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1.2.4 DAPI染色法检测细胞凋亡 取固定好的细胞爬片，常规水化后滴加浓度为100ng/ml的DAPI染液，室温染色10min，流水冲去染液，滤纸吸除多余水分，加一滴荧光封片液，置于荧光显微镜下观察，激发波长360-400nm。
阳性结果判断：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期，Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态； a Ⅱ 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化； b Ⅱ 期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
1.2.5 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR)检测Bcl-2和Bax mRNA水平 细胞培养至完全汇合时，使用TaKaRa TRIZOL Reagent Kit，按说明书提取细胞总RNA进行RT-PCR反应。从Primer Bank中获得人类Bcl-2和Bax基因引物序列。人Bcl-2上游引物为： 5- CCAAGAATGCAAAGCACACTG-3 ，下游引物：5-CCCAGCCTCCGTTATCCTG -3，扩增片段为711bp；Bax上游引物为：5-CTGGACAGTAACATGGAGCTG-3 ，下游引物为 5-GGCGTCCCAAAGTAGGAGA-3，扩增片段为296bp。人β-actin作为内参照，引物序列如下：上游为5-CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC-3，下游为5-CTCCTT AAT GTC ACG CAC GAT-3，扩增片段长度为250bp，引物由上海生工合成。PCR产物用1.8%琼脂糖凝胶分析。医.学.全.在.线www.lindalemus.com
1.2.6 Western blotting检查磷酸化p38表达：用0.01M PBS冲洗培养融合至80%的细胞，加入450μl裂解液（1mM NaHCO3和10mM PMSF)后用细胞刮将细胞刮下收集到EP管中，15，000rpm离心，收集上清蛋白样品，用BCA ProteinAssay Kit（美国Pierce公司)对每种蛋白样品定量。每种样品取20μg进行变性蛋白电泳，凝胶浓度为12%。电泳结束后将凝胶中蛋白转到硝酸纤维素膜上（美国Millipore公司)，5%脱脂奶粉封闭过夜后，将硝酸纤维素膜放入一抗室温孵育1h。洗膜后，将膜与HRP-结合的二抗室温孵育1h。洗膜后用ECL Westernblotting system（美国GE公司)显色。
1.2.7 统计学处理：数据资料以均数±标准差（x±s)表示，并用SPSS软件16.0进行t检验或单因素方差分析。
2 结果
2.1 Claudin-6诱导MCF-7细胞凋亡 为了检测claudin-6是否能够诱发MCF-7细胞凋亡，应用TUNEL法、DAPI stain和Annexin-V/PI double stain检测各组细胞凋亡情况。结果显示，实验组细胞的凋亡率与vector组比较明显增高。同时DAPI核染色发现在稳定表达claudin-6的实验组细胞中可见明显的凋亡细胞核形态，即细胞核呈波纹状，染色质高度凝聚、边缘化，部分细胞核裂解为碎块。而control组细胞的自然凋亡率与vector组比较，差异无显著性意义，结果如图4所示。上述结果说明，claudin-6促进了MCF-7细胞凋亡。
2.2 Claudin-6刺激MCF-7细胞信号转导途径的激活 ERK、p38 MAPK和PI3KMAPK等信号途径在细胞凋亡诱导中发挥了重要作用。 在claudin-6表达的MCF-7细胞中，claudin-6是否激活这些信号转导途径，从而参与细胞凋亡的调控？应用Western blot检测各组细胞中上述信号途径的激活情况。结果发现，在claudin-6表达的MCF-7细胞中p38 MAPK途径明显处于激活状态，如图5、6所示。上述结果提示claudin-6表达激活了p38 MAPK途径。
2.3 抑制剂对不同信号途径的抑制作用 为进一步明确p38 MAPK信号途径在claudin-6介导信号转导通路中的作用，我们应用该信号途径特异性抑制剂，观察其是否能选择性阻断相应的信号途径：p38 MAPK抑制剂SB203508。应用Western blot检测p38 MAPK信号途径活化状态，结果如图7-12所示。结果发现p38 MAPK途径的确能够被特异性抑制剂SB203580明显抑制，而claudin-6的表达未受影响。医.学.全.在.线www.lindalemus.com
2.4 p38 MAPK信号途径在表达claudin-6的MCF-7细胞中凋亡调控的作用 为明确p38 MAPK途径在claudin-6诱导MCF-7细胞凋亡中的作用，我们用SB203580处理各组细胞，然后应用Western blot检测各组细胞的凋亡情况。结果发现用SB203580阻断p38MAPK途径后，实验组细胞claudin-6的促凋亡作用被抑制，出现细胞凋亡降低，如图13、14所示。上述结果表明，MCF-7细胞中claudin-6的促凋亡作用是通过p38 MAPK途径转导的。
