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3 讨论
Claudins 是构成细胞紧密连接的一类重要的跨膜蛋白，其表达和定位对于紧密连接结构和功能的完整性都非常重要。Claudin-6 是 claudins 家族成员之一。近来的研究表明 claudins 表达改变与上皮来源的肿瘤发生及转移有关。在某些特定上皮来源肿瘤中 claudins 表达异常，例如 claudin-1 表达下调或claudin-3 和-4 上调能够增加肿瘤细胞的侵袭性，促进瘤细胞的恶性转化。临床上，某些claudins 表达异常是判断侵袭性肿瘤预后的重要指标。因此，确定claudins 在肿瘤发病中的作用能够为我们更深入的了解肿瘤发生及恶变的机制提供帮助。
我们在前期的研究工作中克隆和鉴定了肿瘤抑制相关基因claudin-6，建立了稳定转染claudin-6真核表达载体的MCF-7细胞单克隆，发现细胞表达claudin-6后生物学行为发生了很大改变，比较突出的变化就是细胞生长缓慢并且出现了明显的死亡，为验证这种死亡部分是由于细胞凋亡造成的我们对转染前后的细胞进行了凋亡的检测并比较，结果发现与对照组相比，claudin-6表达细胞出现了明显的凋亡现象。
细胞凋亡是一个非常复杂的生理过程，对于有机体维持稳态至关重要，凋亡的缺失常常是肿瘤发生的原因之一。许多因素都可以诱发细胞凋亡，而不同诱导因素可经不同途径诱导细胞凋亡，同一种诱导因素在不同条件下的作用机制也不尽相同。因此，我们推测 MCF-7 细胞中 claudin-6 表达的缺失导致细胞逃避了凋亡，并且在癌变过程中发挥了一定的作用。而且，Makoto 等人发现MCF-7细胞中 claudin-6基因表达沉默使细胞对凋亡诱导剂的敏感性降低。此外该研究组证明抑制 occludin 能导致细胞对致凋亡因素的抵抗性增加以及能逃逸细胞老化程序，因此增强了癌细胞的致癌、侵袭及转移能力。
目前关于claudins诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究甚少，因此本研究为探讨claudins促瘤细胞凋亡的调控机理提供了线索。
本文报道了在MCF-7细胞系中，claudin-6表达上调能明显促进细胞凋亡，从而达到抑瘤作用。凋亡在防止癌症的发生和维持阻止稳态中发挥了重要的作用。越来越多的研究发现凋亡活性的缺失促进了肿瘤的发展。因此，更好理解claudin-6表达缺失诱导的细胞凋亡在肿瘤发生中发挥了关键的作用。 此外，claudin-6的表达也降低了癌细胞的恶性表型，如侵袭和迁移活性，从而抑制了肿瘤的转移。
接着我们对claudin-6诱导细胞凋亡的信号通路进行了检测。至今，关于claudins参与的信号通路研究甚少，但是发现其与一些信号通路有关。如Taddei等人发现发现在鼠胚胎干细胞中claudin-5表达上调时PI(3)K–Akt pathway途经被激活。Kun Zhang等人发现在乳腺癌细胞系T47D中claudin-1表达下调能够激活Erk1/2途经，从而导致细胞的运动性增加。此外，Oshima等人发现应用阿司匹林处理人类胃癌细胞系MKN28能通过claudin-7激活p38 MAPK途径，降低单层培养细胞的跨上皮电阻，提高跨上皮的渗透性。因此，我们检测了细胞在转染claudin-6前后上述通路的活化状态， 同时应用各通路抑制剂进一步确定上述通路在claudin-6诱导凋亡中的作用。结果发现，与对照组相比p38 MAPK途径在claudin-6表达细胞中处于高度活性状态，而被检的其它信号蛋白磷酸化Erk1/2和Akt在各组间没有明显差别。随后我们应用通路特异性抑制剂进一步验证了假设。结果表明应用通路特异性抑制剂后磷酸化的p38明显减少，而其它被检的信号蛋白改变不明显。p38 MAPK途径主要参与细胞应激反应和炎症反应，还参与细胞增殖、凋亡和分化。近来研究发现，p38 MAPK在细胞凋亡过程中起重要作用。研究发现不同细胞在受到不同刺激影响时，p38 MAPK所扮演的角色是完全不同的。一些研究者发现p38 MAPK途径活化通过介导caspase激活或p53磷酸化诱导凋亡p38 MAPK参与细胞凋亡过程，与诱导bax转位；介导caspase的活化；p53磷酸化及增强TNF的表达介导的凋亡有关。但也有研究表明，p38MAPK信号通路也通过抑制前凋亡信号的产生，参与介导细胞存活信号通路而抑制细胞凋亡。在本研究中，p38在claudin-6表达的MCF-7细胞中明显处于活化状态，加入抑制剂后可明显抑制其活化。因此，我们假设应用通路特异性抑制剂也能影响到claudin-6介导的细胞凋亡和转移表型。为验证这一假设，我们检测了应用p38通路特异性抑制剂前后细胞的凋亡、侵袭和迁移活性。结果表明，与对照组相比，claudin-6表达克隆C2的细胞凋亡明显降低（Fig.3A right，C2)，克隆C1的细胞凋亡率也呈现出降低的趋势。我们的结果表明，表达claudin-6的MCF-7细胞凋亡部分是由p38 MAPK途径介导的。此外，我们发现当p38途径受到抑制时，claudin-6表达的MCF-7的侵袭和迁移活性增高。众所周知侵袭和迁移活性能够反映肿瘤细胞的转移能力。因此，我们的结果表明claudin-6可能通过p38 MAPK信号通路降低了细胞侵袭活性。至今，关于claudins参与p38 MAPK信号途径的研究少有报道。因此，本研究为claudins参与的信号通路增加了新的观点。医.学.全.在.线www.lindalemus.com
总之，我们的结果表明在某种特定肿瘤中claudin-6是一个重要的肿瘤抑制基因。但是，我们目前的研究我们并未弄清claudin-6是如何通过p38 MAPK途径调节细胞表型的。下一步的研究我们将着眼于claudin-6参与肿瘤抑制的精确分子机制。在某些特定肿瘤中恢复内源性claudin-6的表达可能作为诱导细胞凋亡和抑制肿瘤转移的重要治疗手段。
