除去延脑，剪开椎管，可见乳白色的脊髓，取脊髓一段（0.5厘米)放在平皿内，用Ringer氏液（两栖类等渗溶液)洗去血液，放在载玻片上，将另一载片压在标本上，用拇指压标本，将上面的载片抽下即可得到压片，在压片上滴一滴甲苯胺兰染液，染色10分钟，盖上盖片，吸去多余染液，在显微镜下观察，染色较深的小细胞是神经胶质细胞，无突起，染成兰紫色的、大的、有突起的细胞是脊髓前角运动神经细胞，多呈三角或星形。

10．核仁形成区的银染显示与观察

（1)原理：

人类的rRNA基因位于近端着丝粒染色体（13、14、15、21、22号)短臂的次缢痕上，与核仁形成有关，因此该区域称为核仁形成区（nucieolar organizer region NOR)。银染方法可以特异性地将核仁形成区染成棕黑色，这种银染阳性的核仁形成区称为Ag—NOR。该区域即为编码18S RNA的和28SRNA基因的分布区。当用银染时，具有转录活性的rRNA基因部分有丰富的酸性蛋白，或已转录过的rRNA基因上仍有残余的酸性蛋白质，才被银染着色呈黑色。因为它们具有硫氢基和二硫键，容易将Ag还原成Ag的颗粒，而没有转录活性rRNA则不着色，故其着色的频率与细胞中具有转录活性的rRNA基因相一致，银点的大小也反映rRNA基因转录性的强弱。因此，计数在不同生理、病理条件下，细胞中银染核仁形成区（Ag—NOR)的频率是探讨基因功能的方法之一。人类近端着丝粒染色体的随体之间常发生联合，可能是造成近端着丝粒染色体不分离和易位的原因，银染技术又可作为近端着丝粒染色体联合的客观标准。

2．方法；

（1)取一张片龄在1周内的染色体玻片标本（新鲜的标本片染色效果更好)，在片上滴加2滴明胶显影液，然后加4滴50%AgNO₃溶液，轻摇标本片，使两液混匀后，即盖上盖玻片。

（2)将标本放在68℃—70℃恒温水浴箱的金属板上，观察片子的液体，当出现大量气泡时再轻摇片子，使染色均匀，这时可见混合物很快变黄，待1.5—2分钟即呈棕色。

（3)取出标本片，用蒸馏水冲去盖玻片上的多余染液后，自然晾干镜检。

3． 观察

取银染玻片标本，在低倍镜下找到分散较好的中期分裂相，换油镜观察，可见中期分裂相中的染色体被染成黄色，而某些染色体上有银染黑色，即为核仁形成区。凡有银染黑点的染色体不论单侧或双侧，都计数为已被银染的染色体。

项目编号：030503

项目名称：细胞及细胞器基本形态结构与显微测量

项目性质：操作性、必修

实验学时：4学时

实验分组人数：1人

实验内容、方法：

[ 目的要求 ]

1、熟悉人体及动物细胞的基本形态结构。

2、了解细胞器在显微镜下的形态特征

3、初步掌握显微测微尺的使用方法。

[ 实验原理 ]

细胞（cell)是生物体的结构和功能的基本单位。构成人体或其他高等动物体的细胞种类繁多、形态各异，而且这些细胞的形态与其功能往往相适应，如具有收缩功能的肌细胞（muscle cell)呈条形或长梭形；运输O₂和CO₂的红细胞（erythrocyte,red blood cell,RBC)为双凹圆盘状，便于在血管中流动；具有感受刺激、传导冲动功能的神经细胞（nerve cell)一般附有长短不一的树枝状突起；

 细胞的体积差别很大，一般来讲，真核细胞的体积要大于原核细胞，高等动物的卵细胞大于体细胞（卵细胞含有较多的营养物质——卵黄)。对于大多数人体及动物的细胞来说，其体积一般在20～30μm之间，必须借助于光学显微镜才有被观察到。由于细胞体积微小，而且含有较大比例的水，故大多是无色透明的，如果不经染色处理，在显微镜下难以看清细胞的结构。因此，要观察某种细胞时，通常先进行染色处理。在普通光镜下，一般可见人体及动物细胞的基本结构分为细胞膜（cell membrane)、细胞质（cytoplasm)和细胞核（nucleus)等外个部分。

细胞中分布有多种具有一定结构与功能的细胞器（organelle)，它们有的体积较大，如线粒体（mitochondrion)和高尔基复合体（Golgi complex)，可通过不同的染色方法将其在光镜下分别显示出来，这些在光镜下常可见的结构通常称为细胞的显微结构。

[ 实验材料 ]

1. 器具：显微镜、载片、盖片、纱布、显微测微尺、镜油、擦镜纸、单面刀片、

2. 材料： 平滑肌细胞分离装片（示教)。兔脊神经节切片——高尔基体。

兔脊髓横切片——神经细胞。蛙肝脏切片、豚鼠小肠切片——线粒体。

马蛔虫子宫切片——中心粒  马铃薯——淀粉粒 蟾蜍（蛙)血涂片

[ 观察 ]

1．平滑肌细胞观察

取平滑肌装片在低倍镜下观察，可见红色长棱形的平滑肌细胞，在细胞中央部位有一兰色椭圆形的细胞核，细胞膜较薄。

2．神经细胞观察­­­

取兔脊髓横切片，先在低倍镜下观察，可见脊髓分为灰质和白质两部分，灰质由许多神经细胞组成，位于中央管的周围，呈蝶状，白质位于灰质的外围，由大量神经纤维构成，换高倍镜观察灰质部分，可见细胞质被染成红色、细胞核为蓝紫色的神经细胞，并有许多长短不一的突起，有的神经细胞没有见到核，这是因为没有切到核的部位。

高尔基体复合体

将兔神经节标本置于低倍镜下观察，可以看到脊神经节内有许多圆形或椭圆形的神经细胞，在细胞中央有一圆形细胞核，核的周围有弯曲的断断续续网状结构呈深棕色。这就是高尔基体复合体，高尔基体复合体的位置一般都在细胞核外围的某一方向，但神经细胞的高尔基体复合体却是围在细胞核的周围，视野中也可能看到一些没有切到细胞核的细胞，其高尔基体复合体分散在整个细胞质中，然后换高倍镜仔细观察。

