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2.1.3 传代培养
待细胞长满瓶底80%，取出盖玻片，用眼科镊夹出组织块后，将0.25% 胰蛋白酶1.0 ml加入培养瓶，轻摇至消化液流遍所有细胞表面后，倒掉消化液后再加1.0 ml 新的消化液进行消化，在显微镜下观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后立即加入含血清的DMEM 培养液中止消化。用吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，收集细胞悬液，低速离心(800 rpm, 5 min)。计数，按1:2 比例从6 孔板传代于培养瓶中，按上述条件继续培养。
2.1.4 细胞生长曲线的测定
取生长良好的 1～3 代细胞，计数后以2×104/ml 的细胞浓度接种于96 孔培养板，每个时相点细胞接种4 孔，每孔100μL 细胞悬液。置于5% CO2 饱和湿度、37℃恒温箱下培养。从第2 天起，每天上午同一时间开始加入浓度为5 mg/ml 的3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑嗅盐(MTT)10 μl 混匀, 继续孵育4h 后加入100μl 十二烷基硫酸钠(SDS)，用酶联免疫检测仪上570 nm 处检测每个孔的吸光度(OD 值)，取平均值，以时间为横轴，光吸收值为纵轴，以不加细胞只加培养液的空白孔为对照。连续测一周，绘制生长曲线。
2.1.5 甲苯胺蓝染色取第 1 代培养细胞，固定后加入10 g/L 甲苯胺蓝染液，室温下染色30min，蒸馏水洗，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察细胞的染况，照相记录。
2.1.6 I 型胶原免疫组化染色细胞传代后，以第1 代作细胞爬片，培养第4 天时取出，PBS 液冲洗3 次，用4% 多聚甲醛固定30min，蒸馏水洗，入体积分数3%的过氧化氢室温孵育5min，滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育10min，倾去血清后滴加适当比例稀释的I 型胶原蛋白一抗工作液(1:50)，4℃过夜；PBS 冲洗，3 min×3 次；滴加生物素标记山羊抗小鼠IgG，37℃,15 min；PBS 冲洗，3 min×3 次；滴加试剂辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃，10 min；DAB 显色剂室温显色3 min 后，苏木精复染，脱水，透明，封片。镜下观察细胞的染况，照相记录。
2.1.7 主要观察指标在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化及贴壁率，甲苯胺蓝染色、I 型胶原免疫组化染色进行细胞鉴定，测定其生长曲线。
3 结果
3.1 倒置显微镜观察
细胞的形态学及生长情况培养至第 4 天，在组织块的周边区域可见爬出的细胞，散在排列，细胞呈梭形或三角形。
7 天后，细胞为长梭形，多角形，部分细胞突起互相连接。培养至第10 天,细胞彼此相连，长满整个培养皿底面的80%，有细胞重叠现象，此时应适时传代。传代后1h 细胞即开始贴壁。2h 后开始伸展，贴壁细胞形态为多角形，短梭形。6h 已经能适应体外培养条件，增殖速度加快，4～5 天后即可贴满瓶底。
