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医学论文范文:17β_雌二醇对新生牛血清诱导的血管平滑肌细胞增殖反应的影响及其机制

来源:本站原创 更新:2013-9-5 论文投稿平台

1 材料与方法

1.1 动物与试剂雌性新西兰大白兔(购自中山大学实验动物中心)7只,体质量2.5~2.7kg。DMEM培养基、新生牛血清、小牛血清(Gibco公司,美国)、17β_雌二醇、胰蛋白酶、1_{4_[2_(n,n_二甲氨基)乙氧基]苯}_1,2_二苯_1_丁烯(他莫昔芬)、L_硝基_左旋精氨酸甲酯(左旋_硝基精氨酸甲酯,L_NAME)、亮肽素、抑肽酶、苯甲基磺酰氟、三羟甲基氨基甲烷、考马思亮兰(Sigma公司,美国);兔抗iNOS多克隆抗体(Abcam公司,中国),兔抗caveolin_1多克隆抗体(Fharmingen公司,美国),NO测定试剂盒(精美生物工程有限公司,中国),其它试剂为国产分析纯。

1.2 VSMCs培养

利用组织块贴壁法培养兔胸主动脉VSMCs。待细胞长满瓶底后加入质量分数2%的胰蛋白酶消化传代。用4~6代细胞进行实验。实验用VSMCs选用SABC免疫组化法α_actin抗体进行鉴定。

1.3 MTT比色法检测活细胞数量

将VSMC接种于96孔板上,用无酚红无血清DMEM培养液培养24h。在新生牛血清促增殖实验中,加入体积分数10%的新生牛血清继续培养24h。在17β_雌二醇抑制增殖实验中,加入不同浓度17β_雌二醇提前孵育24h后,再加入10%新生牛血清继续培养。每孔加入20μL MTT(5mg/mL)37℃孵育4h后,倾倒培养液,加入二甲基亚砜终止反应,酶标仪于570nm处测量吸光度。在17β_雌二醇孵育细胞之前,加入他莫昔芬(10_7mol/L),或iNOS阻断剂L_NAME(10_6mol/L),或caveolin_1蛋白阻断剂β_MCD(10_3mol/L)提前孵育2h。

1.4 免疫印迹法检测蛋白表达

培养细胞于6孔培养板中经过不同药物处理后,加入0.1mL蛋白提取液裂解细胞,收集提取液,离心后取上清液Bradford法测定蛋白质质量浓度,并进行SDS_PAGE电泳,电印迹转移至硝酸纤维素膜上,分别与一抗(兔抗iNOS多克隆抗体(稀释度1∶50),兔抗caveolin_1多克隆抗体(稀释度1∶100))和二抗孵育,与ECL试剂反应1min后,X光胶片压片曝光,用IBAS图像处理系统对胶片进行扫描测定感光区带的感光密度,并进行积分处理,以对照组为100%进行统计分析作图医.学全.在.线网站www.lindalemus.com

1.5 VSMCs中NO浓度测定

采用NO测定试剂盒,比色法测定。VSMCs经影响因子处理后,取细胞培养上清液100μL,加入磷酸盐缓冲液和硝酸还原酶,37℃孵育1h,加入显色剂后530nm波长测定吸光度。NO(μmol/L)=测定管OD/标准管OD×100μmol/L。

1.6 统计学处理

数据以±s表示。用SPSS11.0统计软件,以单因素方差分析,组间比用t检验。

2 结果

2.1 不同浓度17β_雌二醇对10%新生牛血清诱导的VSMCs活性增加的影响MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法,实验中活细胞数量多少可反映细胞增殖情况。从图1可以看出,10%新生牛血清处理VSMCs 24h后,细胞活性比正常对照组的明显增加(n=6,P<0.05)。提前用10_5~10_10 mol/L的17β_雌二醇预处理VSMCs 24h,均可抑制10%新生牛血清诱导的VSMCs增殖,其作用以10_8mol/L 17β_雌二醇最明显(n=6,P<0.05)。

与正常对照组比 ^P<0.05;与10%新生牛血清组比 #P<0.052.2 不同阻断剂对17β_雌二醇抑制VSMCs活性增加的影响提前用17β_雌二醇受体阻断剂他莫昔芬(10_7mol/L)孵育细胞2h,结果显示,他莫昔芬预处理可部分逆转17β_雌二醇对VSMCs增殖的抑制(n=6,P<0.05,图2)。β_MCD提前孵育2h,与17β_雌二醇孵育组比,10_5mol/L β_MCD可部分阻断17β_雌二醇抑制VSMCs增殖的作用(n=6,P<0.05)。为探讨iNOS在17β_雌二醇抑制VSMCs增殖中的作用,我们选用L_NAME提前孵育细胞,结果显示,L_NAME提前孵育后与17β_雌二醇孵育组比,细胞活性明显增高,提示,L_NAME可部分阻断17β_雌二醇抑制VSMCs增殖的作用(n=6,P<0.05)。他莫昔芬、β_MCD或L_NAME单独孵育对VSMCs增殖无影响。

图2 他莫昔芬,β_MCD,L_NAME对17β_雌二醇抑制VS_MCs活性的影响(n=6。1正常对照组 210%新生牛血清组 310%新生牛血清+17β_雌二醇组 410%新生牛血清+17β_雌二醇+他莫昔芬组 5他莫昔芬组 610%新生牛血清+17β_雌二醇+β_MCD组 7β_MCD组 810%新生牛血清+17β_雌二醇+L_NAME组 9L_NAME组)


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