4．线粒体

（1)取蛙肝脏切片标本在低镜下观察，在细胞内有深兰色的线状物或颗粒状物，这就是线粒体。

（2)人颊粘膜上皮细胞双重超活染色法显示线粒体。

①原理：超活染色法是对从活的生物体分离部分细胞和组织，使它保特着生活状态，用活染色剂进行染色的一种方法。

詹纳斯绿（Janus Creen B)可专一地对线粒体进行超活染色，主要由于线粒体内有细胞色素氧化酶系存在，它能使詹纳斯绿B保持氧化状态（即有色状态)而呈现淡兰绿色，线粒体周围的细胞质中的詹纳斯绿B被还原成无色化合物。当中性红一詹纳斯绿B混合染液进行双重超活染色后，能使线粒体显示得更清楚。

②操作步骤：（a)将载玻片（必须十分清洁)平放在桌上，滴3—4滴中性一詹纳斯绿B染液于载玻片中央。

（b)用消毒牙签刮取口腔颊粘膜细胞（用力应稍重些，以更能得到生活较旺盛的细胞)。然后将刮取物小心地混合于载玻片上的染液中，盖上盖玻片。

（c)2—3分钟后用显微镜观察，在高倍镜下可见颊粘膜细胞质中，散在一些短杆状和圆形颗粒被染成亮绿色，即为线粒体。

（3)豚鼠小肠切片：取豚小肠切片，置低倍镜下观察，可见有许多向肠管内突出的皱襞，称为襞褶。换用高倍镜，看到许多住状细胞，并可明显看到一染色较深卵园形细胞核，在核周围特别是朝向肠腔的一端均有被染成深兰色或是黑色的呈短棒状或颗粒状的线粒体。

5．中心粒—马蛔虫了宫切片

将马蛔虫子宫切片置于低倍镜下观察，可见子宫腔内有许多圆形的受精卵，每个受精卵外均包有一层较厚的膜，这是卵壳与受精膜，这个膜与卵细胞之间的空隙为围卵腔，在子宫腔内寻找马蛔虫受精卵分裂中期的细胞。在细胞中央有被染成深兰色条状或棒状的结构，这就是染色体。在染色体两侧可见各有一较小的被染成深兰色的小粒，称为中心粒。

6．淀粉粒—马铃薯块徒手切片观察

用刀切取马铃薯块茎一小片（越薄越好)，制成临时装片标本后，于低倍镜下选取较薄的部分进行观察。视野中有许多呈多角形的细胞，细胞壁清晰可见，细胞内有一堆堆葡萄状，具层纹结构的颗粒，这就是淀粉分子所集结而成的淀粉粒，在含量多的细胞内淀粉粒几乎占满了整个细胞，将细胞质及其它构造挤向一边，注意观察淀粉粒的形状及其表面花纹。

[ 显微测微尺的使用 ]

显微测微尺分目镜测微尺和镜台测微尺，两尺配合使用，可以测量细胞的大小。目镜测微尺是一个放在目镜内的玻璃圆片。圆片中央刻有一条直线，此线被分为若干格，每格的长度是随不同物镜的放大倍数而异。因此，用前必须测定。镜台测微尺是一张特制的载玻片中央封固的小尺，长度为1mm或2mm，被分为100格或200格，每格长度为0.01mm（10μm)。

显微测量时，先用镜台测微尺标定目镜测微尺每个小格代表的长度，然后才能用目镜测微尺测量细胞的大小，方法如下：

1．将镜台测微尺放在载物台上夹好（注意刻度面朝上)把刻度直线移到通光孔中央，用低倍镜观察，调准焦距，看清镜台测微尺的刻度。

2．取下目镜的上透镜，将目镜测微尺有刻度的一面朝下，放在镜内的光阑上，再旋上目镜上的透镜。

3．从目镜中观察目镜测微尺和镜台测微尺的刻度，转动目镜或移动镜台测微尺，使两尺平行，左边的零点对齐（图3-5-2)，从“0”点开始向右找出两尺重合的直线，记录目镜测微尺的格数所对应的镜台测微尺的长度（格数)，计算出目镜测微尺每格的长度。其公式：

  镜台测微尺格数

目镜测微尺每格代表的长度（μm)=  × 10

  对应的目镜测微尺的格数

如在低倍镜下所标定的目镜测微尺的全长（50格)等于镜台测微尺68格（即0.68mm)，

4．同法用高倍镜测定目尺每格的长度，并记录结果。

目镜测微尺每格代表的长度为 68/50 × 10μm =13.6μm

4.同法用高倍镜测定目镜测微尺每个的长度，并纪录结果。

低倍镜下：目镜测微尺（ )格=物镜测微尺（ )格，目镜测微尺每小格=（ )微米。

高倍镜下：目镜测微尺（ )格=物镜测微尺（ )格，目镜测微尺每小格=（ )微米。

5．测量细胞大小：取下镜台测微尺，换上需要测量的玻片标本，直接用目镜测微尺的刻度测量细胞的长度，测得目镜测微尺的格数乘以每格的微米数，则为细胞的实际长度。

（注意：为减少误差，在测同一标本时，需测试2次以上取其平均值)

请按以上方法测量蟾蜍的红细胞及其细胞核的大小。

6．测量细胞体积：取下台尺放入保护盒内，换上蟾蜍血涂片，用目尺度量蟾蜍血细胞长度与宽度，取各自的一半为长半径和短半径，代入公式求出细胞体积。

7．计算： V=4/3πad²(a为长半径、b为短半径)

如果血细胞是圆球形，其体积V=4/3πR³（R为半径)。为减少误差，同一标本需测5个细胞的数据，取其平均值计算体积。

项目编号：030504

项目名称：细胞分裂的观察

项目性质：综合性，必修

实验学时：4

学生分组人数：1

实验内容、方法：

[ 目的要求 ]

1、了解细胞有丝分裂和减数分裂的过程及其分裂各期的形态待征。

2、初步学习植物根尖压片技术。

3、进一步掌握显微镜的使用方法和绘图方法。

[ 实验原理 ]

有丝分裂（mitosis)是细胞分裂的方式之一，真核细胞通过有丝分裂来实现增殖。有丝分裂的显著特征是形成由纺外锤体、中心体和染色体等结构组成的临时细胞器——有丝分裂器（mitosis apparqatus)，它起到了平均分配染色体到达个子细胞中去的作用。

植物根尖是观察染色体的最好材料，植物根尖细胞分裂指数高，经固定染色，加以适当压片或切片，可以观察到大量处于有丝分裂过程中的染色体，根据形态学特征，可以人为地将有丝分裂过程分为前期、中期]、后期和末期。

减数分裂（meiosis)是生殖细胞特有的分裂方式，它包括两次连续的分裂过程，由于染色体只在第一次减数分裂前复制1次，结果减数分裂最终产生的4个配子的染色体都只有原来母细胞的一半，故称为减数分裂。

减数分裂过程与有丝分裂基本相同，主要区别在于第一次减数分裂的前期，这一时期历时长，染色体变化复杂，是减数分裂过程中量富特性的时期。根据染色体形态特点，可把前期分为5个时期：细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。

