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表1 甲基化特异性PCR引物设计
引物名称引物序列，5-3产物大小(bp)ST8iaII-M forGGTTTGGGTTTATAAATGGGATAGAGATGATC305ST8iaII-M revAACAAACGCCTAACGTCGCTCGST8iaII-U forGGTTTGGGTTTATAAATGGATAGAGATGATT 313ST8iaII-U revAACTACTTAACAAACACCTAACATCACTCAST8iaIV-M forGAAGTTGGCGGATTTGGAGTTTTGGAC225ST8iaIV-M revAAACCAACCAATCACCGTACTAAAAAAACGST8iaIV-U forGTTGAAGTTGGTGGATTTGGAGTTTTGAT 230ST8iaIV-U revCAAAACCAACCAATCACCATACTAAAAAAACA1.2.6 COBRA(combined bidulfite restriction analysis)：用来进一步确定mST8SiaIV(PST)基因的甲基化。经过亚硫酸盐处理的DNA为模板，引物的设计不同于甲基化特异性的PCR，COBRA的PCR引物中不包含CpG二核苷酸，因此在扩增的步骤中模板与模板之间不会再有区别。mST8SiaIV(PST)基因的扩增体系为：mST8SiaIV(PST)35个循环，94℃30s，62℃30s，72℃30s，最后72℃延长10min。3%琼脂糖凝胶溶于1×TAE(TAE=1M Tis.HCL, 1.14ml Ammonium Acetate, 0.01M EDTA,pH8.0)电泳液，100V，30min。再用剩余的PCR产物17μl，NE buffer 2μl，BstU1限制性核酸内切酶1μl，总反应体系是20μl，反应时间1h，反应温度37℃。然后再用3%琼脂糖凝胶溶于1×TAE(TAE=1M Tis.HCL, 1.14ml Ammonium Acetate, 0.01M EDTA,pH8.0)电泳液，SYBR Gold染色，100V，30min。
1.2.6 斑点印记:用促进DNA甲基化的甲硫氨酸或者使用DNA甲基化抑制剂依赖于转录抑制的丙戊酸处理Neuron2A细胞，处理后48h，收集细胞, 用稀释的细胞裂解液将不同浓度的蛋白样本点倒在斑点印记装置上(BIORAD)的硝化纤维膜(ATTO)上，随后用溶于1×PBS 1%的脱脂奶粉封闭硝化纤维膜1h，再加入抗-聚唾液酸-神经细胞黏附分子抗体，4℃过夜。硝化纤维素膜用生物素连接的抗-鼠IgM抗体，然后用抗生素蛋白过氧化物酶混合试剂(Nacalai Tesque)法进行检测。发色反应采用ECL试剂，而且用化学发光器定量发光(BioRad)。
2 结果
2.1 甲基化特异性的PCR结果：胚胎鼠和小鼠的大脑、小脑、基底节和海马显示STX基因转录起始区没有甲基化，PST基因转录起始区在18d的胎儿鼠的所有4个区域和成年鼠的2个区域-大脑和小脑都有甲基化，所分析的4个胎儿鼠和4个成年鼠标本都显示了相似的结果。
2.2 原代培养的神经细胞和神经胶质细胞：PST基因转录起始区的甲基化是否具有细胞特异性， STX基因未发生甲基化，但是在PST基因在神经胶质细胞发现的轻微的甲基化。在小鼠神经纤维母细胞瘤细胞株-Neuron2A细胞的PST基因启动子分析中发现，启动子几乎完全被甲基化(图1、2，见封二)医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
2.3 利用Neuro2a细胞PST基因甲基化的启动子作为一种神经学方面的模型进行了进一步分析:用增加DNA甲基化的甲硫氨酸[6]，或者使用DNA甲基化抑制剂依赖于转录抑制的丙戊酸处理的Neuro2a细胞[7]，处理后48h，用斑点印记法分析了聚唾液酸的表达。发现甲硫氨酸轻微的降低聚唾液酸的表达，但是丙戊酸明显地增加了聚唾液酸的表达。结果显示，用10mM甲硫氨酸处理过的细胞，在总蛋白为0.63μg/ml时，多聚唾液酸的表达降低到大约60%。另一方面，在用10mM丙戊酸处理的细胞，总蛋白为0.63μg/ml时，多聚唾液酸的表达增加到超过200%。
2.4 COBRA:用来进一步确定mST8SiaIV(PST)基因的甲基化(图3，见封二)。
3 讨论
