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雌激素活体（estroqen receptor，ER)是抗雌激素类药物内分泌治疗的靶点，也是预后的重要指标[1-4]。ER阴性或表达下调是内分泌治疗失败及预后不良的因素。约1/4乳腺癌组织无ER表达，并且原先ER阳性的乳腺癌患者在肿瘤进程中有1/3转为ER阴性[5]。有文献报道，ER阴性与基因的变异（如插入、缺失、重组或点突变等)未发现有明确的联系，而DNA甲基化是其表达失活的主要原因之一[6]。研究显示，启动子异常甲基化在许多肿瘤的发生过程中是一个频发的早期事件，因此肿瘤相关基因的甲基化状态是肿瘤发生的一个早期敏感指标，可以作为一种有前景的肿瘤分子标志物。本研究运用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)分别检测正常乳腺组织、乳腺癌组织ERα基因启动子区CpG岛的甲基化状态，分析乳腺癌ERα启动子甲基化与其蛋白表达及临床病理的关系，进一步探讨ERα启动子甲基化作为乳腺癌临床诊断和治疗的分子标志物的可能性，为肿瘤去甲基化治疗提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 标本来源 由温州医学院附属第一医院病理科提供新鲜组织标本。包括20例正常乳腺组织和44例乳腺癌组织。病理组织学分型(WHO标准)：浸润性癌33例，浸润性小叶癌伴浸润性导管癌1例，黏液腺癌3例，导管内癌5例，髓样癌2例。患者均为女性。年龄27～78岁，平均(48.7±8.9)岁。
1.2 免疫组化EnVisionTM二步法 抗ERα抗体和通用型二步法检测试剂盒均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。染色操作按照试剂盒说明书进行。以PBS代替一抗为空白对照。以试剂盒中提供的已知阳性片为阳性对照。ER阳性物质(棕黄色)位于胞核。每张切片随机选择10个高倍视野，每个视野随机观察100个细胞，计算其中阳性细胞比例(阳性细胞按染色棕褐、棕黄、浅黄分别乘以系数1、2/3、1/3来计算数目)。ER阳性细胞比例≥10%计作阳性。
1.3 DNA提取 新鲜组织标本，经蛋白酶K消化，酚、氯仿、异戊醇法提取DNA，并测定DNA浓度和含量。
1.4 DNA亚硫酸氢盐修饰 加热变性，NaHSO3修饰，透析除盐，沉淀，溶解等操作方法参见文献[7]。DNA经亚硫酸氢盐修饰后，CpG岛中的非甲基化胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)，经PCR 扩增后转变为胸腺嘧啶(T)；而CpG岛中的甲基化胞嘧啶(mC)仍保留为胞嘧啶。CpG岛以外序列中的胞嘧啶(C)均转变为尿嘧啶(U)，经PCR扩增后均为胸腺嘧啶(T)。
1.5 PCR扩增ERα基因医.学全.在.线网站www.lindalemus.com
1.5.1 引物、主要试剂和仪器：ERα基因序列号为NM_000125。各个引物序列详见参考文献[8]。均由上海生物工程公司合成。野生型引物W扩增未修饰的启动子区。非甲基化引物U、甲基化引物M分别扩增经修饰后的非甲基化和甲基化启动子区。Taq DNA聚合酶购自大连宝生物公司，PxZ型PCR扩增仪为Thermo Hybaid公司产品，BioSens SC 620型紫外凝胶分析系统为上海山富科学仪器有限公司产品。
1.5.2 PCR反应体系、反应程序及结果观察：50μL的反应体系含MgCl2 2.0 mmol/L、正向引物和反向引物0.8μmol/L、四种dNTP每种终浓度0.4 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5 U、DNA模板1μg。反应条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 30 s，退火(温度、时间详见参考文献[8])，72 ℃ 1 min，40个循环；72 ℃ 8 min延伸。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶分析系统观察拍照。
1.6 PCR产物直接测序 提供启动子A、B区非甲基化引物和甲基化引物的PCR产物，由大连宝生物技术有限公司纯化和直接测序。
1.7 统计学处理方法 率的比较采用x2检验，根据x2值计算Pearson列联系数。