[ 实验材料 ]

一．器材：显微镜、镜油（每桌一瓶、)擦镜纸、载片、盖片、吸水纸纱布镊子、剪刀、培养皿等。

二．材料：洋葱根尖纵切标本、马蛔虫子宫切片标本、蝗虫精巢切片，洋葱头或大蒜头（长出2—3厘米长的根)

三．试剂：盐酸酒精液、醋酸洋红染液。

四．试剂的配制：

（1) 盐酸酒精液：

浓盐酸1份+95%酒精1份，等量混合。

（2) 醋酸洋红液：

把100ml、45%醋酸水溶液放入烧瓶中煮沸→移去火焰，缓慢加入1g洋红粉未，煮沸1—2分钟→将一枚生锈铁钉用棉线悬入溶液约1分钟，取出→静置12小时，过滤到棕色瓶中避光备用。

三、植物根尖细胞有丝分裂的压片及观察

取洋葱头（或大蒜头)置盛满清水的烧杯上，使鳞茎盘浸没于水中，置温暖处，待根长2—3厘米长时，于上午11点左右或下午1—3点，在1厘米处剪取根尖。（可在课前先做好)剪下根尖一小段立即投入盛有盐酸精液（浓盐酸和95%酒精各半混合液)的培养皿中，固定离析，经10分钟取出用清水冲洗几次。选择一个经过固定、离析、冲洗过的根尖，置于载玻片上，滴加2滴醋酸洋红染液，染色10—15分钟，之后盖盖玻片，在盖片上加一块吸水纸，这时用手指对准盖玻片下的材料轻轻地压下去，把根尖压平，使细胞分散制成压片。把制备好的压片放在显微镜下选择有丝分裂各个时期的细胞，进行仔细观察。

四、动物细胞减数分裂——蝗虫精巢切片

取蝗虫巢切片，先用低倍镜找到有分裂相的细胞，然后转到高倍镜下面确认所居时期及染色体行为，在一些切片中可以看到一个个细胞的减数分裂的不同时期。包括精母细胞到成熟的精子。雄蝗虫染色体是2n=23其中一个是性染色体，选择蝗虫精细管的减数分裂区，着观察细胞的减数分裂。

第一次减数分裂

前期→：染色质螺旋化形成的细线状染色体有的可见两条同源染色体，在不同部位开始配对，配对后原来的23条染色体形成二组+X染色体，每条染色体纵裂为二，分裂成相同的两条染色单体，此时称为四分体，四条染色单体排列非常紧密，不易区分出四条结构，但四分体一般很粗，染色深，这时染色体形成“+”字形成或“〇”字排，核膜消失，开始出现纺锤丝。

中期Ⅰ：细胞胞中染色体（色较深的一条是性染色体)排列在赤道面上，纺锤丝出现。]

后期Ⅰ：两条同源染色体分开，分别向两极移动，每条染色体的两条染色单体依然由于着丝粒连接在一起，而不能分开形成二分体。

未期Ⅰ：染色体移向两极，又相互聚集在一起，逐渐形成新核，细胞短轴的两端向内凹入，出现新的细胞膜，在两个细胞中染色体数目减半。

第二次减数分裂间期很短，染色体不复制，由次级精母细胞形成精细胞，其分裂情况与有丝分裂相同，注意在视野中找到中期能否观察到二分体，未期Ⅱ能否观察到单分体。

蝗虫的初级精母细胞，经过减数分裂形成四个精细胞，每个精细胞内染色为n=11或n=11+×。

[ 内容与方法 ]

一、植物细胞有丝分裂的观察

取洋葱根尖切片标本于低倍镜下观察，找到根尖生长区，该区细胞较小，近似正方形，染色深，排列紧密。选择细胞分裂较多的部位转换高倍镜观察，寻找各个分裂时相的细胞。

1．前期（prophase)：早前期核膨大，染色质呈细纤丝盘曲成网状，充满整个细胞核，随着分裂的进行，染色质丝缩短变粗，到前期，到前期，染色质凝集成染色体，核仁核膜消失，染色体分散于细胞质中。

2．中期（metaphase)：中期染色体最粗，数目也最清楚（2n=16)，是研究染色体的有利时期。每条染色体由2条染色单体的单位是着丝粒，全部染色体的着丝粒排细胞中央同一平面上，此平面叫赤道面（板)，这是中期的主要待征。

3．后期（anaphase)：每条染色体在着丝粒处纵裂，使两条染色单体分开，在纺锤丝的牵引下，两组数目相等的染色单体分别向细胞的两极移动。

4．未期（telophase):两组染色单体到达两极不再移动就是末期的开始，随后染色体去凝集，逐渐变为细长的丝状，再恢复为染色持的状态。核仁核膜重新出现，形成两个细胞核，在两新核之间产生细胞板，分隔细胞质成为两个子细胞（图3-5-3)。

二、动物细胞有丝分裂的观察

取马蛔子宫切片标本在低倍镜下观察，可见子宫周边为子宫壁，壁内为子宫腔，腔内有许多处天不同发育阶段的圆形卵细胞。每个细胞的周围都有一层厚而染色极淡的受精膜（亦称卵壳)，受精卵细胞在卵壳内分裂。选择处于有丝分裂的受精卵细胞，转换高倍镜下仔细观察各个时期的图像（图8—2)。马蛔虫受精卵的有丝分裂基本上与植物细胞相似，但注意中心体的变化、星射线的出现和子细胞形成时横缢的产生。

a. 第一极体；b.第二极体；c.雌原核； d. 雄原核；e.中心体； f.染色体； g.中心球； h.中心粒； i.星射线 j.纺锤丝

1．前期：核膨大，染色质丝浓缩变粗形成染色体，中心粒分开向两极移动，中心粒之间开始形成纺锤丝，每个中心粒周围有辐射状的星射线，核结构消失。

2．中期：核膜完全消失，两面三刀中心粒已位于细胞的两极，染色体排列在纺锤体的赤道面止，在纵切面上排列成赤道板，构成中期的典型特征，到中期末，每条染色体已纵裂为二，但未分开，着丝粒尚未分裂。

3．后期：着丝粒纵裂，分成2组数目相等的子染色体，子染色体在纺锤丝牵引下向两极移动，2组成色体之间仍有纺锤丝；晚后期，细胞中部出现横缢，是射线仍可见。

4．末期：染色体解旋变成染色质，核膜重建核仁出现，纺锤体与星射线消失，细胞膜的

项目编号：030505

项目内容：小鼠骨髓细胞染色体的制备与观察

项目性质：综合性  必修

学时数：4学时医.学全在线www.lindalemus.com

学生分组人数：2—4人

[ 目的要求 ]

