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通过多孔β-TCP和人骨髓间充质干细胞构建人工骨研究示例论文
1.引言
创伤、肿瘤等原因引起的大块骨缺损是骨科临床的难题，目前尚缺乏理想的治疗方法。近年来，组织工程骨的研究进展为大块骨缺损修复开辟了新的途径，但离临床应用尚有较大距离，如何快速、大量地获得种子细胞和构建性能良好的支架材料是目前面临的两个关键性问题。许多研究证实，人骨髓间质干细胞（Human Bone marrow derived mesenchymal stem cells, HBMSCs)具有良好的多向分化潜能，能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种中胚层来源的间质细胞分化。β-磷酸三钙多孔陶瓷（Beta-tricalcium phosphate, β-TCP) 是近年来广受关注组织工程骨支架材料，动物实验证实其具有较好的生物相容性和较高的力学强度，并且能通过改变结构来调节降解时间，最终被新生骨爬行替代达到完全愈合 [4-6]。本研究结合两者优点，在体外构建组织工程人工骨，并植入裸鼠皮下，验证二者生物相容性和体内成骨效果。
2.材料与方法
2.1主要试剂和仪器
低糖DMEM培养基（Gibco, USA)，优等胎牛血清（Hyclone, USA)，Percoll（1.073, Sigma, USA)，青霉素G钠，硫酸链霉素，两性霉素B（GIBCOBRL, Life Technologies, USA)，地塞米松，β-甘油磷酸，维生素C（Sigma, USA)，FK506 （Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd, Japan)，丙酮酸钠（Sigma, USA)，TGF-beta 3（R&D Systems, Inc. USA)，重组人胰岛素（优沁林？常规，中国礼来公司)，转铁蛋白，亚硒酸，牛血清白蛋白，亚油酸（Sigma, USA)，IBMX（1-甲基3-异丁基-黄嘌呤)（Biosource, USA)，吲哚美辛（Cayman Chemical, USA)，油红O（Sigma, USA)，抗CD29、CD44、CD34 及CD45单克隆抗体（Sigma)，Ⅰ、Ⅱ胶原抗体（SIGMA, USA)，生物素化二抗（DAKO, DENMARK)，多孔β-TCP（5 mm×5 mm×3mm， 400μm孔径，75％多孔性)（Olympus Optical Co. Ltd, Japan)，培养板、培养瓶（Cornig, USA)。
2.2HBMSCs的分离与培养
经患者知情同意，自胸椎骨折病人健康椎体取得骨髓10ml，肝素抗凝后密度梯度离心法离心，取中间单核细胞层以低糖DMEM洗涤两次，接种入75cm2培养瓶（Cornig, USA)，以含10% FBS，100 units/ml 青霉素G钠，100 μg/ml 硫酸链霉素， 0.25 μg/ml 两性霉素B的低糖D-MEM培养。24h后换液，弃未贴壁的细胞，剩余的贴壁细胞主要是MSCs。以后每3天换液，待细胞生长至90%融合后消化传代。以生长良好的第3代细胞为实验细胞。
2.3人骨髓MSCs的生长曲线测定
以原代、第4代和第14代细胞为标本，制备单细胞悬液，调整密度为4×104个/ mL，接种于24孔培养板，每孔200μL ，每3 d换液。分别于1、2、3、4、5、6、7、8 d， 每组取3孔行MTT法检测，酶标仪（Bio-Rad, Model 550) 读取490 nm吸光度（A )值， 绘制细胞生长曲线。
2.4流式细胞仪检测
取生长良好的第3代细胞，制成1×107/ml的单细胞悬液。取洁净的普通塑料试管，分别加入荧光标记小鼠抗人单克隆抗体CD13-PE，CD29-FITC，CD34-FITC，CD45-PE，HLA-2-FITC， HLA-DR-FITC和同型阴性对照小鼠抗小鼠IgG单克隆抗体各20μl，每管加入细胞悬液100μl，混匀，室温下孵育30min，每管加入1.5 ml PBS，混匀，离心5min（1800r/min)，弃上清，每管加200μl PBS，混匀后，Becton-Dickinson FACScan检测，Apple公司随机软件分析，每个样本分析10,000个细胞。
