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公共卫生医学论文酶消化结合组织块培养法
1 引言
TMJ 是人体内最复杂的关节之一，其运动和功能中心位于下颌骨髁状突和颞骨关节面之间无血管的纤维软骨组织--关节盘，而大约70%的TMJ 关节紊乱病(temporomandibulardisorder, TMD)与关节盘病变有关，主要表现为关节盘变薄、透明样变、穿孔等特征。迄今为止，临床治疗的主要目的在于恢复关节盘的生物力学功能和缓解症状，治疗方法虽多，但没有一种可治愈此病的好方法。关节盘组织工程的兴起为治疗关节盘疾病提供了一个有较好前景的治疗新方法，但由于自体关节盘纤维软骨组织量少、取材困难，如何运用少量的关节盘组织，在适宜的条件下分离及培养获取数量多、活性高及分化功能良好的种子细胞是当前TMJ 关节盘组织工程的重要问题之一。近年来，有关TMJ 关节盘组织工程研究中关节盘细胞的体外培养多为采用II 型胶原酶一步消化法[5-11]。但是，微量的关节盘组织经过长时间的酶解后细胞的损失量较大，获得的细胞数量较少，不利于细胞的大量增殖。若按照文献中提供的方法获取关节盘细胞则需要大量的TMJ 关节盘自体组织，必然增加研究的成本和费用。本实验尝试使用组织块培养结合酶消化法对关节盘细胞进行体外培养研究，为体外扩增关节盘细胞进行组织工程研究提供一种新的方法。
2 材料与方法
2.1 方法
2.1.1 关节盘纤维软骨细胞的分离实验动物标本来自当地屠宰厂，1 月龄山羊共8 只，每只质量约10kg。在无菌条件下完整切取山羊双侧TMJ 关节盘，用含100 U/ml 双抗（青霉素、链霉素)的PBS 液冲洗3 次，修剪去周围组织。放入盛有无血清的高糖DMEM 灭菌培养皿中，用眼科剪将关节盘纤维软骨组织剪成1.0 mm3 大小的碎块后移入三角烧瓶中，加入5 倍体积的0．25％胰蛋白酶， 37℃恒温摇床中振荡消化30 min 后，用含双抗的PBS 洗涤二次。再加入0.01% I 型胶原酶继续消化3h，含双抗的PBS 洗涤二次。将消化好的关节盘组织块以每孔9 块，距离 5～10mm的密度置入6 孔培养板中，并在组织块表面放置一24×24 mm 的盖玻片，轻压，防止加入培养液时组织块浮起。
2.1.2 原代培养
向上述接种有组织块的培养板中缓慢加入DMEM 培养液(含10% 胎牛血清，100 U/ml靑、链霉素，25 mg/L 抗坏血酸)，于5％CO2 饱和湿度、37℃恒温箱下培养，72h 后半量换液，以后隔日换液逐日在相差显微镜下观察细胞生长情况。医.学.全.在.线网站提供。
