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应用化学药物或γ射线治疗是目前常见的肿瘤术后治疗手段。而逃避凋亡是肿瘤发生、发展和药物抵抗的重要机制[1]。如何能够增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性并诱导其凋亡就成了目前在肿瘤治疗上非常重要的研究课题之一。Survivin是人体基因组中一种重要的肿瘤特异性基因，它明显抑制肿瘤细胞凋亡并在促进癌细胞生长中起重要作用[2]。本实验通过RNA干扰技术抑制人喉癌细胞Survivin的表达,并检测干扰后肿瘤细胞HEP2对化疗药物敏感性的改变,探讨Survivin对人喉癌细胞化疗药物敏感性的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
人喉癌HEP2细胞购于上海中科院细胞所,置于10%新生小牛血清RPMI1640培养基中,内加青霉素1×105 U/mL，链霉素100 mg/mL，5%CO2、饱和湿度、37 ℃恒温培养箱内培养。
siRNA真核表达载体的构建：具有互补序列能够编码短发卡RNA(shRNA)的双链寡核苷酸模板DNA由上海康成公司合成。其转录产物所形成的siRNA的作用靶点为人Survivin mRNA 94-112位核苷酸(GeneBank NO:NM001168)。干扰序列为: TTCAAGAGA,AAGAACTCT;阴性对照是双链寡核苷酸转录产物所形成的siRNA，此序列不与任何人类基因序列同源。
1.2 实验分组及细胞转染
实验分为4组：空白对照组，未转染脂质体组(转染液中仅含脂质体无siRNA),阴性对照组(转染液加入空质粒pRNATNegative),pRNATSurvivin组(转染液加入重组pRNATSurvivin质粒)。将人喉癌HEP2细胞分4组用LipofectinTM2000(美国Invitrogene公司)介导进行转染。
RTPCR检测HEP2细胞中Survivin mRNA的表达：分别收集转染24、48、72 h细胞，使用Trizol (美国Invitrogene公司) 提取细胞总RNA,步骤按说明书。RTPCR法检测在siRNA干预下Survivin基因mRNA表达的改变。引物上游序列为：5′GGC ATGGGTGCCCCGACGTT3′;下游为：5′AGAGGCCTCAATCCATGGCA3′。以Survivin与βactin条带的积分吸光度(A)比值表示Survivin mRNA的相对含量。
1.3 Western blot检测Survivin蛋白的表达量
收集细胞，细胞裂解液处理细胞，离心后取上清，考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，聚丙烯酞胺凝胶电泳，将蛋白电转至硝酸纤维膜上，与Survivin抗体(美国SantaCruz公司)结合，之后用辣根过氧化物酶结合的二抗结合，ECL法显色后照相。最后以imageproplus 4.5图像分析系统测定各条带灰度值,以此反映Survivin蛋白的表达程度。
1.4 MTT法检测化疗药物对各组细胞的生长抑制