1．学习脊椎动物骨髓细胞染色体制备方法。

2．观察了解小白鼠染色体的基本形态特征及数目。

[ 实验原理 ]

染色体是遗传物质载体，在间期细胞核中看不到染色体，只有在细胞分裂时才能看到，当细胞分裂处于中期时，染色体的形态结构最典型、最清晰，便于镜下观察。骨髓细胞是具有旺盛分裂能力的细胞。不需体外培养，有丝分裂指数较高，但要想获得典型的分裂中期染色体，必须要对骨髓细胞进行处理和特殊的技术制备。在取材前4h经小鼠腹腔注射秋水仙素或在取材时制备骨髓细胞悬液内加入秋水仙素，这种药物可以破坏细胞分裂过程中纺锤丝的形成，使细胞分裂停止于中期，以便观察到最典型的中期染色体形态。在制备过程中要进行低渗处理，其目的在于使细胞膨胀，待滴片时导致细胞膜破裂，促使中期染色体适当分散；固定使细胞保持生活时的结构状态，保证染色体完好的形态；离心使细胞沉淀于离心管底部，以便去掉上清液保留细胞；滴片时使用预冷的栽玻片，以便使细胞黏附于玻片上；染色使染色体易分辨、观察。该法可用于分析动物细胞的核型，还可用于观察毒性物质在体内对细胞染色体的影响。

[ 实验材料 ]

1．器材：普通光学显微镜、 低速离心机、恒温箱、水浴锅、8ml刻度离心管、试管架、吸管、注射器、解剖剪刀、镊子、大培养皿或解剖盘、载玻片（冰水中预冷)、盖玻片。

2．实验动物：体重为20g左右的小白鼠。

3．试剂：0.04%秋水仙素、0.075mo1/L KCI低渗液、2%柠檬酸钠溶液、3：1甲醇、冰醋酸固定液、吉姆萨（Giemsa)染液（10：1)、0.85%生理盐水。

4．试剂配制

（1)0.04%秋水仙素：秋水仙素4mg。灭菌生理盐水10ml溶解，避光保存。

 (2)0.075mo1/L KCI 溶液：KCI5.6g加蒸馏水至1000ml。

（3)2%柠檬酸钠溶液：柠檬酸钠2 g，加生理盐水至100ml。

（4)3：1固定液：甲醇3份，冰醋酸1份。

（5)吉姆萨（Giemsa)染液：原液：吉姆萨染粉0.5 g，甘油33ml，甲醇33ml，配制时先将Giemsa粉置于研钵中，加入少量甘油研磨至无颗粒，再加入余下的甘油，拌入后放入56℃温箱中保温2小时，然后取出加入甲醇，充分拌匀，滤纸过滤后用棕色并瓶密封，避光保存，一般要放置2周后才能使用。

使用液：原液1份，PH6.8磷酸缓冲液9份稀释。使用液不宜长期保存，一般现配现用。

PH6.8磷酸冲液：该液可先配成A液和B液，然后混合使用。

A液：KH₂PO₄  9.078g，溶于1000ml蒸馏水中。

B液：NaHPO₄  2H₂O  11.867g，溶于1000 ml蒸馏水中。

配制各种HP值的磷酸冲液时参照下表。

各种PH值的磷酸缓冲液的配制

(6) 0.85%生理盐水：Na CI 0.85g蒸馏水至100ml 。

[ 实验内容与方法 ]

1.取材：制备骨髓细胞悬液，用颈椎脱臼法处死小白鼠，立即剥离大腿上的皮肤和肌肉，暴露股骨及其两端关节，从两关节处剪下股骨，去除股骨周围残余肌肉，剪去两端，暴露骨髓腔，用镊子夹住股骨中部，使股骨垂直且下端对准离心管口，用注射器吸生理盐水或2%柠檬钠溶液，将针头插入骨髓腔，冲洗骨髓数次，将骨髓细胞冲至离心管内，直至股骨变白为止。一只鼠的两个股骨的细胞冲到同一刻度离心管内。此时离心中的细胞悬液达到5ml。用吸管吸打混匀后放入离心机，以1000转/分钟离心5分钟。

2.秋水仙素处理：

(1)方法一，取材前3—4h，按2 ug/g体重的剂量向小白鼠腹腔内注射0.04%秋水仙素。(2)方法二，在取材过程中，用生理盐水冲洗骨髓细胞，使刻度离心管中的细胞悬液达到4ml，吸打混匀后，再加lml0.04%秋水仙素，吸打混匀放到37℃温箱或水浴锅中温浴30钟。温浴后取出离心管放入离心机，以1000转/分钟离心5分钟。

3.低渗处理：弃上清液，加37℃预温的0.07mo1/L KCI溶液5ml用吸管吸打混匀后，至37℃温箱或水浴锅内15—20分钟。

4.固定：1000转/分钟离心5分钟，弃上清液，加5ml固定液（甲醇：冰醋酸=3：1)。吸打混匀，固定10分钟。

5.制悬液：1000转/分钟离心5分钟，弃上清液，加固定液（0.3—0.5ml)，轻轻吸打制成细胞悬液。

6．滴片：取冰水预冷的载玻片，甩掉冰水后，平放于实验台上或手持玻片，用吸管吸取细胞悬液，距玻片30—50cm，迅速滴2滴细胞悬液于预冷的载玻片上，立即对准玻片吹一口气，使细胞散开，自然干燥或于酒精灯上烤干。

7．  染色：用吸管吸取Giemsa染液于干燥的载玻片上，染色5—10分钟，用自来水轻轻冲掉载玻片上的染液，干燥后镜检。

8．  观察：将制备好的玻片标本放在显微镜下，把染色的一面向上、先在低倍镜下观察，可见视野中有许多细胞核和染色体染色成兰紫色或浅红色，细胞核呈圆形，结构致密，染色体未形成，为间期细胞核。核膜已破裂，染色体散开，此为分裂中期细胞。选择分散适度，染色体不重叠的分裂相，在高倍镜下进行观察，小鼠染色体呈“U”型，全部为端着丝粒染色体，2n=40条。按形态特征，可将40条染色体配成20对，分为4组，其中1对性染色体XY，或XX，染色体Y最小，

X的大小介于5号和6号染色体之间（如图3-5-11)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

[ 注意事项 ]

1．腹腔注射秋水仙素溶液时，注意不要使用针头损伤动物内脏。

2．剪开股骨头端露骨髓腔时不要剪掉太多，确保收集到一定数量的骨髓细胞。

3．离心前先配平，两管对称放入离心机。离心速度应逐步增加到1000转/分钟；   离心后取出离心管的动作要轻，弃上清时勿摇动。

4．滴片时要有一定的高度。

[ 思考题 ]

