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3.2 生长曲线的测定
纤维软骨细胞第1～4 代细胞生长曲线基本相同, 呈S 形，接种后1 天细胞数稍有减少, 经过24～48h 的潜伏适应期后, 细胞大量增加, 进入对数生长期, 第5 天细胞生长减缓，进入平台期。
3.3 关节盘纤维软骨细胞鉴
定甲苯胺蓝染色胞浆呈紫蓝色。I 型胶原免疫组化染色显示胞浆染成黄色, 而胞核不染色。
4 讨论
山羊的TMJ 关节盘在大小、形态、结构和功能方面与人的关节盘比较相似，与其他实验动物如猪，狗，牛等相比取材容易，价格低廉，故本实验采用1 月龄健康山羊作为研究对象。在组织结构上TMJ 关节盘由大量I 型胶原、水和蛋白多糖及稀少的纤维软骨细胞和弹性纤维组成。关节盘纤维软骨基质含量高而细胞含量低，需要通过将组织块反复剪碎并且消化酶消化的方法使致密的胶原松散化，以利于细胞的爬出。文献报道的方法多为使用Ⅱ型胶原酶消化关节盘组织以获取关节盘细胞。但由于关节盘本身的组织量较少，并且在临床应用过程中，多数采用穿刺活检的方法获取局部的组织，由于长时间的消化和反复洗涤离心，会对细胞造成损伤，获取的细胞量往往十分有限；此外，长时间的消化会破坏细胞膜表面的整合素,从而影响细胞的粘附力,并造成胞外基质合成时基因表达的改变，从而影响细胞合成胞外基质、维持表型及增殖的能力，很难实现细胞体外生长和扩增的目的。
组织块培养法消化时间较短，操作简单，适用于组织量较少的原代细胞的培养, 并且组织块中含有大量的生长因子，通过剪切，可以使这些生长因子游离出来释放到培养基中，对细胞的体外生长起积极作用。TMJ 关节盘几乎都由I 型胶原构成，所以本实验采用了I 型胶原酶联合胰酶对组织碎块进行消化，使组织疏松以便细胞的爬出。未经处理的组织块往往不易帖壁，从而影响细胞的迁出及增殖，常用的解决方法为在细胞培养容器壁上涂以鼠尾胶原或多聚赖氨酸,本实验将消化后的组织块用盖玻片覆盖，这有利于置入块早期的固定和帖壁，使细胞更易迁出和生长，而且操作简单。本实验的细胞在10 天即可形成细胞簇，传代后的纤维软骨细胞贴壁时间缩短，增殖速度加快，在体外可以实现快速大量扩增。有关于兔TMJ 关节盘细胞培养的研究发现细胞传至10 代以后，其增殖速度并未减缓，说明培养的纤维软骨细胞尚未发生反分化趋势。
TMJ 关节盘及膝关节半月板同属纤维软骨，与透明软骨细胞不同，后者分泌的细胞外基质成分主要是II 型胶原，而纤维软骨细胞则以分泌I 型胶原为主。实验采用甲苯胺蓝和I 型胶原免疫组化染色证实了TMJ 关节盘细胞所具有的纤维软骨的特征，与课题组在另外的研究观察相一致。医.学.全.在.线www.lindalemus.com
本实验结果显示，采用将组织块消化一定时间后对组织块进行培养，待细胞簇连结成片后传代，即可实现体外扩增TMJ 关节盘细胞的目的，此方法操作简单、易行，为实现TMJ关节盘组织工程中纤维软骨细胞的大量体外扩增提供了新的可行的方法。但是，使用组织块培养法是否会影响TMJ 关节盘细胞表型特征的维持以及是否需要通过改善细胞环境以促进细胞外基质的分泌还有待进一步研究。
