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2.2.3.3 PCR 方法筛选阳性克隆菌株
取平板培养基上的数个菌落分别放入各试管中， 在试管上标记后， 各加入10μl 纯净水，混匀、震荡。以下分两方面进行。一方面将其菌液取出1μl 作模板， 行PCR 检测 （PCR 反应体系和程序参照上述)。从PCR 反应的结果看， 其中有多个转化子的电泳得到与目的基因（1721bp)大小相一致的条带， 认为是转化成功。另一方面， 做PCR 余下的菌液再加入5 ml LB液体培养基， 移至37℃摇床中， 180 转/分钟， 培养过夜。PCR 完成后， 根据以上PCR结果， 将符合要求菌落的菌液分别测序。
2.2.4 片段连接到表达载体
环状空质粒也同时双酶切。取2μl 再次电泳，对比DNA Marker 大致确认浓度。根据载体和目的片段的摩尔浓度按1:3 比例计算， 用T4 连接酶将目的片段连接到表达载体（pCDNA3.1)。
2.2.5 将连接好的质粒转化至大肠杆菌中
转化过程同前（略)， 培养大肠杆菌、扩增过程同上（略)。经菌株测序筛选阳性克隆， 确定已连接的菌株， 加入10%灭菌的甘油，-80 ℃保存待使用。
3.讨论
由于有越来越多的证据说明COX2 蛋白在肿瘤的形成过程起到多方面的中枢作用， 有较多的文献支持用COX-2 作为靶蛋白处理各种肿瘤细胞， COX-2 蛋白处理已成为化学治疗肿瘤的一部分。就目前已经明确的资料显示：COX-2 蛋白的过表达涉及以下诸方面生物学行为：肿瘤新生血管生长、细胞增生、凋亡、有丝分裂、细胞粘连、免疫监视等。
鳞状细胞癌是常见的头颈部恶性肿瘤。大多SCC 中均可发现转录因子3 的信号转换器和激活素（signal transducer and activator of transcription 3, Start3)的表达， 它的表达和肿瘤细胞的生长相关[20、21]。研究报告发现： NSAID 抑制COX-2 和Survivin 的下调， 使细胞增生的抑制和凋亡的发生是通过抑制Start3 的通路完成的。研究也看到， 在早期的头颈部肿瘤病人，Start3 的高表达和肿瘤的发展可能伴随病人的预后不佳。
COX-2 的活化促进了PGs 的合成水平， 促使了肿瘤新生血管生长的因子血管上皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF)蛋白的升高， 这将刺激肿瘤的新生血管生长。医学全在.线www.lindalemus.com
采用基因治疗方法， 促使进展期肿瘤缺血、坏死也是新的抗肿瘤策略之一。已经有些研究发现： 某些蛋白的表达和肿瘤的慢性缺血状态相关， Survivin 和糖元调节蛋白（Glucose-regulated protein 78, Grp/78)是能够在肿瘤慢性缺血时被表达下降的蛋白。因此肿瘤的慢性缺血和Survivin、Grp/78 表达的水平被研究和观察。研究者可能的意图是： 使用NSAID 相继使COX-2 和Survivin 抑制， 如果Survivin 蛋白能够在肿瘤慢性缺血时被下调表达， 那么， 使用NSAID 致COX-2 抑制， 进而使Survivin 抑制， 就可能干预肿瘤的慢性缺血的过程， 或者是可能有助于延续肿瘤的缺血状态， 就加重了肿瘤细胞的坏死和最终的消退。但是另一些研究有不尽相同的结果。同时， 实验者还看到在肿瘤组织缺血的导致survivin 水平显著的下降， 使得肿瘤组织极其明显地增加了对Celecoxib （一种选择性抗COX-2 的NSAID)抗肿瘤的敏感性。另外， 肿瘤组织的缺血状态， 诱导了Grp/78 蛋白， 而后者又有一定的抑制survivin 表达的下调的作用。因此，为了澄清这一生物学过程， 最终得到NSAIDs 控制肿瘤细胞的生长的目的， 达到使用NSAID 致COX-2 抑制， 进而下调survivin 的表达， 干预肿瘤的缺血的过程， 成为一种实验和临床追求的实际效果， 更深入的研究是必要的。
COX-2 调节抗凋亡蛋白survivin 而促使细胞的生存, 抑制凋亡是通过抑制survivin通路完成的。
以上几方面是文献报告的实验结果， 也是我们今后的研究方向， 我们将借鉴这些观察到的实验结果和理论依据， 应用我们已经构建的COX-2 原核表达载体pCDNA3.1, 研究和评价COX-2 基因和蛋白质在hep-2 细胞和其他头颈肿瘤细胞中对下游的靶蛋白的相关的影响。具体的实验方案是将带有COX-2 基因COX-2 原核表达载体pCDNA3.1, 用转染方法导入hep-2细胞或其他头颈肿瘤细胞中、培养细胞， 并且应用NSAIDs 来干预肿瘤的发展， 在mRNA 和蛋白两个水平上检测相关因子， 借以研究和评价COX-2 对下游的各相关靶蛋白的影响。
