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2.5体外多向诱导分化
2.5.1向成骨细胞诱导分化
细胞经消化后调节密度为2×104个/ml，分别接种入12孔培养板和预置盖玻片的6孔培养板， 24小时后细胞完全贴壁，换以成骨诱导培养基培养（100 nM 地塞米松，50μM VitC，10nM β-磷酸甘油，50nM FK506)，同时设对照组仍以基本培养基培养，每三天换液。分别取第7，14天作碱性磷酸酶钙钴法染色，钙Von Kossa染色和Ⅰ型胶原免疫组化。医.学全.在.线网站www.lindalemus.com
2.5.2向软骨细胞诱导分化
调节细胞密度为2×104/mL，接种入6孔板内，以成软骨诱导培养基培养（1mM 丙酮酸钠，0.1mM 维生素C，0.1nM 地塞米松，10ng/ml TGF-beta 3，6.25μg/ml 重组人胰岛素，6.25μg/ml 转铁蛋白，6.25ng/ml 亚硒酸，1.25ng/ml 牛血清白蛋白，5.35μg/m l亚油酸)。分别培养至7、14天行Ⅱ型胶原免疫组化和Alcian 蓝染色。
2.5.3向脂肪细胞诱导分化
细胞以2×104/mL种植于6孔培养板内，以成脂肪诱导培养基培养（1μM 地塞米松，10mg/L 重组人胰岛素，0.5mmol/L IBMX，100μM 吲哚美辛)。培养至第15天时作油红O染色。
2.6体内成骨活性研究
调节细胞密度为1×106cell/ml，将β-TCP立方块浸入细胞悬液后立即在低压环境（100mmHg)下作用100秒（10)，获得MSCs/β-TCP复合物共52枚，随机分为成骨诱导组和对照组，各以成骨诱导培养液和基本培养液培养2周后，将所有复合物植入26只雄性6周龄裸鼠（SCID，上海斯莱克实验动物有限责任公司)背部皮下。
2.6.1扫描电镜
接种24小时后待细胞贴壁牢靠，每组随机取2枚复合物行扫描电镜（Hitachi S520，Japan)观察β-TCP内部细胞情况。植入裸鼠体内4、8周后，取出复合物，剔尽表面结缔组织，生理盐水洗净，剃须刀片（飞鹰牌，上海刀片厂)沿中线切开，扫描电镜观察材料中心成骨情况。
3.结果
3.1倒置相差显微镜观察
原代接种第一天即可见较多细胞贴壁，外观呈纺锤形和多角形，并可见细胞核。72小时后细胞数量开始增多，细胞形态呈成纤维细胞样，并可见较多细胞核内有双核仁，细胞呈集落样生长。培养至12天左右细胞汇合达到90％左右，细胞呈极性排列，集落呈漩涡状。细胞传代后仍保持成纤维细胞样外形，增殖速度很快，5-7天即再次汇合达90％。
3.2人骨髓MSCs生长曲线
骨髓MSCs生长曲线呈S形，接种后第1-2d为潜伏适应期，从第3 d 起细胞开始增殖并进入对数生长期，第8 d 达到高峰，以后进入平台期。根据生长曲线可知骨髓MSCs的群体倍增时间为26 h。本实验中P1、P4、P14细胞增殖速率无明显差异（P＞0.1)。
3.3细胞表面标记物
经流式细胞仪检测，MSCs 均一地表达CD13、CD29，HLA-2，阳性率分别为99.97%，98.46%和94.27%；而CD34、CD45 和HLA-DR 阴性，阳性率分别为5.16%，1.34%和3.13%。
3.4成骨细胞诱导分化
3.4.1碱性磷酸酶钙钴法
诱导组细胞于第7天即可见阳性反应，第14天时阳性反应更明显。而对照组两个时间段阳性明显较弱。
3.4.2钙Von Kossa染色
诱导组细胞于第7天左右可见细胞表面，培养液内有较多黑色细小颗粒出现，随着诱导时间延长黑色颗粒明显增加，第14天时阳性反应更明显。
3.4.3Ⅰ型胶原免疫组化
诱导组细胞免疫组化染色呈阳性，对照组基本无阳性反应。
