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2.2 方法
本实验程序包括培养hep-2 细胞， 提出总RNA, 行聚合酶链式反应（PCR)， 扩增 COX-2编码区基因 （CDS)。将PCR 扩增产物回收、酶切， 并正向克隆至pCDNA3.1（+) 载体中， 通过酶切、测序、鉴定重组质粒， 导入hep-2 细胞中。具体如下： 培养细胞、提取总RNA 常规培养人喉癌细胞hep-2 细胞， 当细胞生长至对数期， 收获细胞。 用提出总RNA, 将mRNA 逆转录成cDNA, 再以cDNA 为模版， 行聚合酶链式反应（PCR)， 扩增 COX-2 编码区基因 （CDS)。
2.2.1 RT-PCR
2.2.1.1 引物设计
根据NCBI（National Center for Biotechnology Information)给出的Cyclooxygenase-2 基因序列（Genbank [gi:34576917] AY382629 DQ782954)， 应用Primer premier3 软件设计包括CDS序列在内的一对引物。同时根据pCDNA3.1 载体酶谱选取适当的限制性内切酶， 将此酶切位点（Hind III 和XbaI)碱基序列分别加入引物的5端， 其酶切位点的前方是加入的保护碱基， 使其能够通过连接将该基因正向插入pCDNA3.11（+)载体内， 且保证正确的阅读框。成熟的COX-2 蛋白为553 个氨基酸， 此实验设计的全部序列片段长度， 包括酶切位点和保护碱基为1734bp。引物放在包括一段CDS 以外的mRNA 位置时， 能够扩增出目的片段 （因在起始端 （ATG) 自然序列引物不能扩出理想的目的片段)。设计的引物序列如下：
上游引物： 5'- TATAAGCTTCCCTCAGACAGCAAAGCCTA-3；下游引物： 5'- CTAGTCTAGACTACAGTTCAGTCGAACGTTCTTTTAG-3' 。
2.2.1.2 酶切位点
引物内斜体字是引入的酶切位点， 分别是Hind III、XbaI。此引物委托北京诺赛基因公司合成。以下加粗字体是Cyclooxygenase-2 基因CDS 的自然序列， 前50 个碱基 （非加粗字体) 是CDS 之前的mRNA, 方框内是引物对应的序列。医学全在.线www.lindalemus.com
2.2.1.3 PCR 反应体系
按上述顺序加入各组分后混合均匀， 上机反应。PCR反应参数为：98℃预变性30s, 98℃变性12s, 65℃退火40s, 72℃延伸10s, 30个循环后， 72℃再延伸5min, 4℃ 保存。反应结束后， 先取6μlPCR产物， 在1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.2.2 PCR 产物的回收和纯化将PCR 产物用胶回收试剂盒（D2501-02, E.Z.N.A. Gel Extraction Kit, Omega Bio-Tek, Inc)回收、纯化。
2.2.3 目的基因亚克隆
2.2.3.1 将PCR 产物连接到T 载体上
此PCR 反应体系中使用的高保真DNA 聚合酶扩增出的PCR 产物是平末端。在将PCR产物连至表达载体之前需将其连接到T 载体（已连接拓扑易构酶)上， 此T 载体也是平末端，故已完成PCR 产物3端不需要加A（腺嘌呤)。根据T 载体和PCR 产物的摩尔浓度按1:5 比例计算， 根据DNA Marker 亮度大致确认浓度。其反应过程如下。
PCR产物 2μlT载体 1μlddH2O 2μl25℃ 15min
2.2.3.2 将T 载体转化至大肠杆菌中
将T 载体转化至大肠杆菌中，其步骤如下：
① 将50μl E.col DH5α 感受态细胞加入1.5mL 离心管中， 置冰浴中；② 将已和T 载体连接好的PCR 产物1μl 加入到此离心管中， 轻轻混匀；③ 将离心管放置冰浴中静置30min;④ 30 min 后将离心管放置42℃恒温水浴中静置90s, 要稳固、不可摇晃；⑤ 迅速将离心管置冰浴中静置3min;⑥ 向离心管中加入500μl LB 液体培养基， 放入37℃摇床中培养90min, 180 转/分钟；⑦ 将菌液涂布在含有100μg/mL 氨苄青霉的琼脂培养基上， 37 ℃放置， 待表面的液体吸收后倒置此平板培养基， 继37 ℃培养过夜。次日在培养基上出现了菌落。
