医学论文范文:人骨髓间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制
【摘要】 目的: 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)体外对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制. 方法: 从骨髓中分离培养MSCs,反复贴壁进行纯化;用尼龙棉柱法纯化异体外周血T淋巴细胞;观察MSCs对植物血凝素(PHA)刺激下T淋巴细胞增殖的影响,用ELISA方法检测IFNγ,IL4水平变化. 结果: MSCs对PHA诱导的T淋巴细胞增殖有抑制作用,并呈剂量依赖性;同时MSCs亦可抑制T淋巴细胞的IFNγ分泌,但可促进IL4的分泌. 结论: MSCs对异体外周血T淋巴细胞的增殖有抑制作用,其作用可能与其影响T淋巴细胞分泌IFNγ和IL4有关.
【关键词】 骨髓间充质干细胞;T淋巴细胞;免疫调节;干扰素γ;白细胞介素4
0引言
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是骨髓中不同于造血干细胞的另一类成体干细胞,这类细胞易于采集、分离和体外扩增,除具有高度增殖及多向分化潜能、促进机体造血重建外,还具有抑制同种异体免疫反应、减轻移植排斥等免疫调节作用,但具体机制还不清楚. 为进一步探讨MSCs的免疫调节功能,我们研究了MSCs对T淋巴细胞增殖及其分泌IFNγ与IL4的影响.
1材料和方法
1.1骨髓MSCs的分离、培养与鉴定抽取肝素抗凝的健康供者骨髓20 mL(n=10),DMEM(Gibco)倍比稀释,Ficoll分离液(天津灏洋)2000 r/min,15 min条件下分离出单个核细胞,DMEM洗涤2次,完全培养基(100 g/L胎牛血清+ DMEM)重悬细胞,以2×109/L接种于25 cm2培养瓶内,37℃,50 mL/L CO2孵箱内培养,24 h首次换液,以后每2~3 d换液1次,细胞融合度达80%时消化传代培养,流式细胞仪分析检测传至3代MSCs的纯度医.学全.在.线网站www.lindalemus.com.
1.2外周血T淋巴细胞的分离与纯度鉴定取新鲜肝素抗凝人外周血20 mL,Ficoll分离液(2000 r/min,15 min)分离出单个核细胞,尼龙棉柱法进一步分选T淋巴细胞,流式细胞仪分析尼龙棉柱分离前后T淋巴细胞的纯度.
1.3MSCs对植物血凝素(phytohemagglutinin, PHA)作用下的T淋巴细胞增殖的影响取第3代培养的MSCs,经60Co照射30 Gy,调整细胞密度,按细胞数分为3组,A组1×103个,B组1×104个,C组1×105个,每组设单独同等数量MSCs为空白对照,以单独T淋巴细胞培养为阳性对照. 以终体积100 μL/孔,加入96孔培养板内,MSCs完全贴壁后吸去上清或更换培养液,并除空白对照外各组加入T淋巴细胞1×104/孔. 经PHA 5 μg(Sigma)作用68 h后加入20 μL/孔MTT(Sigma)继续孵育4 h,弃上清后二甲基亚砜固定,酶标仪490 nm处测定A值,增殖百分率=(实验组A值-对照组A值)/实验组A值.
1.4MSCs对PHA刺激下的T淋巴细胞IFNγ,IL4分泌的影响分别用1×107/L,1×108/L MSCs与1×109/L的T淋巴细胞共培养,同时加入5 μg 的PHA. 应用IFNγ,IL4试剂盒(武汉博士德)检测各组培养上清中IFNγ和IL4浓度.
统计学处理:应用SPSS软件进行统计分析,实验结果用x±s表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用Dunnettt检验,P<0.05为有统计学差异.
2结果
2.1MSCs与T淋巴细胞纯度鉴定原代MSCs形态均匀一致,呈长梭形,流式细胞仪结果显示:传至3代MSCs高表达CD29,CD44和CD13,而CD34,CD45,HLADR低或极低表达,纯度达90%以上;异体外周血单个核细胞经尼龙棉柱分离后CD3+细胞百分比达98%以上.
2.2MSCs抑制T淋巴细胞的增殖MSCs对PHA刺激下的T淋巴细胞增殖呈抑制效应,并呈剂量依赖性. 单纯RPMI1640培养基条件下,T淋巴细胞阳性对照组的增殖率为(77.05±1.94)%,A,B,C组依次为(44.94±5.84)%,(33.45±7.00)%,(17.64±4.59)%,与阳性对照组比较均有统计学差异(P<0.05).
2.3MSCs抑制T淋巴细胞IFNγ的分泌在单纯培养条件下,T淋巴细胞在PHA刺激下其上清分泌IFNγ为(79.16±13.40)ng/L,与1×107/L,1×108/L的MSCs共培养时IFNγ的分泌分别为(25.54±7.05),(9.55±3.60)ng/L,IFNγ分泌明显减少(P<0.05).
2.4MSCs促进T淋巴细胞IL4的分泌在单纯培养条件下,T淋巴细胞在PHA刺激下其上清分泌IL4的量为(46.04±9.67)ng/L,加入1×107/L,1×108/L MSCs后,IL4的分泌增加,分别为(67.10±11.44),(97.92±19.48)ng/L,与单纯T淋巴细胞培养组比较差异具有统计学意义(P<0.05).