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2.2 1mmol/L Lig对Glu诱导海马神经元保护作用的形态学变化 Glu作用于细胞20min，继续培养12h后显微镜下观察，发现部分细胞变圆，胞体肿胀，细胞失去原有形态，突起淡化、减少或消失。细胞内、外出现较多的黑色颗粒，贴壁不牢，折光性下降(图2)。 Lig保护组与Glu损伤组相比，神经元的胞体较完整，大部分细胞的存在少量的突起。细胞突起存在少量的联系，突起的数量较正常组减少。
2.3 AChE免疫细胞化学染色结果 镜下可见棕色颗粒为阳性反应物，免疫组化阴性对照组未见此棕色颗粒。阳性神经元呈现三角形、椭圆形或圆形，突起明显。阳性反应物主要分布在细胞胞浆中，细胞核及突起着色较淡。与正常对照组和Lig保护组相比较，Glu损伤组细胞明显浅淡(图3)。对免疫组化结果进行半定量分析，结果发现正常组细胞的平均灰度值为148.6±9.88，Glu损伤组细胞的平均灰度值为171.5±6.87，Lig保护组平均灰度值为151.0±12.37。统计分析结果表明正常组灰度值低于Glu损伤组(P<0.01)，Lig保护组灰度值低于Glu损伤组(P<0.05)，正常组和保护组之间无统计学差异(表1)。表1 Lig对Glu损伤培养海马神经元的保护作用
2.4 Lig对Glu损伤的海马神经元活性和LDH的影响 MTT法检测各组海马神经元活性(表1)。结果显示，与对照组相比，Glu损伤后细胞活性显著下降(P<0.001); Lig保护组与Glu损伤组相比细胞活性明显升高(P<0.05)。Glu损伤后12h，分别检测各孔培养上清中LDH的活力(表1)。结果显示Glu损伤可导致海马神经元LDH释放显著增加，表现为培养上清LDH活力显著增加(P<0.01)，1mmol/L 的Lig可显著抑制Glu损伤神经元LDH的释放(P<0.05)。
3 讨 论
Lig是中药川芎的有效成分，在治疗缺血性脑血管病等方面疗效肯定，而且对中枢神经系统损伤有较好的修复作用。研究表明Lig可明显抑制皮质和海马NOS阳性细胞增多，与NOS拮抗剂LNAME(10mg/kg)的作用相似;脑缺血时使用盐酸Lig注射液可显著降低细胞外兴奋性氨基酸神经递质Glu和天冬氨酸(Asp)的浓度[4]。Glu是哺乳动物脑内含量最高的兴奋性氨基酸之一。许多中枢神经系统疾病可引起Glu的过度释放,从而产生严重的神经兴奋毒性，引起神经元损伤或死亡。海马是脑内对缺血、缺氧最为敏感的部位之一。与皮层神经元相比，海马神经元易纯化而且含有高密度的Glu受体[5]。原代培养细胞比细胞株更接近生理状态的生物学特性，选用其探讨药物的作用机制具有实际意义。因此，本研究选用原代培养大鼠海马神经元，模拟体内高浓度Glu条件，研究Lig对抗Glu兴奋性毒性作用，以探讨Lig保护神经元损伤的可能机制医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
本实验结果表明，Lig可以保护Glu诱导的神经元损伤。在细胞培养过程中，Lig保护组神经元的胞体接近正常培养状态下的细胞形态，细胞贴壁情况较Glu损伤组明显改善。同时，MTT结果表明，Lig保护组细胞活性明显得到提高，降低Glu引起的神经细胞死亡率。LDH漏出率实验表明，Glu能引起神经细胞内大量LDH的释放，LDH释放率可反映细胞膜的通透性及完整性[6]，而Lig能明显降低神经细胞LDH的释放，说明Lig能很好的保护细胞膜的稳定性。乙酰胆碱是中枢神经系统一种重要的神经递质，海马内有丰富的胆碱能神经递质存在，其纤维主要来源于隔区的内侧隔核和斜角带垂直支的胆碱能神经元。胆碱酯酶(AChE)的基本作用是快速水解神经终末的乙酰胆碱，在哺乳动物皮质有AChE的表达，海马中非胆碱能神经元也有表达[78]。研究发现，在早期培养胚胎海马神经元中可大量表达AChE，随着培养时间的延长，其表达量逐渐下降。AChE对发育过程中海马Glu能神经元树突的形成至关重要[9]。本实验结果表明，Glu的细胞毒性抑制了细胞合成AChE，表现为细胞的突起减少、突起与突起之间的联系减少、相应的突触结构减少，结果影响了神经元的生长。相反，Lig明显可以对抗Glu的毒性作用，促进细胞AchE的合成，促进神经细胞的发育成熟。当然，Lig保护Glu介导的细胞毒性作用的详细机制还有待进一步研究。
