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2 结果
2.1 ERα蛋白表达情况 正常乳腺组织ERα阳性表达率为100.0%(20例/20例)。乳腺癌ERα表达的免疫组化结果见图1，ERα阳性表达率为72.7%(32例/44例)。乳腺癌较正常乳腺组织的ERα蛋白表达显著降低(P <0.05)（见表1)。
2.2 ERα基因启动子区甲基化情况 野生型引物(W)、非甲基化引物(U)和甲基化引物(M)的PCR扩增结果见图2。未修饰DNA的野生型引物(W)的PCR扩增结果，20例正常乳腺组织和44例乳腺癌组织均有扩增产物出现。正常组织、乳腺癌组织ERα启动子A、B区甲基化率(%)见表1。
随机各挑选一个修饰后DNA的A区和B区甲基化引物扩增产物，进行正向和反向直接测序。正向测序结果的后段和反向测序结果的后段（实际前段)除个别位点外均和预期序列一致，如A区甲基化引物扩增产物正向测序结果49、63位与预期序列不一致，但这两个位点的反向测序结果与预期序列一致。综合正反双向测序结果与预期甲基化序列完全一致。正向测序结果中，CpG岛处所有胞嘧啶C保留不变，CpG岛以外的所有胞嘧啶C均已转变为胸腺嘧啶T。反向测序结果中，CpG岛处对应的鸟嘌呤G保留不变，CpG岛以外的所有鸟嘌呤G均已转变为腺嘌呤A。
2.3 乳腺癌ERα基因启动子A、B区甲基化与ERα蛋白表达的关系 ERα阳性乳腺癌组、ERα阴性乳腺癌组、乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率均较正常组的显著增加(P <0.01，见表1)；ERα阴性乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率较ERα阳性乳腺癌组均显著增加(P <0.05，见表1)，乳腺癌组织ERα表达与启动子甲基化之间呈显著负相关（A区Pearson列联系数C值CA为0.6362，B区为CB 0.5870)。合并ERα启动子A、B区甲基化的实验结果，A、B区共同甲基化的乳腺癌组、A区或B区单独甲基化的乳腺癌组的ER表达率均较A、B区均未甲基化的乳腺癌组显著偏低(P <0.05)。
2.4 乳腺癌ERα基因启动子A、B区甲基化与临床病理因素的关系 乳腺肿瘤大小与ERα启动子A、B区甲基化无显著相关性(P >0.05，见表1)。淋巴结转移与ER启动子A、B区甲基化亦无显著相关性(P >0.05，见表1)。
3 讨论
DNA甲基化作为表观遗传学的一种调控机制是最早被人们发现的，它与肿瘤的发生有着密切关系。在肿瘤细胞中，异常甲基化最大的特点是全基因组的低甲基化和局部性(CpG岛)高甲基化并存[9]。最重要的甲基化碱基是胞嘧啶，通常发生在启动子区CpG岛区域。研究发现CpG岛甲基化可以抑制启动子序列的基因表达。
乳腺癌是雌激素依赖性肿瘤，其发生发展与雌激素受体ER的表达密切相关。ER α阴性乳腺癌与ERα阳性乳腺癌相比，恶性度更高，内分泌治疗不敏感，术后易复发和转移，预后较差，目前尚无有效治疗策略。乳腺癌患者ER α基因的沉默表达往往是肿瘤向恶性转化的标志。临床上ER和PR均为阳性的乳腺癌用内分泌方法治疗，其有效率高达70%～80%。ER和PR均为阴性的乳腺癌用内分泌方法治疗，其有效率不足10%，已完全脱离激素的调控[1]。研究显示原先ER阳性的乳腺癌患者在肿瘤进程中有1/3转为ER阴性，原因是由于1/3的ER阳性乳腺癌表现出ER基因CpG岛广泛的甲基化[10]。基因表达异常的原因很多，除了基因点突变外，还有基因缺失、重组及重排，但这些机制在乳腺癌细胞表达失活中的作用报道很少。提示其沉默表达与表观遗传学改变，即启动子区CpG岛的甲基化有关。现已证实ERα基因含有A、B、C三个启动子区，分别独立或协同调控ERα基因转录[11]。在乳腺癌组织中，启动子A、B区起主导作用。
