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1 材料和方法
1.1 主要试剂
鼠抗人TLR2 mAb(Santa Cruz公司)、IL8 ELISA检测试剂盒(R&D System公司)、Triton X-100(Bebco公司)、KC-SFM和DMEM培养基(GIBCO公司)、牛胶原酶(Roche公司)、分散酶Dispase Ⅰ(Roche公司)、鼠抗人CK(AE1/AE3)、即用型SP免疫组化试剂盒单克隆抗体、即用型DAB酶底物试剂盒(北京中山生物技术有限公司)。
1.2 角质形成细胞的原代培养
人角质形成细胞的分离、培养和鉴定参考文献[2]，具体过程如下：取儿童包皮环切术后的新鲜包皮，0.1%新洁尔灭溶液消毒，磷酸缓冲液(PBS)清洗后，剪去多余的皮下组织;标本剪成皮片后浸入1.5 U/mL 的Dispase溶液中冷消化18～24 h，分离表皮和真皮，弃皮下组织和消化液;0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液处理表皮，过滤残渣，滤液离心后收集细胞;1%胎盼蓝检测细胞活力并计数;按4×104 /cm2 的细胞密度接种，当细胞长满皿底80%左右时，所得细胞直接用于实验或继续传代;培养细胞经CK的免疫组化染色方法鉴定;所有试验取5代以内的细胞。
1.3 白念珠菌(简称白念)的培养
白念标准株(ATCC 10231，中国医学科学院皮肤病研究所真菌室友情提供)接种于37 ℃沙堡液体培养基中振荡培养，试验用对数生长期真菌;一个克隆形成单位定义为一个真菌细胞。
1.4 刺激实验
实验分为2组，A组：将细胞接种于24孔培养板内，长满皿底80%左右时，直接加入白念活菌以及白念死菌(分别是细胞数的8倍)刺激角质形成细胞。B组：每孔加入鼠抗TLR2抗体20 μg/mL，孵育1 h，PBS洗涤，再分别加入上述刺激物，与角质形成细胞孵育1、3、6、12、24 h时，取培养上清液，离心(5 000 r/min×5 min)，-20 ℃保存备用。每个相同的刺激实验做3复孔，同时设置阴性对照(添加培养基)。按照IL8 ELISA检测试剂盒说明进行操作，BIORAD酶标仪测定样品490 nm波长的OD值。
1.6 统计分析
实验数据以SPSS 10.0软件进行统计学处理，数值以(x±s)表示，两组样本采用t检验，三组及三组以上样本之间的两两比较采用ANOVA检验。
2 结果
表1 中和前后实验组与对照组IL8浓度比较注：与对照组比较，^P<0.05
如表1所示，白念活菌刺激角质形成细胞后IL8升高，3 h开始，达到(567.3±113.6) pg/mL，24 h为(1 079.9±236.6 )pg/mL，达到高峰，与对照组比较有统计学差异(P<0.01);而白念死菌刺激后，IL8仅有轻度升高，与对照组比较没有统计学差异(P>0.05)。用抗TLR2抗体中和TLR2作用后，白念死菌刺激组IL8升高不明显(P>0.05)，而白念珠菌活菌刺激组IL8仍明显升高(P<0.01)，但是TLR2抗体中和前后比较，IL8水平无统计学差异(P>0.05)医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
3 讨论
皮肤是机体防御外部环境中有害物质入侵的第一道防线。作为表皮主要结构的角质形成细胞，除了构筑防御病原微生物入侵的物理性屏障外，还通过分泌细胞因子、趋化因子和抗菌肽，向其他细胞传递信号,引起中性粒细胞、淋巴细胞的趋化;加速表皮细胞增殖，从而调节皮肤炎症和免疫反应;并对入侵表皮的病原微生物有直接的杀伤作用，防止系统感染的出现。此外，紫外线、TL1、TL8、α黑素细胞刺激素(αMSH)可以增强角质形成细胞的杀白念珠菌活性;前列腺素E2(PG E2)、血小板活化因子(plateletactivating factor，PAF)也可能与杀伤作用有关[3]。