1．简述小鼠骨髓细胞染色体的制备过程？

2．取材前4小时为什么要给小鼠腹腔注射秋水仙素？

3．制片过程中加入何种低渗液和固定液？其目的各是什么？

 

项目编号：030506

项目名称：人染色体G带制片及其核型分析

项目性质：综合性   必修

学时数：4学时

学生分组人数：1人

[目的要求]

1．了解染色体G带标本的制作方法。

2．初步掌握正常人染色体G带的形态特征。

 

[ 实验原理 ]

染色体显带是70年代发展起来的技术，其中使用最广泛的是G带，有许多显示G带的方法，最常用的是将已固定的染色体制片进行预处理，然后进行Giensa染色。预处理的方法非常多，如用热碱、各种蛋白酶、尿素、去垢剂或其他溶液等。其中常用的是用胰蛋白酶进行预处理，方法简便，周期短。G显带技术可使染色体显现深浅交替的横纹，由于染色体的化学组成成分有差异，故每条染色体出现不同的带纹特征，根据这些带纹特征，可对染色体进行较为精确的辨别，是目前进行染色体显带标本分析的常规方法。广泛应用于人类细胞遗传学研究和临床诊断中。

 

[ 实验材料 ]

1．器材：普通光学显微镜，恒温箱，烤箱，水浴锅，染色缸，染色架，剪刀，浆糊，香柏油，二甲苯。

2．材料：常规未染色的人染色体玻片、正常人染色体G带核型照片。

3．试剂：0.02%（或0.125%)胰酶、5%NaHCO₃ 3%tris溶液、1/15mo1/L磷酸缓冲液、Giemsa染液、0.02%EDTA。

[ 内容与方法 ]

一．G显带标本的制作

（一)0.02%胰酶法

1．将外周血培养并按常规制作的标本置于37℃温箱中烘烤3天，或70℃烤箱中烘烤3小时。

2．用0.85%的生理盐水配制成0.02%的胰酶溶液，倒入染色缸中，置37℃水浴中，滴入0.4%的酚红2滴，再以35的Tris（三羟甲基氨基甲烷)调pH为6.4～6.6（4号针头1滴)，此时溶液为橙色。

3．将经过烘烤的玻片取出，浸入0.02%胰酶溶液中，轻轻摆动，处理2分30秒左右（必要时此时间可自己摸索)。

4．取出玻片，自来水冲洗。

5．将玻片标本放，直接滴上用pH7.2的磷酸缓冲液配制的Giemsa染液（缓冲液与Giemsa原液的比例为9：1)染色7～10分钟。或将玻片放入染色缸中浸染7～10分钟。

6．自来水或蒸馏水冲洗，空气干燥或用电吹风吹干，镜检。

（二)0.125%胰酶法

1．烤片（方法同上1)。

2．用0.85%的生理盐水配制的0.125%的胰酶溶液，倒入染色缸中，用5%的NaHCO₃调节pH为7，置入37℃水温中，使胰酶液温度升至37℃。

3．取烘烤三天的玻片，浸入0.125%的胰酶溶液中，稍加摆动8～15秒。

4．取出玻片，自来水冲洗。

5．以Giemsa梁液（1：9工作液)染色5～7分钟后水洗，空气干燥、镜检。

（三)EDTA胰酶法

1．烤片（方法同上)。

2．取25ml生理盐水和25ml0.02%EDTA（乙二胺四乙酸二钠)溶液倒入立式染色缸中混匀。

3．取2.5%的胰酶溶液1ml加入上液中，以5%NaHCO₃调pH至7左右，置水溶箱预温存37℃。

4．将染色体玻片浸入胰蛋白酶、EDTA溶液中处理5—20秒。

5．取出标本立即用生理盐水洗2次。

6．以1：9Giemsa染色5—10分钟，细水冲净染液后镜检。

为使染色体带显示清楚，利于观察，必须选用有足够多的分裂相，染色体长度中的常规标本片制片，制片时，烘干时间要足够，而且片龄不能太长，往往一周内效好。另外，显带的成败与胰酶处理的浓度和时间很有关系。在消化处理时，最好将一张玻片分几段浸入，摸索2—3个时间，找出在本胰酶浓度条件下最适时间。如消化过度，染色呈空泡状，不足则带纹显示不出。

[G显带染色体标本观察 ]

先在低倍镜下选择长度适中、带纹清晰的G带中期分裂相，然后转至高倍和油镜下观察。

G显带染色体上出现明暗交潜的横纹（带纹)，不同的染色体，带纹有别，根据带纹，可对染色体进行比较正确的鉴别，尤其是未显带不易区别的染色体如C组的染色体，可通过带纹区分，对于因病理因出现的染色体结构变异常规组型难以识别，通过带纹即可以判断。

[G显带染色体核型分析 ]

核型分析是指用显微镜摄影方法得到的单个细胞中所有的染色体按照丹佛命名体制将同源染色体配对并分组编号排列所构成的图象。核型分析是诊断染色体病的重要手段。

1．将照片全部染色全逐个剪下，注意要剪得整齐，可沿染色体的黑白边界剪彩下，也可留1—2毫米的白色边缘。

2．将同源染色体配对，按照各号染色体的G带待征分组列，将所有常染色体分为A—G7组，编号为1—22，性染色体（X和Y)可分别排列。

3．用浆糊将已排列好的染色体按组编号贴在实验报纸上，注意着丝点或长臂末端应排在同一水平线上，短臂向上，最后写上报告结果：

46，XX正常女性核型；

46，XY正常男性核型；

4．人体染色G带特征：

1号：p近着丝粒一半处有2条深带，远侧端有3—4条浅染的深带，几乎浅染区。q次缢痕紧贴着丝粒，染色深，近侧端和远侧端各有两条深带，中央一条最宽着色最深。

2号：p有4条深带，中段2条常靠近。Q有4—7条带，着丝粒染色较浅。

3号着丝粒和臂内区段染色相当深，中部色浅，两臂远侧端染色更深，近似对称，形似“蝴蝶”。P近侧端有2条深带，远侧端3条深带，而中间的一条着色更深，近侧端的一条带较窄，着色较浅。Q与p相同，只是远端的深带比p的宽些。

