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与正常对照组比 ^P<0.05;与10%新生牛血清组比 #P<0.05;与17β_雌二醇+10%新生牛血清组比 ##P<0.052.3 17β_雌二醇抑制VSMCs增殖过程中caveolin_1蛋白表达情况10%新生牛血清作用24h可明显降低caveolin_1蛋白表达(n=3，P<0.05，图3、4)，提前用17β_雌二醇预处理细胞可显著增加caveolin_1蛋白表达(n=3，P<0.05)。为探讨17β_雌二醇增加caveolin_1蛋白表达抑制VSMCs增殖是否通过雌二醇受体，我们选用他莫昔芬提前孵育细胞2h，结果表明，他莫昔芬孵育组caveolin_1蛋白表达下降(n=3，P<0.05)，而他莫昔芬单独作用对VSMCs增殖无影响。图3 用Western blot检测17β_雌二醇及他莫昔芬对VSMCs中caveolin_1蛋白表达的结果(1正常对照组 210%新生牛血清组 310%新生牛血清+17β_雌二醇组 410%新生牛血清+17β_雌二醇+他莫昔芬组 5他莫昔芬组)
与正常对照组比 ^P<0.05;与10%新生牛血清组比 #P<0.05;与10%新生牛血清+17β_雌二醇组比 ##P<0.052.4 17β_雌二醇抑制VSMCs增殖过程中iNOS蛋白表达情况10%新生牛血清作用24h可明显降低iNOS蛋白表达(n=3，P<0.05，图5、6)，若提前用17β_雌二醇预处理VSMCs，可显著增加iNOS蛋白表达(n=3，P<0.05)。且β_MCD提前孵育VSMCs可抑制17β_雌二醇诱导的iNOS蛋白表达增加。图5 β_MCD对VSMCs中iNOS蛋白表达Western blot结果(1正常对照组 210%新生牛血清+17β_雌二醇+β_MCD组 3β_MCD组 410%新生牛血清组 510%新生牛血清+17β_雌二醇组)
与正常对照组比 ^P<0.05;与10%新生牛血清组比 #P<0.05;与10%新生牛血清+17β_雌二醇组比 ##P<0.052.5 17β_雌二醇对VSMCs中NO合成的影响与正常对照组比，10%新生牛血清孵育后，VSMCs中NO表达下降(n=6，P<0.05，图7)，而用17β_雌二醇提前孵育细胞可明显增加NO浓度(n=6，P<0.05)。加入L_NAME或β_MCD后，可抑制17β_雌二醇诱导的NO合成增加(n=6，P<0.05)。
3 讨论
VSMCs过度增殖和迁移以及由此引起的细胞外基质的大量合成是导致动脉粥样硬化、高血压和经皮冠状动脉内成形术术后管腔再狭窄的关键环节[1_2]。研究表明，位于VSMCs膜上caveolae结构是介导细胞内信号转导的中心，而其标志性蛋白caveolin_1可通过其脚手架结构与多种信号蛋白相连接，起着调节细胞信号转导的开关作用。VSMCs过度增殖与迁移是促进动脉粥样斑块形成的主要因素。LIN等[4]选用高脂饮食诱导动脉粥样硬化模型，结果显示：高脂饮食第5周血管内膜中caveolin_1表达达到最高峰，此后开始下降，并于动脉粥样斑块形成的第8周，其表达下降至最低;而VSMCs增殖则在第5周开始逐渐增强，并于8～12周其增殖能力最强，提示caveolin_1表达与VSMCs增殖及动脉粥样斑块形成之间存在密切关联。内皮素受体属于G蛋白偶联受体中的一员，定位于caveolae中，与caveolin_1相连，内皮素_1与其受体结合后，通过增加caveolin_1蛋白表达，增强钙通道开放，增加细胞内Ca2+浓度[5_6]，抑制VSMCs增殖。血管紧张素Ⅱ是诱导VMSCs增殖的重要刺激因子，它可以通过与其受体结合，通过调节caveolin_1，促进活性氧依赖的表皮生长因子受体转录及增加Akt活性，诱导VSMCs增殖[7]。我们的实验结果也表明，新生牛血清可通过抑制caveolin_1蛋白表达，促进VSMCs增殖;而17β_雌二醇预处理可通过增加caveolin_1表达，抑制新生牛血清诱导的VSMCs增殖医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
NO是一种内皮依赖性松弛因子，具有极强的舒张血管效应，同时还可抑制血小板聚集和血栓形成。一氧化氮合酶是NO合成的关键酶，VSMCs中主要表达iNOS。白藜芦醇是红酒中参与血管保护的重要因子，它可通过增加iNOS活性，促进NO合成与释放，抑制VSMCs增殖。研究发现，17β_雌二醇受体阻断剂ICI 182，780提前孵育可逆转此效应，提示白藜芦醇是通过与雌二醇受体结合，发挥其抑制VSMCs增殖的效应[8]。RODRGUEZ等[9]研究表明，瘦素可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的VSMCs增殖，在此过程中，磷酸化信号转导因子和转录活化因子(STAT3)及Akt蛋白表达增加，iNOS活性及NO合成增加，若用Janus激酶(JAK2)阻断剂AG490或磷脂酰肌醇(_3)激酶(PI3K)阻断剂wortmannin可显著抑制瘦素诱导的iNOS活性增加，提示，瘦素可通过激活JAK2/STAT3及PI3K/Akt信号途径，增加iNOS活性，促进NO合成，抑制血管紧张素Ⅱ诱导的VSMCs增殖。我们的研究结果同样显示，17β_雌二醇可通过增加iNOS活性及蛋白表达，促进NO合成，抑制新生牛血清诱导的VSMCs增殖。为进一步探讨17β_雌二醇抑制VSMCs增殖过程中，caveolin_1表达增加与iNOS之间的关系，我们选用β_MCD预处理，抑制caveolin_1表达，结果显示iNOS蛋白表达下降，NO合成减少。
