1 材料与方法
1.1 动物与试剂雌性新西兰大白兔(购自中山大学实验动物中心)7只,体质量2.5~2.7kg。DMEM培养基、新生牛血清、小牛血清(Gibco公司,美国)、17β_雌二醇、胰蛋白酶、1_{4_[2_(n,n_二甲氨基)乙氧基]苯}_1,2_二苯_1_丁烯(他莫昔芬)、L_硝基_左旋精氨酸甲酯(左旋_硝基精氨酸甲酯,L_NAME)、亮肽素、抑肽酶、苯甲基磺酰氟、三羟甲基氨基甲烷、考马思亮兰(Sigma公司,美国);兔抗iNOS多克隆抗体(Abcam公司,中国),兔抗caveolin_1多克隆抗体(Fharmingen公司,美国),NO测定试剂盒(精美生物工程有限公司,中国),其它试剂为国产分析纯。
1.2 VSMCs培养
利用组织块贴壁法培养兔胸主动脉VSMCs。待细胞长满瓶底后加入质量分数2%的胰蛋白酶消化传代。用4~6代细胞进行实验。实验用VSMCs选用SABC免疫组化法α_actin抗体进行鉴定。
1.3 MTT比色法检测活细胞数量
将VSMC接种于96孔板上,用无酚红无血清DMEM培养液培养24h。在新生牛血清促增殖实验中,加入体积分数10%的新生牛血清继续培养24h。在17β_雌二醇抑制增殖实验中,加入不同浓度17β_雌二醇提前孵育24h后,再加入10%新生牛血清继续培养。每孔加入20μL MTT(5mg/mL)37℃孵育4h后,倾倒培养液,加入二甲基亚砜终止反应,酶标仪于570nm处测量吸光度。在17β_雌二醇孵育细胞之前,加入他莫昔芬(10_7mol/L),或iNOS阻断剂L_NAME(10_6mol/L),或caveolin_1蛋白阻断剂β_MCD(10_3mol/L)提前孵育2h。
1.4 免疫印迹法检测蛋白表达
培养细胞于6孔培养板中经过不同药物处理后,加入0.1mL蛋白提取液裂解细胞,收集提取液,离心后取上清液Bradford法测定蛋白质质量浓度,并进行SDS_PAGE电泳,电印迹转移至硝酸纤维素膜上,分别与一抗(兔抗iNOS多克隆抗体(稀释度1∶50),兔抗caveolin_1多克隆抗体(稀释度1∶100))和二抗孵育,与ECL试剂反应1min后,X光胶片压片曝光,用IBAS图像处理系统对胶片进行扫描测定感光区带的感光密度,并进行积分处理,以对照组为100%进行统计分析作图医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
1.5 VSMCs中NO浓度测定
采用NO测定试剂盒,比色法测定。VSMCs经影响因子处理后,取细胞培养上清液100μL,加入磷酸盐缓冲液和硝酸还原酶,37℃孵育1h,加入显色剂后530nm波长测定吸光度。NO(μmol/L)=测定管OD/标准管OD×100μmol/L。
1.6 统计学处理
数据以±s表示。用SPSS11.0统计软件,以单因素方差分析,组间比用t检验。
2 结果
2.1 不同浓度17β_雌二醇对10%新生牛血清诱导的VSMCs活性增加的影响MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法,实验中活细胞数量多少可反映细胞增殖情况。从图1可以看出,10%新生牛血清处理VSMCs 24h后,细胞活性比正常对照组的明显增加(n=6,P<0.05)。提前用10_5~10_10 mol/L的17β_雌二醇预处理VSMCs 24h,均可抑制10%新生牛血清诱导的VSMCs增殖,其作用以10_8mol/L 17β_雌二醇最明显(n=6,P<0.05)。
与正常对照组比 ^P<0.05;与10%新生牛血清组比 #P<0.052.2 不同阻断剂对17β_雌二醇抑制VSMCs活性增加的影响提前用17β_雌二醇受体阻断剂他莫昔芬(10_7mol/L)孵育细胞2h,结果显示,他莫昔芬预处理可部分逆转17β_雌二醇对VSMCs增殖的抑制(n=6,P<0.05,图2)。β_MCD提前孵育2h,与17β_雌二醇孵育组比,10_5mol/L β_MCD可部分阻断17β_雌二醇抑制VSMCs增殖的作用(n=6,P<0.05)。为探讨iNOS在17β_雌二醇抑制VSMCs增殖中的作用,我们选用L_NAME提前孵育细胞,结果显示,L_NAME提前孵育后与17β_雌二醇孵育组比,细胞活性明显增高,提示,L_NAME可部分阻断17β_雌二醇抑制VSMCs增殖的作用(n=6,P<0.05)。他莫昔芬、β_MCD或L_NAME单独孵育对VSMCs增殖无影响。
图2 他莫昔芬,β_MCD,L_NAME对17β_雌二醇抑制VS_MCs活性的影响(n=6。1正常对照组 210%新生牛血清组 310%新生牛血清+17β_雌二醇组 410%新生牛血清+17β_雌二醇+他莫昔芬组 5他莫昔芬组 610%新生牛血清+17β_雌二醇+β_MCD组 7β_MCD组 810%新生牛血清+17β_雌二醇+L_NAME组 9L_NAME组)