4号：比5与染色体着色体着均匀，色更深。P中央有一深带，Q有4—5条中等着色带，近着丝粒处一条特别深。

5号：p中央有一深带。Q近侧端一条深带，中央3条深带，往往融合在一起，远侧端1—2条深带，其中末端染色更浓。

6号：p近侧端和远侧端各有一深带，中部为一色浅的宽带，近似“空白”。Q有4条分布均匀的中等着色带。

7号：p两条带，近侧端的条着色浅，远端的一条着色很深而且宽，尤如“瓶盖”。Q 有3条均匀的深带，近侧端和中部的着色深，远侧端的较浅。

8号：p有两条均匀的深带，中间被一浅带隔开。Q3—4条逼带，近侧端的色较较浅，而远侧端的染色较深。

9号：p中央有一较宽的深带，q有两条明显均匀的深带，远侧端浅染，次缢痕通常不着色。

10号：p可见两条深带，不甚明显。Q有3条分布均匀的带，越是近侧端的带染色越深。

11号：p可见两条深带，有进融为一条。Q近侧端的深带与着丝粒之间为一宽浅带，中部两条深带，常融合起，远侧端有一着色浅带。

12号：p中部有一深带。Q3条深带，中间一条最宽，其3条深带形成的深染区比第11号的要宽，且稍偏近侧端。

13号：p随体着分深。P有4条深带，第1和第4带较窄，第2和第3带较较宽。

14号：p随体着色不定。P4条深带，近侧端第2带和远侧端的第4带特别明显，中段一条色较浅。

15号：p随体着色学定。Q近侧端1/2处有一着色深的宽带，在近末端处有一中等着色的窄带。

16号：p着色浅，有1—2条浅染带。Q着丝粒和次缢痕着色深，长度变异大，在2条深带。

17号：p 着色较浅，中部有一窄深带。q远端部可见一较宽的深带，它与弟丝粒区之间为一宽而明显的浅带。

18号：p近末端处有一窄深带。Q 近侧端和远侧端各有一条明显的深带，近侧端的一条宽且深染。

19号：在核型中着色最浅，常在着丝粒处深染。

20号：p有一显著深带。Q 全部为浅染，有时可见1—3条带。

21号：p随体不定着色，着丝粒染色浓。Q近着丝粒处有一深的宽带。

22号：随体不定着色。Q中央有一着色较深的窄带。

Y染色体p一般为浅染。Q远端部1/2处是核型中着色最深的区段，其长度变化不一，有时整个长臂均被成深色。

 

[ 注意事项 ]

1．G带制片要求染色体标本新鲜，一般以三天内为宜，如片龄增长，则胰酶处理时间延长。

2．胰酶溶液现配先用。

3．胰酶在使用过程中，随着使用次数增多，而活力有所降低，因而较后处理的片子其时间要略有延长。

4．片子在胰酶中作用时间与温度成反比，温度高则处理时间短；同时与胰酶浓度成反比，即胰酶浓度高处理时间短。

5．配制胰酶溶液时，除了用生理盐水外，还可用无Ca⁺⁺、Mg⁺⁺、Hank液和ICN液，在用ICN液配制时因内含有磷酸缓冲液成分，故不必要调PH值。

[ 思考题 ]

1.简述人染色体G带制片过程。

2．简述人染色体G带的主要形态、特征，进行G带核型分析，并报告结果。

 

项目编号：030507

项目内容：X染色质标本制备及正常人染色体观察

项目性质：综合性

实验学时：2学时

学生分组人数：1人

实验内容、方法：

[ 目的要求 ]

1．了解正常人体细胞染色体数目和形态。

2．初步掌握人高级职称考试网类染色体核型常规分析方法。

3．初步掌握口腔粘膜上皮细胞X染色质的制备方法，了解X染色质的形态特征。

[ 实验原理 ]

人类的性染色体即X染色体和Y染色体在间期细胞中为性染色质。根据Lyon假说，人类间期的X染色质通常只有一条有转录活性，当多于一条时，多余的X染色质将形成异固缩染色质块（X小体)存在于细胞核边缘，经过特殊染色，可在显微镜下看到这一结构，如女性细胞有两条X染色体，因此，间期细胞可见到一个X小体，而男性细胞仅一条X染色体，故间期细胞见不到这一结构。在性染色体异常的病人，如X染色体有3个者，则可见到2个X小体。另外，用荧光染色法，在男性细胞可见到一个较强的荧光体，称为Y小体，一般认为是由Y染色体长臂的部分结构构成。女性细胞元Y染色体，故见不到这一结构。据此，通过口腔上皮细胞、羊水细胞等间期细胞的性染色质检查，可判断个体的核性别，同时在临床上也可作为性别异常疾病的一种辅助诊断。

[ 实验材料 ]

显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、滴管、牙签、载玻片、龙胆紫染色色液、盖片、吸水吸。

正常人体细胞染色体玻片标本照片。

 

 

[ 实验内容 ]

（一)X染色质标本制作和观察

1．标本制作方法

口腔粘膜上皮细胞X染色质标本制作。

（1)涂片：喇口后用洁净的消毒牙签从颊部内侧轻轻刮取少许口腔粘膜上皮细胞，均匀涂布于载玻片上。

（2)固定：在涂片未干燥时95%酒精固定15分钟。

（3)染色

①龙胆紫色法：固定后的涂片用蒸馏水冲洗，稍干加一滴龙紫液染色1—2分钟后，用水冲洗，干后即可油镜观察。

②硫瑾染色法：a、涂片干燥后，用蒸馏水洗数次。B、放入5N HCL（22℃)10分钟。C、自来水洗数次。D、蒸馏水冲洗。E、硫瑾染色30分钟。

③2%地衣红（orcein)染色法

用一滴地衣红滴于口腔皮涂片上，国盖片室温下静置20—30分钟，然后用过滤纸复盖，以手轻轻加压，并吸去周围液准备镜检。

细胞质无色，细胞核略显红色，X染色质呈暗戏色。

附：染液配制方法

1．地衣红液配制法

用45%醋酸配制，临用时等份的70%的乳酸稀释后备用（称此液为乳酸醋酸地衣红固定染色液)。

2．硫瑾原液配制法

配方：硫瑾4克、50%酒精 100毫升

配制成100亳升瑾液，在与缓冲液混全前过滤。

3．缓冲液配制： 

配方： 醋酸钠 1.94克、巴比妥钠2.94克  

加蒸镏水到100毫升（冰箱保存可用数月)。

4．硫瑾工作液配制法：

按下述次序逐个混合。 

（1)饱和硫瑾 100毫升、  

（2)1/10N HCL 70毫升

（3)缓冲液  60毫升

调PH为5.7（此液冰箱保存可用数用)。

 5.龙胆紫液配制未法：

配方：冰醋酸 30毫升、龙胆紫0.75克、蒸馏水70毫升

先加温使龙胆紫溶于冰醋酸，后加蒸馏水。

观察

油镜观察，计数50个可数细胞，报告X染色质出现率，细胞经染色后，胞质着色浅，胞核着色深，轮廓清楚，选择胞核完整，染色均匀的细胞核进行观察，X染色质很小，约1微米直径，常见于核膜内侧缘。呈半圆状突向核中央的浓染小体，或呈三角形，其一角朝向核中央。

