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高浓度甲羟孕酮抑制内皮祖细胞的增殖
1. 引言
血管生成是肿瘤发展的重要阶段，新生血管为肿瘤提供独立的血管支持，促进肿瘤的发展，抑制肿瘤的血管生成是抗肿瘤的新方向。研究表明EPCs参与肿瘤的血管生成，促进肿瘤的发展和转移。特异性的去除EPCs明显减少血管生成，使原发和继发肿瘤体积缩小。
因此，抑制EPCs的功能可以抑制肿瘤的生长。甲羟孕酮有抑制肿瘤细胞和血管生成的作用，但具体机制仍不清楚。本论文研究了MPA对EPCs生长的作用，以期了解MPA在抗肿瘤血管生成中的作用机制。
2. 材料与方法
2.1 实验动物
雌性成年Beagle犬，由四川大学华西医院动物实验中心提供。
2.2 主要试剂
EBM-2培养液(Lonza)；MPA、淋巴细胞分离液、MTT均购自Sigma；兔抗人PR抗体(SantaCruz)。
2.3 EPCs的分离培养
无菌抽取犬骨髓5ml，肝素抗凝，置于淋巴细胞分离液(1.077)上，密度梯度离心(500g，25min)。吸出单个核细胞层，PBS洗涤两次(250g，10min)，以EBM-2重悬细胞，接种于FN预包被的培养瓶中，37℃、5%CO2培养。4d后首次换液，以后每3天换一次液，待细胞长至90％汇合后传代。实验采用第三至第五代细胞。
2.4 免疫细胞化学
细胞爬片经PBS漂洗后，用4%多聚甲醛固定15min，正常血清37℃封闭30min，吸去多余血清；分别滴加兔抗人PR多克隆抗体(1:100稀释)，4℃过夜；生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育30min后，ABC法显色；苏木素复染、封片，光镜下观察。以PBS为阴性对照。
2.5 细胞增殖实验
取对数生长期细胞加入96孔(2.5×103/孔)板中，贴壁4h后，为避免EBM-2培养基中的生长因子干扰实验，换为含不同浓度MPA的M199(10%胎牛血清)培养液，以下实验均同样处理。MPA终浓度分别为1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、0mol/L，重复3孔。MTT法测定吸光度值(OD)，连续7天，绘制EPCs的生长曲线。
2.6 MPA抑制率测定
采用1×10-3、7.5×10-4、5×10-4、2.5×10-4、1×10-4、7.5×10-5、5×10-5、2.5×10-5、1×10-5、0mol/L的MPA作用于EPCs48h后，计算其抑制率。
抑制率=(1-实验组OD/对照组OD)×100%并用SPSS软件计算半数抑制率IC50。
2.7 数据处理及统计学方法计量数据均以均数±标准差表示，多组计量数据均值的差异采用单因素方差分析(ANOVA)。统计学分析采用SPSS13.0统计软件。P<0.05表示差异有统计学意义。
