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3.5软骨细胞、脂肪细胞诱导分化
3.5.1软骨细胞诱导分化
Ⅱ型胶原免疫组化呈阳性反应，对照组基本无阳性反应。Alcian蓝染色：诱导组细胞呈阳性反应，第14天时阳性反应更明显。而对照组两个时间段阳性明显较弱。
3.5.2脂肪细胞诱导分化
14天后细胞形态逐渐向类圆形转变，体积变大，胞浆内出现少量圆形透亮小滴。油红染色发现大部分细胞胞浆内大小不一的脂滴呈橘红色，浅蓝色胞核被挤于细胞一侧或中央。
3.6扫描电镜
接种24小时后，材料中心孔壁可见少量细胞贴附。细胞呈扁平状，表面较光滑。复合物植入体内4周后电镜可见孔径内细胞已经明显增殖，数量较前大大增多，且细胞外观饱满，表面有大量突起及纤维样结构与周围细胞和材料连接，提示细胞功能处于活跃状态。
3.7组织学检查
分别于4，8周后取出植入物作组织学检查。FK506处理组植入4周后，发现β-TCP微孔内新骨生成明显，几乎每个微孔区内均见较多骨组织，且小圆细胞罕见，提示植入物内炎性反应轻微；植入8周后取出者见微孔区内有较多血管长入，新骨量亦较前有显著增加。但是，对照组植入4周和8周取出无明显新骨生成，而疏松纤维组织明显。
4.讨论
骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells, MSCs)因采集方便，分离扩增技术成熟，有良好的多向分化潜能，是目前研究最多的骨组织工程种子细胞，具有极大的应用前景。Sawyer 等将MSCs复合到多孔磷酸钙陶瓷上进行体外培养，MSCs表达成骨细胞表型，在陶瓷多孔中有纤连蛋白和骨钙素蛋白合成。Song等发现供体MSCs能掺入到受体不同的组织中去，成为骨和软骨等不同组织间质细胞的来源，表明MSCs在体内不同组织的微环境作用下，可以定向分化形成不同谱系的细胞，获得靶组织的表型。国内也有研究利用碱性成纤维细胞因子和骨形成蛋白将MSCs进行诱导成骨，取得了很好的效果。而有关MSCs在体内分化的具体机制有待深入研究。
要用于组织工程研究，分离与培养的细胞必须在形态学上和功能学上均满足MSCs的标准。本实验以密度梯度离心法结合差异贴壁法分离人MSCs，细胞呈成纤维细胞样生长，细胞集落称漩涡状；生长曲线与MSCs曲线一致；第3代细胞经流式细胞仪检测均一表达间充质细胞来源表面标记CD13、CD29，HLR-1，而造血干细胞来源表面标记CD34、CD45 和HLA-DR 阴性，且CD13、CD29，HLR-1阳性率分别高达99.97%、98.46%和94.27%；所获得的细胞在体外不同诱导条件下，能成功向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞分化，证实其具有良好的多向分化潜能。本研究从形态学和功能学上充分证实，以此方法所获取的人MSCs具有高纯度，强增殖能力和分化潜能的特点，完全满足组织工程研究的需要，所获得的细胞可建立细胞株用于后续研究，此方法可作为常规方法用于获取MSCs。医.学全.在.线网站www.lindalemus.com
β-TCP化学成分与钙磷比值接近于正常骨组织，具有良好的生物相容性，可在体内降解，并可通过调节孔隙率和孔径按需调节其生物力学强度和降解速度，已被较多研究证实为极具研究前景的人工骨支架材料，对于构建一理想的骨移植替代物用于骨科临床，以期达到移植物被新生骨替代而使骨缺损达到完全愈合。Hoshino等2007年将未经诱导的兔MSCs直接接种于多孔β-TCP修复自体颅骨缺损，发现其可在体内诱导、分化为成骨细胞，并对颅骨缺损进行了有效的修复，提示多孔β-TCP不仅能够提供一个组织生长的三维支架结构，还能为被移植的干细胞向成骨细胞分化并形成骨组织提供一个良好的微环境。国内白峰等2007年研究发现，支架材料孔隙间的连通是影响材料体内血管化的关键因素，较高的连通率可以使材料血管化更为完全，而连通径的大小可以限制新生血管管腔的大小。400μm孔径，75％多孔性的β-TCP支架能提供较理想的血管化，从而加速骨再生的过程。本实验所用多孔β-TCP为5 mm×5 mm×3mm， 400μm孔径，75％多孔性，体内降解时间为8-12周。实验组支架植入裸鼠皮下后，植入物内小圆细胞较少，提示炎性反应轻微；植入8周后取出者见微孔区内有较多血管长入；新骨量随时间增长显著增加，说明所采用多孔β-TCP具有优良的生物相容性，有利于支架血管化，从而进一步促进新骨生成。本实验将人MSCs与β-TCP结合并植入裸鼠皮下，观察到成骨诱导组成骨能力强于对照组，进一步证实其具备良好的体内诱导成骨能力。
本实验证实MSCs有强大的增殖和成骨能力，而β-TCP具有优良的生物相容性及诱导MSCs体内成骨能力，是理想的组织工程化人工骨种子细胞和支架材料。如进一步深入研究，有望开发出临床可应用的组织工程人工骨产品。