正常值：女性10%以上。

（二)正常人体染色体玻片一张（该标本是人体外周血细胞通过培养制成的)。先在低倍镜下观察，在标本中寻找一个染色体分散较好，平铺在一个平面上互不重迭的分裂中期的细胞，然后换高倍镜（或油镜)仔细观察。标本中的每条染色体都含有两条染色单体，两单体边续处为着丝点，注意每条染色体的大小和着丝点的位置各不相同并计数是否有46条染色体。计数时，要按染色体分散自然区域进行，以免重复和遗漏。（由于制片时或个别细胞分裂受某些因素的影响，染色体数目可多于或少于46条，但46染色体出现的频率最多)。按上述方法再选择1—2个细胞时进行染色体计数，比较的结果是否相同。

（三)正常人体染色体核型分析

核型分析是指用显微镜摄影方法得到的单个细胞中所有的染色体按照丹佛命名体制将同源染色体配对并分组编号排列所构成的图像。核型分析是诊断染色体病的重要手段。

1．分析方法：

（1)照片中全部染色体逐个剪下，注意要剪得整齐，可沿染色体的黑白边界剪下，也可留1—2毫米的白色边缘。

（2)将同源染色体配对，按照染色体的长度（长者为前，短者为后)并参考着丝点位置及单个染色体的识别。（下表所列各组染色体的主要形态特征)所有常染色体分为A—G7组，编号1—22，性染色体（X和Y)可分别排列。

（3)和浆糊将已排列好的染色体按组编号贴在实验报告纸上，注意着丝点应排在同一水平线上，短臂向上，最后写上报告结果。

46××正常女性核型

46×Y正常男性核型

2．单个染色体的识别：

（1)A组（1—3)染色体

晕组染色体1、2、3是人体染色体中最大的一组，这组中的各对染色体彼此之间以区分，其标志如下：

A₁是最大的染色体，着丝点基本上为中央型，长短臂差别不大。

A₂较1号小，为亚中央着丝点，长臂和短容易区别。

A₃着丝点为中央型，是A组中最小的染色体。

（2)B组（4—5)染色体

这一组一共只有两对染色体，编号为4和5，长度仅次于A组，本组两对染色体全部为亚中央型，长臂短区分明显，但B₄和B₅彼此之间很难区分，B₄整个染色体的长度较B₅略长。

（3)C组（6—12)染色体

这一组共有七对常染色体（6、7、8、9、10、11、12)还有人把X染色体也归这一组，本组染色体大小颇为一致，呈中等大小，其着丝点位置都是亚中央型，因此从形态上看，区别本组内个别染色体是比较困难的。一般地说，6、7、8号染色和11号染色体短臂较长（着丝点的位置更接近于中部)而9、10号和12号染色体短臂较短（着丝点的位置更接近于端部)。第12号是C组最小的一对，但不易与组内其它4个对较短的染色体相区别。

X染色体，因为它的长度也属于中等大小，故变归在这组内予以描述。从大小看来，它的长度与C₀和C₇相仿佛。但其染色常比C₀和C₇为深（实际上，X染色体的染色，比其它任何染色都深些)，且其边缘不平整。似乎有些象细毛状的形态，其着丝点略偏向于亚中央型。

（4)D组（13—15)染色体

这一组染色体共有三对，编号为13、14、15，长度中等，着丝点近端型，它们比另一组（G组)的近端型染色体长度较大，因此又有大近端（targacrocenfril)之称，全部都是在短臂的顶端具有随体，所以比较容易和其它染色体组相区别。

D₁₅是本组三对染色体中较短的一对，其短臂也是本组最明显的，所以较容易辨别。

（5)E组（16—18)染色体

本组共有三对染色体，编号为16、17、18，这三对长度均较短，其特征差异明显，所以比较容易识别。

E₁₆本组中最大的染色体，具有中央着丝点。

E₁₇着丝点为亚中央型，其短臂较E_16­略长（但不是绝对的)。

E₁₈是组中最小的染色体，着丝点为亚中央型，其短臂较E₁₇为短。

（6)F组（19—20)染色体

本组共有两对染色体，编号为19和20，是最小的一组，着丝点为中央型，不易把两者区别。

（7)G组（21—22和Y)染色体

本组共有两对常染色体，编号21号22，也有人把Y染色体归这一组。本组染色体的着丝点均为近端型，它们比另一组（D组)的近端染色体的长度为小，所以这两对被称为“小近端”（Smallacrocenfric)知臂上有极小的随体，但是G₂₁其长臂较G₂₂略长。

Y染色体一般比较容易与21—22相区别。首先，它不具有随体，其次，它经常出现在中期染色体相的边缘部分，还有，一般地说，Y染色体的长臂比较长，所以整个染色体温的长度显得比21和22大些，不过这点不能作为可靠的标志，因为其长臂胀度常常出现形态上的变异，还有Y染色体几乎不出现典型的中期那种X形的交叉图形，因为其长臂胆平行的，而且靠得得近，这是很好的辨认标志，还有Y染色体长臂末端呈细毛状，端缘比较模糊，界限不清，而21和22则极为分明，相反，Y染色体的着丝点区和短臂较21和22明显。

3．根据上述染色体鉴别特征，将染色体照片剪贴、配对、排出核型。

人类染色体组型分组及形态特征

组 分	染色体号	形态 大小	着丝粒位置	随体	次缢痕	鉴别程度
A	1—3	最小	1、3为中央着丝粒，2为亚中着丝粒	无	1常见	可鉴定
B	4—5	次大	亚中着丝粒	无		不易区分
C	6—12，X	中等	亚中着丝粒	无	9常见	不易区分
D	13—15	中等	近端丝粒	有	13偶见	不易区分
E	16—18	小	16为中央着丝粒，17、18为亚中着丝粒	无
F	19—20	次小	中央着丝粒	无		不易区分
G	21—22，Y	最小	近端着丝粒	无		不易区分

注：X染色体与C组相比，大小介于6—7之间，着色较其它染色体深，在女性其中一条常呈现一种特殊的“细毛状”外形，Y染色体与G组相似，但无随体，常比21、22对略大，两臂紧贴，几乎是相平行的，它的长臂的端部模糊不清，呈“细毛状”。

项目编号：030508

项目内容：人类正常遗传性状的调查与系谱分析、讨论

项目性质：综合性，必修

实验学时：4学时

学生分组人数：1人

实验内容、方法：

 [ 人类正常性状 ]

通过对人类某些遗传性状的调查，学习绘制系谱图、分析性的遗传方法。

[ 实验内容 ]

1、卷舌（IoHgHe roIIiog)

在人群中，有的人能够卷舌，在近舌尖处一两侧边缘向上甚至卷成管状，有的人则不能，同学间可相互观察，或对镜观察是否具些能力，并记录下来。从人数分布中能否估计卷舌为显性遗传或隐性遗传？同学们可对自己的家庭进行调查、记录结果，卷舌者记“+”非卷舌者记“-”绘成系谱图，通过第谱分析其遗传方式，以“T”代表显性基因以“t”代表隐性基因，写出直系亲属可能的基因型。

班人数	卷舌者人数	非卷知者人数	卷舌%	非卷舌%

2．耳垂（EarIobe)形状

人类耳垂可明显区分为有耳垂和无耳垂两面三刀种形状，前都为显性遗传，后者为隐性遗传。试观察你家成员的耳垂形状，是否与上述遗传方式想符？在你看到的人群中耳垂分布情况，能否有助于说明该遗传问题？

3．前额发际形状

在人群中，有些人前额发际基本上属于平线，有些人在前额正中发际向下延伸呈峰形，这种性状属于哪种遗传方式？

4．PTC尝味敏感性

PTC是一种无毒的化药物苯硫脲（phenglthiocarbamide)的缩写，个体间对不同浓度的PTC溶液尝味敏感性不同，有人尝苦味，有人尝无味，这是一种正常的遗传性，可按下列方法配制溶液尝味。

PTC饱和液（0.13%)为源液，0号液：稀释一倍为1号液再稀释一倍为2号液，2号液再稀释一倍为3号液；以此类推，配成各号溶液，以1/48000（6号液)为尝味界限，能尝出1/48000及更稀溶液苦味者为阳性划“+”号无味者阴性记“-”号，除自己进行PTC尝味测验外，可利用无菌吸水纸吸取PTC溶液，带回家中调查，绘出系谱图，并说明遗传方式。

[ 实验报告 ]

按实验内容1、2、3、4、各项要求绘制系谱图遗传方式。

四．讨论

目的

1．通过讨论、巩固、扩大和加深所学遗传学的基本理论和基础知识。

2．培养和训练科学思维方法，以提高分析、综合及解决问题的能力。

讨  论

通过教师精讲典型例题，介绍解题方法和掌握解题一般规律的基础上，将他们预习中所存在的问题提出来，先经过分组议论之后，再进行全班讨论。最后，由教师引导学生进行小结。

几种遗传病的系谱分析

应用遗规律，对下列各系谱进行分析讨论，根据各系谱的特点判断其传递方式，并写出患者及其父母可能出现的基因型，再回答有关问题。

1． 视网膜母细胞瘤：在视网膜母细胞瘤的系谱中（图1)为什么Ⅱ₄的家系中没有患者？如果Ⅲ₆与正常人结婚，其后代是否会出现患都？Ⅱ₂和Ⅱ₃表型都正常，但他们的后代中却出现了患者，这是为什么？

 

Ⅰ　　

   1   2

Ⅱ

   1  2 3   4 5 6  7

 

Ⅲ

   1   2 3  4  5   6   7  8   9  10  11   12

    图 1  视网膜母细胞的系谱

2．遗传性肾炎：在遗传肾炎的系谱中（图2)，Ⅲ₅为为什么没有患病？Ⅲ₆如果与正常人结婚，其后代患同样疾病的可能性如何？IV₁若与一正常女性结婚，他们所生的孩子患同样疾病的可能性有多大？

Ⅰ　　

   1  2

 

Ⅱ

1  2 3  4 5  6

 

Ⅲ

   1 2  3   4   5   6  78  9

 

Ⅳ  1 2   图 2   遗传性肾炎得系谱

 3．糖元累积病Ⅰ型（肝型)：在糖元累积病Ⅰ型（肝型)的系谱中（图3)，为什么在第

三代突然出现患者？Ⅲ₁的致病基因来自亲还是父亲？如果Ⅲ₁与一位患同样疾病的男性结婚，其后代患病的可能性有多大？

　

  

Ⅰ

1  2345

　 Ⅱ

1   2 34  5   6

　 Ⅲ

　　　1 2 34

 

  

图3   糖元累计病I型 (肝型) 的系谱

4．血友病A：在血友病A的系谱中（图4)为什么男性患者众多？Ⅱ₂的致病基因来自谁？为什么？如果Ⅲ₂与正常人结婚后，所生的孩子患此病的可能性有多大？

 

  

Ⅰ

  1   2   3  45   6

 

Ⅱ

  1  2   3  4      5  6

 

Ⅲ

 12 34 5   6

图4  血友病A和系谱

5．某家庭ABO血型和红绿色盲的调查结果如下面的系谱图（图5)

 

  A  O A O  AB   O

12 34 56

 

     AB A      B        B      A    A

  1 2 3   4 5  6   78   9 10  11

 

  AB  O  A   B  AB B  O A

   1   2  3  4 5 6  7 8  9 10  11

图 5  ABO 血型及红绿色盲遗传病的系谱

注：  ╔╗

╚╝ 男性色盲目患者   〇  里的英文字母表示血型

（1)Ⅲ₇的色盲基因，是从世代Ⅰ中的哪个个体传递来的？

（2)如果当Ⅲ₂和Ⅲ₇结婚，他们所生男孩患色盲的可能性究竟有多大（设色盲基因频率为0.07)？

（3)如果Ⅲ₇和Ⅲ₁₀结婚，他们所生女孩成为色盲基因携带者占多大比例？

（4)如果对这个家系的世代Ⅰ、Ⅱ的成员其血型判断是正确的，那么，在世代Ⅲ中便有一个个体的血型记录是错误的，他该是哪一个？

（5)如果对（图5)中的那个小孩的母亲的血型判断是正确的，试根据小孩的同胞正确血型推断出他父亲的血型。

（6)从这个系谱你能判断出色盲的传递方式吗？其根据是什么？

6、设某病为常染色体隐性遗传病，发病率为1/10000（图 6)

Ⅰ

   1 2

 

 

Ⅱ

1   2   3 4 5 6  7     8

 

Ⅲ 1 2 3   4

 

Ⅳ   1

  图 6 

求：

（1)Ⅲ₁与Ⅲ₂婚配，其后代发病风险。

（2)Ⅲ₁随机婚配，其后代发病风险。

（3)Ⅲ₄随机婚配，其后代发病风险。

（4)IV₁随机婚配，其后代发病风险。

（5)若系谱中未出现患者，表兄妹婚配后代的发病风险。

7．某病遗传度为75%，群体发病率为0.14%，求一级亲属发病率。